喉癌来源的MAGE-A3基因真核表达载体及其稳定表达模型的构建和鉴定

目的：克隆人黑色素瘤相关抗原MAGE—A3基因,构建真核表达载体,检测、鉴定其在细胞中的表达。方法：MAGE-A3基因进行PCR扩增,凝胶回收PCR产物片段并连接至pMDl8一T载体。测序后将MAGE—A3基因片段亚克隆至真核表达载体,构建成plRES2-EGFP／MAGE—A3重组质粒。经脂质体转染至293T细胞株后,荧光定量PCR、Western-blotting法鉴定MAGE—A3基因的表达。结果：MAGE-A3基因正确克隆在plRES2-EGFP／MAGE-A3,测序结果与GenBank公布的MAGE—A3序列一致。转染293T细胞后能检测到MAGE-A3基因和蛋白的表达。结论：成功构建plRES2-EGFP／MAGE—A3真核表达质粒,并能在293T细胞中有效表达MAGE—A3蛋白,奠定了其作为DNA疫苗应用的基础。     

真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建

目的：构建含MAGE—1基因的重组真核表达质粒。方法：用RT—PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列，克隆至pGEM—T载体，测序证实基因碱基序列无误后，再克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )，构建了pcDNA3.1—MAGE—1重组质粒。结果与结论：RT—PCR获得长度为927bp的阳性产物，经T载体和pcDNA3.1( )真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后。证实真核表达质粒pcDNA3．1—MAGE—1构建成功。     

MAGE-A1、MAGE-A3基因在人舌鳞癌中的表达及其临床意义

目的从mRNA水平观察肿瘤特异性抗原MAGE（黑色素瘤抗原基因）-A1及MAGE-A3基因在人舌鳞癌组织中的表达情况，以评价MAGE-A1、MAGE-A3基因作为舌鳞癌的免疫学检测、免疫和基因治疗的分子标志物的可行性。方法提取38例舌鳞癌、10例牙龈瘤病变组织和10例癌旁口腔正常组织标本中的总RNA，逆转录合成cDNA，而后应用RT-PCR法扩增其中的MAGE-A1，MAGE-A3日的基因片段，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（G3PDH）基因作为内对照，经琼脂糖电泳确认。分别采用Mann-Whitney Test榆验和Fisher’s Exact Test检验对舌鳞癌不同病理分型、淋巴结转移与否的MAGE-A1，MAGE-A3的表达差异进行统计学分析。结果在38例舌鳞癌中MAGE-A1基因表达23例（60．5％）；MAGE-A3基因表达26例（68．4％）；两者均有表达13例（34．2％）。MAGE-A1和／或MAGE—A3基因表达共36例（94．7％），MAGE-A1、MAGE-A3基因均不表达2例（5．3％）。低分化鳞癌患者两种基因同时表达的阳性率（53.3％）明显高于高分化者（9．1％）。在10例牙龈瘤和10例癌旁正常组织中未见MAGE-A1、MAGE-A3基因表达。结论舌鳞癌组织中MAGE—A1，MAGE—A3基因均有较高表达。提示MAGE基因可以作为检测舌鳞癌的分子标志物，且具有免疫、基因治疗特异性靶位的潜在价值。     

人黑色素瘤抗原MAGE-A10的基因克隆及原核表达

目的:扩增和克隆人黑色素瘤抗原MAGE-A10(melanoma antigen A10)cDNA,构建原核表达载体并在大肠杆菌表达. 方法:从人黑色素瘤细胞系LiBr中提取总RNA,用RT-PCR从中扩增出MAGE-A10 cDNA,插入载体pMD18-T中. 测序正确后,克隆至原核表达载体pGEX-4T-3中,构建重组表达载体pGEX-4T-3-MAGE-A10,转化大肠杆菌BL21株进行表达. 经IPTG诱导表达,谷胱甘肽亲和层析获得重组目的蛋白. 结果:成功获得MAGE-A10编码基因并构建原核表达载体,测序结果与GenBank收录序列相一致. 可以获得部分可溶性的原核重组蛋白,经亲和层析和分析,证实融合蛋白占总量的58.9%. SDS-PAGE分析其相对分子质量(Mr)为67 000,Western blot证实为目的蛋白. 结论:成功获得MAGE-A10 cDNA,构建得原核表达载体并获得高效表达. 本研究为制备MAGE-A10 mAb及研究MAGE-A10可能参与肿瘤发生发展的机制奠定了基础.     

以黑色素瘤抗原基因mRNA为特异标记检测乳腺癌患者外周血肿瘤细胞

目的：以黑色素瘤抗原-A1(MAGE-A1)和MAGE-A3基因mRNA为特异性标记物，检测乳腺癌患者外周血中的肿瘤细胞，并探讨其临床意义。方法：采集40例乳腺癌患者及20例非肿瘤患者的外周血，用巢式RT-PCR方法检测外周血单核细胞(PBMC)中MAGE—A1和MAGE-A3基因mRNA。同时用RT-PCR方法检测乳腺癌患者肿瘤组织中上述MAGE基因的表达。结果：12．5％(5／40)和17．5％(7／40)乳腺癌患者的PBMC中可分别检测到MAGE-A1和MAGE-A3基因的mRNA，而相应乳腺癌组织中MAGE-A1和MAGE—A3的表达率分别为15．0％(6／40)和22．5％(9／40)，在25．0％(10／40)的乳腺癌患者PBMC中至少可检测到一种MAGE基因mRNA，癌旁组织、乳腺癌组织中不表达MAGE基因的患者以及20例非肿瘤疾病患者的PBMC中均未测出MAGE基因mRNA。乳腺癌患者PBMC中两种MAGE基因mRNA的检出率与肿瘤TNM分期密切相关。结论：MAGE-A1和MAGE-A3基因mRNA可作为特异性肿瘤标记物用于检测乳腺癌患者PBMC中的乳腺癌细胞，巢式RT-PCR的敏感性及特异性较高，其检测结果可能有助于判断乳腺癌患者的预后。     

甲状腺球蛋白抗原决定簇基因的克隆及原核表达载体的构建

目的：扩增甲状腺球蛋白抗原决定簇基因，构建可转化人大肠杆菌的重组表达载体。方法：用TRIzol一步法从甲状腺组织中提取总RNA，RT—PCR逆转录出cDNA，PCR扩增出目的基因，与pET102／D—TOPO载体进行拓扑克隆．对重组质粒进行PCR、酶切及测序鉴定。结果：甲状腺球蛋白抗原决定簇基因及其重组表达载体经鉴定准确无误。结论：成功构建了带有目的基因的原核表达载体。     

MAGE-A3在肝癌组织中的表达和意义

目的　检测黑色素瘤抗原-A3(MAGE-A3)在肝癌组织中的表达,为应用MAGE-A3抗原对肝癌患者进行特异性抗肿瘤免疫治疗及判断预后提供理论依据。方法　逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)检测31例肝癌组织及相应癌旁组织中MAGE-A3基因的表达, 应用组织芯片技术、免疫组织化学方法分析178例肝癌组织及相应癌旁组织中MAGE-A3抗原表达 结果　31例肝癌组织标本中有23例(74.19%)表达MAGE-A3基因,而相应的癌旁组织MAGE-A3基因均不表达。178例肝癌组织中102例表达MAGE-A3抗原(57.30%)，相应的癌旁组织MAGE-A3抗原均不表达。MAGE-A3蛋白表达与肿瘤转移有关（P＜0.05，而与HBsAg、AFP水平和分化程度均无关（P＞0.05）。 结论 MAGE-A3基因在肝癌组织中有较高表达,这使得以该基因编码蛋白作为肿瘤疫苗用于肝癌的免疫治疗成为可能。表达MAGE-A3的肝癌患者预后较差。 【关键词】　MAGE-A3 肝细胞癌 逆转录－聚合酶链反应 组织芯片 免疫组织化     

黑色素瘤抗原基因在乳腺癌中的表达及临床意义

目的：研究乳腺癌组织中黑色素瘤抗原基因（MAGE）的表达情况，并探讨其临床意义。方法：采用荧光定量逆转录多聚酶链反应（fqRT-PCR）检测55例乳腺癌组织中MAGE基因的表达情况。结果：55例乳腺癌组织中有17例（30．9％）表达MAGE-0A1或／和MAGE-A3，9例（16．4％）MAGE-A1阳性，13例（23．6％）MAGE-A3阳性。结论：MAGE基因在乳腺癌中较高表达，推测MAGE抗原可以作为乳腺癌治疗的靶点。     

乙型肝炎病毒X基因cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的为研究HBVX基因（HBx）与原发性肝细胞癌发生的关系，克隆HBx的cDNA并构建HBx真核表达载体。方法 利用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）方法从HepG2．2．15细胞中扩增出HBx的cDNA，克隆到质粒PCDNA3．1中。结果RT—PCR扩增出约460bp片段，经酶切鉴定显示HBx的cDNA真核表达载体（HBx—PCDNA3．1）构建成功，测序结果显示HBx的cDNA与已发表的的序列相同。结论成功地构建了HBx的真核表达载体HBx—PCDNA3．1。     

抗人肝细胞癌单链抗体基因的构建和表达

目的：构建抗人肝细胞癌单链抗体基因，并在大肠杆菌中表达．方法：采用RT-PCR法扩增抗体重链和轻链可变区基因，用(Gly4Ser)，肽段连接VH基因和VL基因，构建克隆载体，将测序完全正确的ScFv基因克隆到分泌性表达载体pCANTAB 5E中诱导表达转化的TG1和HB2151细胞．用SDS-PAGE和免疫组化方法分析检测表达产物．结果：DNA测序证实ScFv基因结构正确，可在大肠杆菌中成功表达，游离ScFv相对分子质量大约为30ku，与HC-108，HepG-2和SMMC-7721肝癌细胞有特异性的结合反应．结论：重组制备的抗人HCD78分子单链抗体在人肝癌的基础和临床研究中具有潜在的应用价值．     

沙眼衣原体ompA基因克隆及其在真核细胞中的表达

目的克隆D型沙眼衣原体(Ct)ompA基因,构建真核表达重组质粒,转染真核细胞,为核酸疫苗的研制作准备.方法用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段,重组入pUCm-T克隆载体.将pUCm-T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,进行序列分析和酶切鉴定后,运用脂质体将重组体pcDNA3.1/ompA转染HeLa细胞,免疫组化法观察目的的基因的表达.结果从D型Ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段;序列测定证实与GenBank登陆的D型Ct一致;重组质粒pcDNA3.1/ompA在HeLa中获得表达.结论Ct ompA基因能够在体外真核细胞表达,为进一步研究Ct致病机制及DNA疫苗的研究提供理论依据.     

穿梭质粒pZH32的构建

以pS189、pSV_2gpt、pMCi5为材料,构建了以EB病毒为基础,以酪氨酸tRNA琥珀突变校正基因SupF为靶基因,以黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因Eco gpt为选择标记基因的穿梭质粒pZH32。pZH32长9.4kb,克服了以SV40为基础的穿梭质粒自发突变率高以及宿主范围局限的缺点。SupF基因遗传背景清楚,长度126bp,便于进行序列分析。gpt基因使转化克隆的筛选更加方便。有利于建立一种化学诱变剂的分子检测系统,研究基因突变的类型和突变机制。     

Ｌｉｍｓ Ｅ：一个新的ＬＩＭ同源域基因的克隆和初步分析

目的:克隆与分析小鼠不同剪切的Lims基因.方法:应用巢式RT-PCR,以小鼠cDNA为模板,扩增Lims基因不同剪切子,构入PinPointTM Xa-1T质粒,测序鉴定.结果:测序表明克隆了新的Lims基因变异剪切体Lims E,该变异剪切体编码区为1 164 bp.编码387个氨基酸.结论:比较基因组学分析显示,成功地克隆了一新的小鼠Liras基因剪切子Lims E,为进一步研究Lims基因在细胞发育中的功能打下了基础.     

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因，ｐｌ６基因为目的基因，将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游，构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６，并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。该表达载体的构建成功为开展ｐｌ６转基因动物模型的建立及其特性研究奠定了基础     

哺乳动物性别决定基因的研究进展

目的了解哺乳动物性别决定基因的作用与功能。方法查阅本领域国内外文献并进行综述。结果SRY、SOX9、WT1、SF1、AMH及DAX1等基因都参与哺乳动物性别决定。结论性别决定基因的研究对性分化与发育异常等临床疾病的诊断和治疗具有十分重要的意义。     

人B7-1/Sart3融合基因的克隆和表达

目的：构建人共刺激分子CD80(B7-1)、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(Sart3)融合基因真核表达载体，并分别在原核和人成纤维细胞中表达。方法：采用RT-PCR技术，从人胎盘组织抽提的总RNA中克隆Sart3基因的部分cDNA序列(第1～1281bp)．此段序列包括已报道的能诱导HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞的抗原表位。然后将不含终止密码子的B7-1 cDNA和Sart3 cDNA共克隆入真核表达载体pEGFP-N1，测定核苷酸序列确定重组成功后，分别转染大肠杆菌和人成纤维细胞，利用流式细胞仪和Western blot检测B7和Sart3的表达。结果：构建人B7、Sart3融合基因真核表达载体B7sart3／pEGFPN。测序结果与GenBank的B7、Sart3相应序列(NM_005191、NM_014706)一致．阅读框无改变。流式细胞仪测定发现在转染的人成纤维细胞表面有明显的荧光增强．免疫印迹发现融合蛋白可以与抗B7抗体反应，融合蛋白分子量与B7-Sart3-EGFP的预测分子量相当。结论：成功构建真核表达载体B7Sart3／pEGFPN，并在人成纤维细胞中表达。为下一步研究将SART3蛋白作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤的生物治疗打下基础。     

肿瘤特异性报告基因载体的构建

目的：将构建一种能在肿瘤组织中进行肿瘤行异性表达的逆转录病毒载体，增强肿瘤基因治疗的靶向性。方法：PCR法获得HER2基因的启动子片段并将其克隆至逆转录病毒载体P^LXSN中，再将突变型绿色荧光蛋白（mtGFP)基因克隆至该启动子下游。结果：质粒P^LHSN经EcoR I和BamH I酶切后可切出510bp和5.8kb两条片段；质粒P^LHGSN经BamH I酶切可切出520bp和6.7kb两条片段。结论：成功构建了携带HER2基因启动子和mtGFP报告基因的逆转录病毒载体。     

Rh(-)献血者128例基因分型

目的：探讨Rh(-)献血者RhD基因分型的临床意义。方法：采用PCR－－SSP技术检测郑州市128例Rh（－）献血者的RhD基因结构，用氯仿／三氯甲烷法放散检测D^u检测，结果：RhD基因多态性存在3种基本形式，其中外显子完整存在32例（25．00％），全部为D^u型，完全缺失85例（66．41％），部分缺失11例（8．59％），其中2例为D^u型。结论：RhD基因的丰富多态性对于确保输血安全具有指导意义。     

PTEN基因真核荧光表达载体的构建及其在喉癌细胞株

目的: 构建人PTEN基因的真核荧光表达载体并在Hep-2喉癌细胞中高效表达,阐明PTEN基因在喉癌细胞株中的抑癌效果并为喉癌的基因治疗奠定基础。方法: 从人喉黏膜组织中提取总RNA,经逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）得到PTEN全基因。克隆入PGEM-T easy载体上,经过PCR和酶切鉴定为阳性的克隆,进行测序分析。将所获得的基因定向克隆入Pegfp-C1载体中构建PTEN真核荧光表达载体,并将其转入Hep-2细胞中进行表达,Western blotting检测其表达。结果: 反转录PCR扩增后的产物,在约1 400 bp处可观察到特异性条带,序列分析表明与GenBank中的PTEN基因序列相同。PCI-PTEN真核载体转染Hep-2细胞后的Western Blotting表明表达产物与抗人PTEN单克隆抗体有特异性免疫反应。结论：成功构建出PTEN真核荧光表达载体,诱导产生蛋白经检测证实为PTEN蛋白。     

裸DNA骨骼肌注射表达外源基因条件的初步研究

目的观察裸ＤＮＡ直接骨骼肌注入表达外源基因的条件。方法以真核表达质粒为载体将报告基因β－ｇａｌ导入骨骼肌细胞,冰冻切片后Ｘ－ｇａｌ染色检测β－ｇａｌ基因表达水平。结果所测质粒ＤＮＡ溶剂类型中,生理盐水最有利于β－ｇａｌ表达;表达水平与注射ＤＮＡ的含量呈剂量依赖性;注射体积对表达影响不明显。结论ＤＮＡ溶液中的溶质成份影响外源基因在肌肉中的表达,优选这些成份可进一步提高肌注后基因表达水平。