中药复方调控肝干细胞分化及机制的实验研究

目的研究中药复方牛黄、西洋参（简称牛黄参）含药血清对大鼠肝干细胞系WB-F344增殖、分化的影响,探讨益气解毒法体外诱导肝干细胞分化为肝细胞的内在机制。方法采用中药血清药理学方法,以不同浓度的牛黄参含药血清（5%、10%、20%）作用于WB-F344,以正常大鼠血清（5%、10%、20%）处理的WB-F344为空白对照组,以单纯培养体系处理的WB-F344为正常对照组;噻唑兰（MTT）比色法检测不同浓度含药血清对WB-F344增殖的影响;取增殖的最佳浓度,蛋白印迹法（western blot）检测含药血清对WB-F344细胞HGFR、EGF、EGFR、TGFβ1R、TGFβ2R表达的影响;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测含药血清对WB-F344肝细胞表面标志物白蛋白（ALB）的mRNA表达的影响。结果牛黄参含药血清能促进WB-F344的增殖（P〈0.01）,且10%为增殖的最佳浓度梯度;能刺激WB-F344细胞HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1R、TGF-β2R的表达量上调（P〈0.01）;能促进WB-F344肝细胞表面标志物ALB的mRNA表达（P〈0.01）。结论牛黄参含药血清可以通过细胞因子体系对肝干细胞WB-F344的增殖、分化进行调节,为利用中药复方制剂调控肝干细胞,促进肝再生和肝损伤修复提供实验与理论基础。     

肝干细胞在肝再生中的作用

肝干细胞移植可能是治疗终末期肝病的重要途径之一,因而肝干细胞成为研究的热点.不同来源的肝干细胞具有强大的临床治疗潜能,但是在临床应用普遍推行之前,有许多研究工作需要进一步开展.本综述就肝干细胞的一些基本特性及其在肝脏损伤后的肝再生作用展开讨论.     

四逆散含药血清诱导大鼠肝脏干细胞分化及其调控机制

目的: 研究四逆散含药血清对大鼠肝脏干细胞分化的影响并探讨其治疗肝病的作用机制。方法: 采用HPLC-MS-MS法,梯度洗脱,测定血清中四逆散的有效成分;以四逆散含药血清处理WB-F344细胞后,采用CCK-8法观察细胞增殖情况,血糖仪检测细胞培养液葡萄糖含量,乳酸测定试剂盒检测细胞中乳酸含量,荧光素荧光素酶法检测ATP含量,蛋白质印迹法观察表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR)、纤维母细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor, FGFR)、转化生长因子受体(transforming growth factor beta receptor type Ⅰ, TGF-βRⅠ)、肝细胞生长因子受体(hepatocyte growth factor receptor,HGFR)蛋白表达情况。结果：在四逆散血清中,检测到以原型入血芍药苷、橙皮苷等成分,并检测到橙皮素葡萄糖醛酸等部分代谢物。各浓度含药血清作用WB-F344细胞48 h后,对细胞均无毒性作用,10%含药血清显示出较好的促进细胞增殖的效果。随着药物血清作用时间的延长,WB-F344细胞葡萄糖消耗量、乳酸生成量降低,ATP生成增加,EGFR、FGFR、TGF-βRⅠ、HGFR蛋白表达水平上升。结论：四逆散含药血清能够促进肝脏干细胞WB-F344的增殖并诱导其分化,分化机制可能与影响数种细胞因子受体的表达有关。     

细胞因子在肝纤维化中的作用

细胞因子在肝纤维化中的作用泸州医学院附属医院传染科邓存良综述泸州医学院附属医院传染科余光开审校重庆医科大学病毒性肝炎研究所陈国民中图分类号Ｒ３６１．２肝纤维化是各种慢性肝病的共同的病理基础，其核心是细胞外基质（ＥＣＭ）异常沉积。ＥＣＭ沉积增多与异常的...     

细胞因子在肝纤维化中的作用

肝纤维化的形成是一缓慢而复杂杂的过程。不论何种致病因素,其机制都是肝脏受到外界刺激引起免疫反应下,细胞因子－细胞－细胞外基质相互作用,最终使基质沉积于肝脏［１］。近年细胞因子的研究备受重视,并取得了较多进展。１转化生长因子β（ＴＧＦβ）它是双硫键联结...     

胰岛素在肝星状细胞增殖中的作用

胰岛素作为一种多功能的激素类蛋白 ,不仅能调节机体的代谢 ,也促使体外细胞的分裂和增殖[1] 。肝星状细胞(ｈｅｐａｔｉｃｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌ,ＨＳＣ)作为肝间质细胞及肝纤维化的启动细胞 ,受到刺激后产生大量的细胞外基质 ,最终导致肝纤维化[2 ] 。因此 ,研究影响ＨＳＣ增殖的因素及其作用 ,将有助于阐明肝纤维化发病机理。本研究旨在了解胰岛素对ＨＳＣ的生长、增殖作用。一、材料与方法参照Ｆｒｉｅｄｍａｎ等分离ＨＳＣ的方法[3 ] ,采用Ⅳ型胶原酶和链酶蛋白酶循环消化分离ＨＳＣ ,结蛋白 (ｄｅｓｍｉｎ)抗体免疫细胞化学鉴定。…     

细胞因子信号转导抑制因子在内毒素耐受大鼠肝组织中的作用

目的 研究内毒素耐受(endotoxin tolerance,ETT)及正常大鼠接受D-胺基半乳糖(D-galactosamine,D-GaiN)/脂多糖(lipopolysacharide,LPS)刺激后肝组织细胞因子信号转导抑制因子(SOCSs)基因表达的异同,探讨内毒素耐受的可能机制.方法 雄性SD大鼠随机分为急性肝功能衰竭模型组(acute liver failure,ALF组)和内毒素耐受组(ETT组).ETT组及ALF组先分别以0.1mg/kg LPS和生理盐水腹腔注射,每日1次,连续5次,于LPS或生理盐水第5次注射24 h后同时腹腔注射D-GaIN 800 ms/kg和LPS 8μg/只,分别在注射D-GaIN/LPS前(0 h)和注射后2.6、12、24和48 h 6个时间点留取大鼠血及肝脏标本.HE染色及透射电镜下观察肝组织病理及超微结构变化;RT-PCR法检测动物肝组织中SOCS1和SOCS3 mRNA表达;采用鲎试剂基质显色法测定血清内毒素水平,ELISA法检测TNF-α水平.结果 ETT组大鼠肝组织病理改变及超微结构变化明显轻于ALF组,其血清内毒素、TNF-α水平明显低于ALF组.内毒素:6 h组分别为1.11±0.38和0.74±0.22,24h组分别为1.12±0.24和0.86±0.21,均P<0.05,12 h组分别为1.88±0.35和0.62±0.16,48 h组分别为1.10±0.13和0.84±0.19,均P<0.01.TNF-α:6 h组分别为86.9±12.6和70.0±12.8,P<0.05,12 h组分别为77.0±18.1和48.8 ±12.8,24 h组分别为63.8±9.2和39.1±5.7,48 h组分别为53.2±8.3和38.2±9.9,均P<0.01.ALF组大鼠肝组织SOCS1和SOCS3 mRNA表达均明显上调,造模后2 h即明显高于对照组,分别于12 h、6 h达峰值,ETT组的SOCS1和SOCS3 mRNA表达较模型组明显上升.SOCS1:6 h组分别为0.955±0.186和1.349±0.390,48 h组分别为0.766±0.145和0.970±0.205,均P<0.05,2 h组分别为0.554±0.164和0.841±0.175,12 h组分别为1.130±0.181和1.888±0.573,24 h组分别为0.990±0.212和1.550±0.439,均P<0.01.SOCS3:6h组分别为0.914±0.054和1.039±0.109,12 h组分别为0.781±0.044和0.863±0.063,均P<0.05,2 h组分别为0.681±0.139和0.898±0.058,24 h组分别为0.700±0.065和0.811±0.055,均P<0.01.结论 内毒素耐受时,大剂量的D-GalN和LPS腹腔注射引起的肝脏损害减轻,内毒素、TNF-α释放减少,可能与肝组织SOCS1、SOCS3的高表达有关.     

肝干细胞及相关因子在肝再生过程中作用的研究进展

导致肝脏损伤的疾病很多,如病毒性肝炎、肝硬化等疾病都会导致肝细胞的病变甚至坏死。因此,如何对损伤后的肝脏进行修复已成为人们关注的内容。肝脏具有强大的再生能力,近年来,在肝部分切除或化学性损伤动物模型中,研究人员对肝脏生长发育的调控机制进行了大量的研究。作者主要就参与肝再生过程的各种肝干细胞以及促进肝干细胞生长的细胞因子作一介绍。     

SF2523对人源脑胶质瘤干细胞TS576增殖的抑制作用及其机制

目的：探讨PI3K和BRD4双重抑制剂SF2523对人源脑胶质瘤干细胞TS576增殖的抑制作用,并初步阐明其作用机制。方法：培养人源脑胶质瘤干细胞TS576,将其分为对照组和0.25、0.50、1.00、2.00 μmol·L^-1 SF2523组。采用CCK-8法检测各组TS576细胞存活率;将TS576细胞分为对照组和2 μmol·L^-1 SF2523组,利用细胞生长计数法检测各组TS576细胞数;将TS576细胞分为对照组和1及2 μmol·L^-1 SF2523组,采用流式细胞术检测各组不同细胞周期TS576细胞百分比;将TS576细胞分为对照组和1及2 μmol·L^-1 SF2523组,利用Annexin Ⅴ/PI染色法检测各组TS576细胞凋亡率;将TS576细胞分为对照组和1及2 μmol·L^-1 SF2523组,采用Western blotting法检测各组TS576细胞中B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）和cyclinD1蛋白表达水平。结果：CCK-8检测,作用24、48和72 h时,与对照组比较,0.25、0.50、1.00和2.00 μmol·L^-1 SF2523组TS576细胞存活率均明显降低（P<0.01）。细胞生长计数法检测,与对照组比较,2 μmol·L^-1 SF2523组细胞数明显减少（P<0.05或P<0.01）。流式细胞术检测,作用72 h时,与对照组比较,1和2 μmol·L^-1 SF2523组G₁期TS576细胞百分比升高（P<0.05）,S期TS576细胞百分比降低（P<0.05）。Annexin Ⅴ/PI染色检测,作用72 h时,与对照组比较,1和2 μmol·L^-1 SF2523组细胞凋亡率均明显升高（P<0.01）。Western blotting法检测,作用72 h时,与对照组比较,1和2 μmol·L^-1SF2523组TS576细胞中Bax蛋白表达水平升高（P<0.01）,Bcl-2和cyclinD1蛋白表达水平降低（P<0.05或P<0.01）,Bax/Bcl-2比值升高（P<0.01）。结论：SF2523通过下调cyclinD1表达引起TS576细胞G₁期阻滞,通过上调Bax表达、下调Bcl-2表达促进TS576细胞凋亡,从而抑制TS576细胞增殖。     

肝细胞生长因子对c-kit+Lin-细胞的增殖作用

目的 探讨在无血清无基质的条件下,肝细胞生长因子(HGF)和因子组合对扩增c-kit Lin-细胞的影响.方法 采用免疫磁珠法分离小鼠骨髓c-kit Lin-细胞,研究在干细胞因子(SCF),FLt-3配基(FL),促血小板生成素(TPO)和白血病抑制因子(LIF)组合中添加不同浓度的HGF培养7 d,检测细胞总数,c-kit Lin-细胞扩增倍数及细胞凋亡率.结果 各因子组均可显著扩增c-kit Lin-细胞,扩增倍数2～8倍不等.其中,10ng/ml HGF组扩增c-kit Lin-细胞效果最为显著.为8.00倍,细胞总数扩增45.43倍,细胞凋亡率为17.42%.但随剂量加大,虽然细胞总数上升,c-kit Lin-细胞扩增反而下降.40 ng/ml组细胞总数扩增80.50倍,c-kit Lin-细胞扩增效果不明显,仅为2.87倍,细胞凋亡率最低.为5.91%.结论 10 ng/ml的HGF能协同SCF FL TPO LIF扩增c-kit Lin-细胞,使细胞凋亡率降低,其表型并不受影响,但过高剂量会诱导其分化.     

SCF/c-Kit反应轴调控ADSCs在糖尿病创面修复中的作用研究

探讨干细胞因子（SCF）/ 干细胞因子受体（c-Kit）信号调节脂肪间充质干细胞（ADSCs）增殖、迁移的作用机制,及其在糖尿病创面愈合中的作用。方法分离培养ADSCs。将其分为ADSCs 组、ADSCs+SCF（4 ng/ml,24 h）组和ADSCs+SCF+c-Kit siRNA（4 ng/ml,24 h）组;利用Western blot检测c-Kit、p-AKT、AKT蛋白的表达;采用CCK-8、细胞克隆形成检测增殖情况;采用Transwell法检测迁移情况。采用链脲佐菌素腹腔注射复制糖尿病小鼠模型,并复制背部直径为2cm 的全层皮肤缺损模型。将6 只糖尿病裸鼠随机分为实验组和对照组,对照组小鼠于创面周围以皮内注射方式注射1×106个未处理的ADSCs,实验组小鼠注射等量的经SCF（4 ng/ml）预处理24 h后的ADSCs。10 d后处死各组裸鼠,计算创面愈合率,苏木精- 伊红染色法检测真皮层与表皮层间的厚度,比较两组的差异。结果SCF 诱导c-Kit的表达呈时间、浓度依赖性（p <0.05）。SCF促进ADSCs的增殖、迁移,c-Kit siRNA抑制ADSCs的增殖、迁移（p <0.05）。SCF促进p-AKT的表达,c-Kit siRNA抑制c-Kit、p-AKT 的表达。实验组糖尿病裸鼠创面愈合率更高,真皮层与表皮层厚度大（p <0.05）。结论SCF/c-Kit 反应轴激活PI3K/AKT 信号通路,促进ADSCs 增殖、迁移。SCF 预处理能够促进糖尿病裸鼠创面愈合。     

黄芪多糖对体外培养骨髓间充质干细胞增殖和干细胞因子表达的刺激作用

 目的 探讨黄芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)体外对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖的影响及干细胞因子(stem cell factor,SCF)表达的刺激作用。方法 采用MTT法检测APS刺激72 h后SD大鼠MSCs增殖情况;RT PCR检测增殖过程中不同细胞因子mRNA的表达;real time PCR定量检测SCF mRNA的表达;Western blot检测SCF蛋白的表达;ELISA法检测培养上清液中SCF的含量。结果 与空白对照组相比,1、2、3 mg/mL APS组均具有促进MSCs增殖的作用,以1 mg/mL促增殖作用最为明显(P<0.01)。与空白血清组相比,10% APS含药血清具有明显促增殖作用(P<0.05),且明显促进SCF mRNA表达及可溶性SCF蛋白的分泌(P<0.05)。1 mg/mL APS明显促进SCF mRNA和SCF蛋白表达(P<0.05)。结论 APS促进MSCs增殖,可能与其促进MSCs表达SCF mRNA及SCF蛋白有关。     

Role of Stem Cell Factor and Its Receptor in the Pathogenesis of Pediatric Aplastic Anemia

Aplastic anemia (AA) is characterized by mul tilineage bone marrow failure and pancytopenia.Differentiation of hematopoietic cells is governedby a number of cytokines and their receptors, inwhich stem cell factor (SCF) and its receptor (c kit) play an important role in regulating primaryhematopoietic stem cell and progenitor cellgrowth. To date, the relationship between SCF/c kit and the pathogenesis of pediatric AA has notbeen reported in C…     

右美托咪定减轻皮质酮抑制神经干细胞的增殖作用及机制

目的：探讨右美托咪定（DEX）减轻皮质酮（CORT）抑制神经干细胞（NSCs）的增殖作用及其可能的作用机制。方法：取孕15 d SD大鼠,分离胎鼠大脑皮质培养原代NSCs,进行NSCs标志蛋白神经上皮干细胞蛋白（Nestin）和胚胎干细胞关键蛋白（SOX2）染色鉴定;RT-PCR法检测肾上腺α-2受体各亚型α-2A受体、α-2B受体及α-2C受体在NSCs上的表达;将NSCs分为Control组、DMSO组、CORT组（CORT 1 μmol/L孵育24 h）和DEX组（DEX 0.01、0.1、1 μmol/L预处理1 h后,再加入CORT继续孵育24 h）。LDH法检测NSCs的细胞毒性;EdU法检测细胞增殖能力;Western blot检测NSCs GSK-3β/β-catenin通路GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin和Cyclin D1表达水平。结果：分离的原代细胞经Nestin蛋白和SOX2蛋白染色鉴定NSCs的纯度超过97%;RT-PCR结果显示肾上腺α-2受体的3种亚型在NSCs上均有表达;LDH法显示各组之间LDH的释放量差异无统计学意义。EdU法显示与Control组比,CORT组的NSCs增殖能力显著被抑制（P＜0.05）;与CORT组相比,当DEX剂量增加至1 μmol/L时,NSCs的增殖能力有所恢复（P＜0.05）。Western blot结果表明与Control组、DMSO组比,CORT组p-GSK-3β、β-catenin、Cyclin D1蛋白的相对表达量显著下降（P＜0.05）,与CORT组比,1 μmol/L DEX预处理后,p-GSK-3β、β-catenin、Cyclin D1蛋白的相对表达量有所提升（P＜0.05）,Total GSK-3β蛋白在各组间的相对表达量没有明显变化;PI3K磷酸化抑制剂LY294002拮抗DEX对NSCs增殖的保护作用（P＜0.05）。结论：DEX可以减轻CORT抑制NSCs的增殖作用,其机制与GSK-3β/β-catenin信号通路有关。     

Cloning of the Eukaryotic Expression Vector with Nerve Growth Factor in Rats and Its Effects on Proliferation and Differentiation of Mesencephal Neural Stem Cells of Fetal Rats

The eukaryotic expression vector containing full-length cDNA sequence of rate nerve growth factor （NGF） β subunit was constructed and its effects on proliferation and differentiation of neural stem cells were observed. By using PCR, full-length cDNA sequence of NGF β subunit in rats was cloned and ligated into the eukaryotic expression vector pEGFP-N1-NGF. The recombinant plasmid pEGFP-N1-NGF was transfected into the mesencephal neural stem cells of embryonic rats by Lipofectamin and transiently expressed. MTT method was used to determine the effects of NGF on proliferation of neural stem cells, and under phase-contrast microscopy, the effects of NGF on growth of nervous processes following differentiation of neural stem cells were observed. Sequence analysis indicated that the cloned full-length cDNA sequence of rat NGF β was identical to that of published sequence encoding NGF in gene GeneBank. The transfection of recombinant plasmid pEGFP-N1-NGF into mesencephal neural stem cells of embryonic rats could obviously promote proliferation of neural stem cells and faciliate the growth of neural stem cells-derived nerve cells. It was suggested that neural stem cells could be used as a vehicle of gene transfer, and the expression of NGF β subunit in the neural stem cells could promote the growth of nerve cells derived from neural stem cells.     

MicroRNA-29b 对肝纤维化及肝星状细胞 增殖、凋亡的影响

目的 探究microRNA-29b（miR-29b）在肝纤维化过程中的作用,以及对肝星状细胞增殖和 凋亡的影响。方法 将大鼠随机分为对照组和模型组,每组10 只。模型组大鼠经腹部注射60% 3 ml/kg CCl4 复制肝纤维化模型;对照组注射等量生理盐水。分别观察两组大鼠肝纤维化情况,检测肝组织中miR -29b 、 TGF -β 1、SAMD 3 基因及TGF-β1、SAMD3 蛋白的表达。体外培养肝星状细胞HSC-T6、LX-2,转染 miR-29b siRNA,检测miR-29b 对HSC-T6、LX-2 细胞增殖、凋亡的影响,以及对TGF-β1、SAMD3 表 达的影响。结果 与对照组相比,模型组心肌纤维比例增加,随着时间延长,第6 和12 周心肌纤维比例逐渐 升高（P <0.05）。与对照组相比,模型组miR -29b 基因相对表达量降低,随着时间延长,模型组miR -29b 基 因相对表达量逐渐降低（P <0.05）。与对照组相比,模型组TGF-β1、SAMD3 基因和蛋白相对表达量升高; 随着时间延长,TGF-β1、SAMD3 基因和蛋白相对表达量逐渐升高（P <0.05）。在HSC-T6、LX-2 细胞中, miR-29b 转染组G1 期细胞比例高于空白对照组、阴性转染组,S 期细胞比例低于空白对照组、阴性转染组 （P <0.05）。miR-29b 转染组HSC-T6、LX-2 细胞凋亡率高于空白对照组、阴性转染组（P <0.05）。与空白 对照组、阴性转染组相比,HSC-T6、LX-2 细胞中TGF-β1、SAMD3 基因和蛋白相对表达量升高,miR- 29b 基因相对表达量降低（P <0.05）。结论 miR-29b 在肝纤维化过程中表达降低,miR-29b 可抑制肝星状 细胞增殖,诱导其凋亡。     

兔骨髓基质干细胞的分离、扩增和生物学特性检测

目的探讨密度梯度离心法分离培养兔骨髓基质干细胞(MSCs)的条件,为组织工程选择合适的种子细胞奠定基础。方法采用密度梯度离心法将兔MSCs自少量骨髓中分离并培养,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线,测定贴壁率。结果兔MSCs性状稳定,生长曲线相似,第5-6天细胞数目最多;传代后10 h贴壁率高达90%。结论密度梯度离心法是分离兔MSCs的理想方法,MSCs能为未来组织工程提供足量种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞在淋巴细胞增殖中的免疫调节作用

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BM MSCs)在体外对淋巴细胞增殖的影响及其作用机制。方法:分离和鉴定大鼠MSCs,与淋巴细胞、BRL、刀豆蛋白(ConA)建立共培养体系,混合培养0h、24h和48h后,用ELISA方法检测上清中TNF-α、TGF-β和IL-10的分泌量,MTT方法检测淋巴细胞数目变化,流式细胞仪检测调节T细胞(Treg)的含量变化。结果:加入MSCs后TNF-α分泌量降低,TGF-β和IL-10分泌量升高,OD值明显低于未加MSCs组的对照组(P<0.05),Treg含量升高。结论:骨髓MSCs在单独存在以及与BRL同时存在时均对淋巴细胞的增殖具有抑制作用,并且作用程度随时间变化不明显,其中IL-10、TGF-β以及Treg参与了这种免疫抑制过程。