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相似文献
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1.
Zheng JX  Guan SH  Xu Q  Tang Y  Liu JZ  Lü XT 《中华医学杂志》2010,90(46):3294-3299
目的 探讨Napsin A基因转染至Ⅱ型肺泡上皮细胞对肺纤维化的作用和机制.方法 采用慢病毒载体质粒PLJM1构建重组质粒PLJM1-Napsin A,将Napsin A基因转染至Ⅱ型肺泡上皮细胞系细胞-A549细胞染色体中并鉴定.予转化生长因子β1(TGF-β1)刺激A549细胞构建体外肺纤维化模型,倒置显微镜下动态观察细胞形态学的变化;用MTT法检测A549细胞转基因前后受TGF-β1刺激情况下增殖能力的变化,并绘制生长曲线;分别用RT-PCR和Western印迹方法检测未转基因和转基因A549细胞被TGF-β1干预后其表达E钙蛋白和纤维连接蛋白基因和蛋白水平的变化,以判断其发生上皮-间质转化(EMT)的情况;用Western印迹方法检测A549细胞转基因前后表达黏着斑激酶(FAK)蛋白量的变化,探讨Napsin A干预肺纤维化的机制.结果 重组质粒PLJM1-Napsin A测序结果与设计序列完全符合,转Napsin A基因A549细胞表达Napsin A基因和蛋白均显著高于非转基因细胞组(P<0.01).细胞经TGF-β1刺激后形态上演变为间质细胞,提示体外构建肺纤维化模型成功.MTT法检测转基因细胞在TGF-β1诱导下其增殖速度减慢(P<0.05);E钙蛋白的基因和蛋白表达水平在体外肺纤维化模型中明显下调(E钙蛋白mRNA:A549-PLJM1:0.77±0.09,A549-PLJM1-Napsin A:0.79±0.03,A549+TGF-β1:0.41±0.05,A549-PLJM1+TGF-β1:0.40±0.05;E钙蛋白分别为:0. 76±0.06,0.73±0.09,0.20±0.05,0. 22±0.03,P<0.01),相反纤维连接蛋白则明显上调(P<0.01),但转染Napsin A基因后其变化幅度减小(P<0.01,P<0.05).体外肺纤维化模型中,细胞FAK蛋白表达量增多(A549:0.49±0.04,A549-PLJM1:0.50±0.06;A549-PLJM1-NapsinA:0.48±0.08;A549+TGF-β1:3.49±0.61;A549-PLJMI+TGF-β1:3.54±0.25,P<0.01),但转基因细胞上调趋势显著小于未转基因细胞组(P<0.01).结论 转染Napsin A基因至Ⅱ型肺泡上皮细胞可以抑制肺纤维化,其作用机制可能与抑制整合素信号传导通路有关.  相似文献   

2.
目的研究lncRNA SIL与肺纤维化过程中肺泡上皮细胞的增殖和迁移之间的关系。方法利用RNA fish研究在转化生长因子(TGF-β1)诱导肺泡上皮细胞向间质细胞转化的过程中lncRNA SIL的表达变化,构建lncRNA SIL真核表达载体,转染A549细胞后,通过RT-PCR、MTT、Western blot、细胞损伤修复以及免疫荧光实验检测过表达lncRNA SIL对细胞A549增殖和迁移的作用以及对相关标志蛋白表达的影响。结果当使用TGF-β1诱导48 h后,细胞中lncRNA SIL的表达量与对照组相比降低;在A549细胞中过表达lncRNA SIL时,细胞增殖能力、迁移能力以及细胞增殖相关蛋白PCNA和Ki67的表达与对照组相比均降低;对细胞标志蛋白的表达分析结果显示,与对照组比,转染lncRNA SIL组,间质细胞标志蛋白α-SMA和Collagen-1表达降低,肺泡上皮细胞标志蛋白E.cad表达升高。结论 LncRNA SIL可以通过抑制A549细胞的增殖和迁移达到抑制肺泡上皮细胞向间质细胞转化的作用。  相似文献   

3.
TGF-β1诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转变   总被引:7,自引:0,他引:7  
目的 检测转化生长因子(TGF-β1)能否在体外诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞-间质细胞转变(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及其相应的信号转导机制.方法 在体外培养的大鼠肺泡Ⅱ型细胞(RLE-6TN)中加入TGF-β1后,于不同时间段收取细胞,分别采用Real-time PCR及Western blot检测上皮及间质细胞标志物表达的改变;Western blot检测TGF-β1对RLE-6TN细胞p-Smad 2/3表达的影响;TGF-β1诱导的RLE-6TN细胞形态学的改变采用倒置相差显微镜观察,超微结构的改变采用透射电子显微镜观察.结果 加入TGF-β1到RLE-6TN细胞后,其间质细胞标志物表达上调,上皮细胞标志物的表达下调;加入TGF-β1到RLE-6TN细胞后,其p-Smad 2/3的表达明显上调;形态学上,TGF-β1诱导RLE-6TN细胞向成肌纤维细胞样细胞转变;超微结构上,TGF-β1诱导RLE-6TN细胞特有的嗜锇性板层小体发生变性、肿胀并随TGF-β1作用时间延长最终完全消失.结论 TGF-β1能在体外诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转变,其机制部分与Smad信号转导途径相关.  相似文献   

4.
目的:观察重组人转化生长因子-β1(rhTGF-β1)对人肺上皮细胞株(A549)的转化作用。方法:将体外培养的A549用不同浓度的rhTGF-β1干预后,倒置显微镜观察细胞形态学的变化,用MTT法检测rhTGF-β1对A549增殖的影响。48 h收集蛋白用蛋白质印迹和间接免疫化学方法检测间充质细胞表型Fibronectin-EDA(Fn-EDA)表达变化。结果:rhTGF-β1诱导A549向间充质细胞形态转化,在体外对A549增殖无明显影响,上调间充质细胞表型Fn-EDA表达。结论:rhTGF-β1可诱导A549发生上皮细胞-间质转化(ephethlial-mesenchymal transition,EMT),支持肺上皮细胞发生EMT的观点。  相似文献   

5.
目的:探讨解整合素-金属蛋白酶17(a disintegrin and metalloproteinase-17,ADAM 17)过表达和抑制在转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)介导的A549细胞上皮向间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)过程中的作用,以进一步揭示肺纤维化的机制。方法将A549细胞分为空白对照组、TGF-β1组、PMA(ADAM 17激活剂)组和TNF484(ADAM 17抑制剂)组。各组细胞培养36 h后,应用倒置相差显微镜观察各组细胞形态,Real-time PCR和Western blotting分别检测ADAM 17、上皮及间质细胞标记物在mRNA和蛋白水平上的表达情况。结果镜下观察发现未诱导的A549细胞呈鹅卵石形态,排列比较紧密;经TGF-β1诱导后,细胞形态伸长,出现伪足,排列较松散,细胞与细胞之间的紧密连接消失。Real-time PCR和Western blotting检测结果均显示ADAM 17在PMA组高表达,而在TNF484组低表达,差异有统计学意义;上皮细胞标记物E-cadherin在空白对照组和TNF484组高表达,间质细胞标记物Vimentin在TGF-β1组和PMA组高表达,差异同样有统计学意义。结论 ADAM 17的过表达有助于TGF-β1介导的A549细胞EMT进程,提示ADAM 17可作为肺纤维化的标记物之一。  相似文献   

6.
目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)对Ⅱ型肺泡上皮-间充质转化的作用及与胞外调节激酶1/2(ERK1/2)信号系统的关系。方法体外培养人Ⅱ型肺泡上皮细胞来源的A549细胞,分为阴性对照组和TGF-β1处理组(0.05、0.5、5、10μg/L,作用时间48 h)。免疫荧光及Western blot方法检测各组细胞E钙粘素(E-cad)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vim)和纤维连接蛋白(Fn)的表达。在TGF-β1作用不同时间,采用Western blot及RT-PCR方法检测各组细胞α-SMA、E-cad、Vim、Fn、ERK1/2和p-ERK1/2的表达。结果与阴性对照组比较,TGF-β1组(5μg/L)α-SMA、Vim、Fn蛋白表达显著升高,而E-cad表达显著降低(P〈0.05)。作用6 h后,TGF-β1组出现α-SMA mRNA表达显著升高,E-cad显著下降(P〈0.05)。作用48 h后,TGF-β1组出现Vim、Fn蛋白表达显著升高,E-cad显著下降(P〈0.01)。作用30 min后,TGF-β1组ERK/2磷酸化水平显著升高(P〈0.05)。结论 TGF-β1可在体外以浓度和时间依赖方式的诱导A549细胞发生上皮-间充质转化,其机制可能与上调ERK1/2信号转导通路有关。  相似文献   

7.
《陕西医学杂志》2016,(11):1441-1444
目的:探讨氧化苦参碱(Oxy)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导肺泡上皮细胞间质转化的干预作用,期望为肺纤维化治疗提供新的候选药物。方法:选用0.25、0.5、1mg/ml氧化苦参碱预处理A549细胞30min后,再给与(5ng/ml)TGF-β1共孵育培养48h,MTT法检测细胞增殖变化,光镜下观察细胞形态变化,Western blot检测TGF-β1下游信号分子Smad2/3磷酸化变化和EMT标志分子E-candherin、N-cadherin和Vimentin表达变化。结果:氧化苦参碱能有效干预TGF-β1诱导A549细胞细胞增殖、细胞形态变化,抑制TGF-β1介导的Smad2/3磷酸化和E-candherin表达下调、N-cadherin和Vimentin表达上升。结论:氧化苦参碱能有效抑制TGF-β1诱导A549细胞上皮-间质转化,氧化苦参碱可以作为抗肺纤维化治疗的候选药物。  相似文献   

8.
目的:研究肝细胞生长因子(HGF)对转化生长因子β1(TGFβ-1)诱导肺泡上皮细胞转分化的影响。方法:应用TGF-β1诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞转分化。将人肺腺癌A549细胞株培养液分为4组:①对照组;②HGF组;③TGFβ-1组;④HGF+TGFβ-1组,应用倒置相差显微镜观察细胞形态变化;免疫细胞化学方法检测肌成纤维细胞特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、肺泡上皮细胞特异性标志物肺泡表面活性蛋白A(SP-A)的表达。结果:①TGF-β1组肺泡上皮细胞从原来典型的上皮细胞形态转变为长梭形肌成纤维细胞样形态。②TGF-β1组的细胞α-SMA的表达明显增加,SP-A的表达明显减低。③HGF组的细胞形态学、α-SMA、SP-A的表达与对照组无明显差异。④HGF+TGFβ-1组,多数细胞保持原来肺泡上皮细胞的形态,α-SMA表达明显低于TGFβ-1组、SP-A表达明显高于TGFβ-1组。结论:HGF能够在一定程度上负性调控TGFβ-1诱导的肺泡上皮细胞的转分化。  相似文献   

9.
目的:探讨TGFβ1-Smad信号通路在IL-33诱导的A549细胞上皮间质转化中的作用。方法:体外培养人肺泡上皮细胞来源的A549细胞株,将传代培养的细胞分为对照组、TGFβ受体抑制剂(LY2109761)组、IL-33组、IL-33+TGFβ受体抑制剂(LY2109761)组。给予相应处理,24h后收集各处理组细胞。RT-PCR和Western blot检测转化生长因子β1(TGFβ1)、上皮细胞标志物E钙黏素(E-cad)和间质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平。Western-blot检测Smad信号通路Smad3、p-Smad3的表达水平。结果:与对照组比较,TGFβ受体抑制剂组Smad3蛋白,p-Smad3蛋白,TGFβ1、E-cad、α-SMA的mRNA及蛋白表达表达水平均未见明显变化(P>0.05);与对照组比较,IL-33组Smad3蛋白表达水平无明显变化(P>0.05),但p-Smad3蛋白表达水平明显升高(P<0.05),TGFβ1mRNA及蛋白表达明显升高(P<0.05),E-cad mRNA及蛋白表达明显降低(P<0.05),α-SMA mRNA及蛋白表达明显升高(P<0.05);IL-33+TGFβ受体抑制剂组与IL-33组比较,Smad3蛋白表达水平无明显变化(P>0.05),但p-Smad3蛋白表达水平明显降低(P<0.05),TGFβ1的mRNA及蛋白表达未见明显改变(P>0.05),E-cad的mRNA及蛋白表达明显升高(P<0.05),α-SMA的mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:TGFβ1-Smad信号通路参与IL-33诱导的A549细胞上皮间质转化。  相似文献   

10.
目的观察重组人转化生长因子-β1(rhTGF-β1)诱导人肺上皮细胞(A549)E-Cad蛋白表达的变化。方法将体外培养的A549用不同浓度的rhTGF-β1干预,48h后收集蛋白用Westerblot和间接免疫荧光方法检测上皮细胞表型E-钙黏蛋白(E-Cad)表达的变化。结果rhTGF-β1诱导A549下调上皮细胞表型E-Cad表达,并呈浓度依赖性。结论rhTGF-β1可诱导A549细胞E-Cad表达下调,支持在肺上皮细胞发生上皮细胞-间质转化(EMT)的观点。  相似文献   

11.
目的探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对实验性小鼠肝脏细胞发生上皮-间质转换(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)的促进作用,进而加速肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)的形成。方法建立小鼠CCl4诱导HF模型,随机分为正常对照组、HF组与TGF-β1处理组。取对数生长期肝细胞,0.25%胰蛋白酶液消化细胞,0.4%FBS/DMEM同步化处理24 h后,按TGF-β1 2.5、5、7.5 ng/ml作用24、96、144 h分组给予相应处理,相差显微镜观察细胞形态,免疫细胞组织化学及免疫荧光方法对细胞表型进行鉴定。RT-PCR及Western blot检测EMT[成纤维细胞特异性蛋白-1(fibroblast specific protein-1,FSP-1),α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA),E-钙黏附素(E-cadherin,E-cad)]mRNA及蛋白表达情况。结果将含有TGF-β1无血清培养基刺激原代小鼠肝细胞48 h后可见较多肝细胞死亡,细胞数量减少,形态由多边形向梭形转变,96 h后小鼠肝细胞内出现凋亡小体,活细胞数量较少且大多数呈现间质细胞梭形形态。5 ng/ml的TGF-β1作用肝细胞96 h后,小鼠肝上皮细胞标志(E-cad)mRNA及蛋白表达逐渐减低,肝间质细胞标志(FSP-1和α-SMA)mRNA及蛋白表达逐渐升高(P〈0.05)。结论 5 ng/ml的TGF-β1作用于HF的小鼠肝细胞96 h后,肝细胞发生EMT现象,TGF-β1有促进实验小鼠肝细胞的迁移、侵袭能力及细胞凋亡的作用,进而发生EMT导致HF。  相似文献   

12.
目的 观察骨形成蛋白-7(BMP-7)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人近端肾小管上皮细胞(HK-2)向间充质细胞转分化(EMT)及表达结缔组织生长因子(CTGF)的影响,探讨其抑制、逆转肾间质纤维化的可能机制.方法 将体外培养的HK-2细胞分为对照组,3 ng/ml TGF-β1组,TGF-β1同时加不同浓度BMP-7(100~400 ng/ml)组.相差显微镜观察细胞形态改变;间接免疫荧光测定E-cadherin的表达;RT-PCR和Western印迹分别检测α-SMA、E-cadherin、CTGF mRNA和蛋白的表达.结果 3 ng/ml TGF-β1刺激48 h后,HK-2细胞由立方形铺路石样转变为梭形长条样;去除TGF-β1,再加入200 ng/ml BMP-7干预48 h,可见到大部分细胞逆转回原来的形态.免疫荧光显示,E-cadherin蛋白在正常HK-2细胞质膜高表达;3 ng/ml TGF-β1刺激后,E-cadherin表达明显减弱;去除TGF-β1,再加入200 ng/ml BMP-7干预后,E-cadherin表达重新恢复.RT-PCR及Western印迹显示,3 ng/mlTGF-β1刺激48 h后,α-SMA mRNA及蛋白表达明显上调、E-cadherin mRNA及蛋白表达明显减少,同时CTGF mRNA及蛋白表达明显增加(P<0.01);BMP-7与TGF-β1共同刺激48 h后,BMP-7呈剂量依赖性抑制TGF-β1诱导下α-SMA mRNA及蛋白的表达,并逐渐恢复E-cadherin mRNA及蛋白的表达,同时下调CTGF mRNA及蛋白的表达,400 ng/ml BMP-7组与TGF-β1组相比差异有统计学意义(P<0.01).结论 BMP-7能阻断并逆转TGF-β1诱导的EMT,下调CTGF的表达,这可能是其逆转肾间质纤维化的重要作用机制.  相似文献   

13.
目的:基于TGF-β/smad信号通路探讨七方胃痛颗粒对人胃腺癌AGS-EMT细胞ZEB2、E-cad及Vimentin的影响及可能的机制。方法:用TGF-β1处理AGS细胞建立上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)模型,将细胞分为空白组、七方胃痛颗粒(含药血清+EMT模型)组、LY2109761(TGF-β/Smad抑制剂+EMT模型)组,用RT-PCR、Western Blot法检测ZEB2、E-cad及Vimentin的表达。结果:与空白组比较,七方胃痛颗粒及LY2109761干预后能上调E-cad蛋白及其mRNA的表达,下调ZEB2蛋白及其mRNA和Vimentin蛋白及其mRNA的表达(P<0.05),并呈时间依赖性。与七方胃痛颗粒组相比,LY2109761组ZEB2蛋白及其mRNA的表达明显下调(P<0.05)。结论:七方胃痛颗粒与LY2109761作用相似,其可能是通过抑制TGF-β1/Smad信号通路,上调E-cad表达,下调ZEB2及Vimentin表达,抑制EMT形成,从而抑制人胃腺癌AGS细胞的上皮-间质转化。  相似文献   

14.
目的探讨转化生长因子-β1(tansforming growth factor-β1,TGF-β1)在特发性肺间质纤维化(idiopathicpulmonary fibrosis,IPF)中上皮-间充质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition,EM T)的作用和机制。方法选择临床-影像-病理诊断的IPF患者25例肺石蜡组织制作组织芯片,应用免疫组化方法检测病灶组织中TGF-β1和β连环蛋白(β-catenin),间质标记物α-SMA、Desmin、Vim和上皮标记物E-cadherin及CK7的分布及表达情况。结果 TGF-β1主要分布于肌纤维母细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞和巨噬细胞,且其在成纤维细胞灶(fibroblast foci,FF)区域内各种细胞中的表达明显高于无FF区域(P<0.01);与无FF区域相比,β-catenin和E-cadherin在有FF区域增生的Ⅱ型肺泡上皮细胞膜表达明显减弱(P<0.01),而胞浆的表达明显增加(P<0.01);同时发现有FF区域Ⅱ型肺泡上皮细胞表达间质标记物Vim,但未发现α-SMA的表达,而无FF区域两者均无表达。结论 TGF-β1和β-catenin有可能通过相互交叉作用诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞发生EMT,从而参与肺间质纤维化的发生。  相似文献   

15.
目的探讨小鼠肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)时,肝细胞发生的上皮-间质转换(epithelial-mesenchymal transitions, EMT)的变化。方法建立小鼠CCl4诱导HF模型,随机分为模型组与正常对照组,每周2次,分别于第2、4、6、8、10、12周分批处死大鼠。用密度梯度离心和贴壁培养相结合的方法分离培养小鼠肝细胞,免疫荧光方法对细胞表型进行鉴定,采用H.E及Massion染色等观察E-钙粘附素(E-cadherin,E-cad)、成纤维细胞特异性蛋白-1( fibroblast specific protein-1, FSP-1 )、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscleactin,α-SMA)的表达。用免疫荧光显微镜及激光共聚焦定位分析观察EMT蛋白[FSP-1、白蛋白(albumin)、α-SMA、波形蛋白(vimentin,VM)、胶原I(collagen I)、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、N-钙粘附素(N-cadherin,N-cad)、E-cad]表达情况。结果小鼠HF时,肝细胞存在EMT现象。H-E、Massion染色及免疫荧光均显示,随着HF的程度加重,小鼠肝上皮细胞标志(E-cad、Albumin)逐渐减低,肝间质细胞标志(N-cad、FSP-1、VM、Collagen I、FN及α-SMA)逐渐升高(P〈0.05)。结论实验性小鼠HF的进程中,肝细胞发生EMT现象。  相似文献   

16.
目的探讨Wnt信号通路对实验性小鼠肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)的促进作用。方法建立小鼠CCl4诱导HF模型,随机分为正常对照组、HF模型组与Wnt处理组。体内实验对小鼠腹腔注射Wnt3A与Wnt11各5 ng/ml,每周2次,4周后获得肝组织;体外实验Wnt处理组为正常小鼠肝细胞在含有Wnt 5 ng/ml无血清培养基培养2周后,RT-PCR法检测肝细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、E-钙黏附素(E-cadherin,E-cad)、Wnt3A,Wnt5A与Wnt11。免疫荧光显微镜及激光共聚焦定位法分析肝细胞形态学变化。对培养细胞进行诱导分化,Massion染色法观察。结果体内试验HF小鼠肝细胞Wnt3A与Wnt11的免疫荧光分析及Massion染色显示,经Wnt3A与Wnt11处理后的小鼠肝上皮细胞标志(E-cad)减低,肝间质细胞标志(α-SMA)升高(P〈0.05),发生了上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)。体外试验HF小鼠肝细胞RT-PCR分析表明:HF组与Wnt处理组与正常对照组比较α-SMA、Wnt3A、Wnt5A、Wnt11表达明显增加,E-cad表达明显减少(P〈0.05)。病理学支持Wnt处理组显示了类似HF的小鼠肝细胞发生EMT的形态学改变。结论研究表明Wnt信号通路参与了小鼠HF的过程,其机制可能是在实验性小鼠肝上皮细胞中通过下调内源的某些自分泌信号抑制因子,而诱导细胞启动EMT程序,从而导致HF。  相似文献   

17.
目的探讨丹参酮ⅡA磺酸钠对TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞纤溶酶原激活物抑制因子1(PAI-1)表达的影响,为防治肾间质纤维化提供有效的途径。方法人近曲小管上皮细胞株(HKC-8),予TGF-β1(2ug/mL)刺激48h,同时给予丹参酮ⅡA磺酸钠(终浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL)进行干预,采用RT-PCR、western blot等方法检测PAI-1的表达。结果与对照组比较,TGF-β1明显上调PAI-1mRNA及蛋白的表达(P〈0.01),丹参酮ⅡA磺酸钠以浓度依赖方式抑制TGF-β1介导的PAI-1上调(P〈0.05)。结论丹参酮ⅡA磺酸钠能逆转TGF-β1诱导的人肾小管上皮PAI-1的表达,因而具有防治肾间质纤维化的作用。  相似文献   

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