人表皮细胞在三种无血清培养基中的生长与增殖

对人原代表皮细胞在无血清培养基 A、B和 C中的生长过程进行动态观察 ,并于培养第 5 d用 MTT法和3H- Td R掺入法分别测定其生长和代谢情况。结果表明 :人原代表皮细胞在无血清培养基 A中生长 (OD值 :0 .6 38± 0 .0 33)和代谢 (COM:92 8± 46 .6 9)优于无血清培养基 B(OD值 :0 .5± 0 .0 37,CPM:740 .11± 43.2 9) ,差异有极显著意义 (MTT法 :P<0 .0 1,3H - Td R掺入法 :P<0 .0 1)。在无血清培养基 B中人原代表皮细胞在培养第 12 d仍未汇合联接成片 ;而在无血清培养基 C中细胞的生长增殖与无血清培养基 A相似 (P>0 .0 5 ) ,细胞在这二种培养基中于培养第 12 d均可汇合联接成片。     

表达vWF蛋白的重组BHK细胞的无血清培养

采用HADAMARD统计设计方法建立了适于重组BHK细胞培养和vWF蛋白表达的无血清培养基SFMA。用SFMA进行重组BHK细胞的批培养，细胞生长明显优于有血清培养(DMEM FBS(φPRS=0．05))和无血清培养基SFM-Ⅱ的培养，最大细胞密度可分别提高16．7％和40%。同时，在培养的96h，蛋白的表达水平比有血清培养提高了18．7%，SFMA维持培养48h的vWF蛋白的表达水平比SFM-Ⅱ提高了50％。     

杂交瘤细胞的无血清低蛋白培养

实现了杂交瘤细胞的体外无血清低蛋白培养。考察了血清浓度、基础培养基和接种密度对细胞生长的影响。在含5%血清培养基、1%血清培养基和无血清低蛋白培养基中适应生长的细胞,μ分别为0.68、0.45、0.44d-1,qGlc分别为13.4×10-9、13.1×10-9、19.2×10-9mmol/(cell·分别为39.4×10-9、44.1×10-9、37.7×10-9mg/(cell·d),YMAb/Xv分别为52.6×10-9、d),qMAb57.8×10-9、54.4×10-9mg/cell,YLac/Glc分别为2.0、1.95、2.0mmol/mmol。无血清培养中葡萄糖代谢途径不变,参与细胞维持代谢的葡萄糖比例增大。血清浓度降低,延迟期变长,最大活细胞密度下降。基础培养基影响细胞的最大活细胞密度,不影响生长速率。无血清培养基中细胞的接种密度选择在0.2×106～0.3×106cells/mL。     

无血清培养基培养人皮片表皮细胞的组织化学和超微结构的…

用无血清培养基培养人表皮细胞获得成功地并对培养皮片的人表皮细胞进行了组织化学和超微结构的观察。结果表明无血清培养基能促进表皮细胞的生长，增殖和分化。     

脐带间充质干细胞无血清培养体系的筛选

目的：筛选培养脐带间充质干细胞的无血清培养基。方法：采集新生儿脐带标本,将脐带剪成组织碎块,随机分为A组、B组、C组,分别加入MesenCult、Ultraculture和AM-V 3种不同的无血清培养基进行培养。观察3组脐带原代细胞游出时间和细胞形态,检测细胞的增殖能力、分化能力和表面抗原的表达。结果：A组、B组、C组原代细胞从组织块长出的平均时间分别是17 d、6 d、7 d。显微镜下观察可见,从组织块游出的细胞散在分布,呈短梭形或多角形,形态饱满,折光性好,生长融合时A组和B组细胞呈旋涡状生长,细胞折光性好,大小均一,C组细胞细长,折光性稍差,无明显的旋涡状生长的特征。3组均表达CD105、CD90、CD73抗原,不表达CD34、CD45、HLA-DR抗原;3组各标志物的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。3组间充质干细胞均具有向成脂细胞、成骨细胞分化的能力,C组分化能力弱于A组和B组。结论：B组培养体系用时较短,干细胞特性保持较好,价格适宜,可以作为大规模培养人间充质干细胞的首选培养基。     

人皮肤角质形成细胞的胰蛋白酶消化分离及无血清培养

目的 探索用DMEM—SF培养基对经胰蛋白酶两步消化分离的人角质形成细胞进行培养的方法和条件。方法 取临床整形外科手术后剩余皮肤，用0．25％的胰蛋白酶经冷和温两步消化分离后，用DMEM—SF、完全培养基于5％CO2、37℃培养，绘制生长曲线，并用单克隆抗角蛋白抗体和鼠—IgG免疫组化试剂盒进行细胞鉴定。结果 用胰蛋白酶两步消化分离的角质形成细胞在：DMEM—SF、培养基中可正常生长2周以上，生长曲线显示细胞在第4天进入对数生长期，第10天进入停滞期。鉴定显示角质形成细胞占95％以上。来源于3个不同个体的皮肤角质形成细胞经等量混合后培养与单独培养相比，细胞生长无统计学差异。结论 用胰蛋白酶对人皮肤进行冷和温两步消化分离的角质形成细胞，在DMEM—SF完全培养基中生长状况良好，其他细胞污染少，实验成本低廉，操作简单。     

无或低血清条件下高压培养促进平滑肌细胞和内皮细胞生长

目的观察高压培养对无或低血清条件下平滑肌细胞和内皮细胞生长的影响。方法用无或0.5%血清培养基,在高于1个标准大气压（标准大气压设定为0 mmHg）30-180 mmHg压力下培养人脐静脉内皮细胞和大鼠血管平滑肌细胞。用台盼蓝染色细胞计数法和MTT评价细胞的生长情况。结果在低血清条件下,高压培养的血管内皮细胞生长速度明显快于标准大气压培养的血管内皮细胞,细胞计数和MTT结果显示高压培养比大气压培养细胞生长增加约30%。无血清大气压培养平滑肌细胞2天后,未见明显的活细胞,而高压培养大鼠平滑肌细胞仍能保持生长。结论无或低血清条件下,高压培养能保持血管平滑肌和血管内皮细胞的生长。     

人皮肤角质形成细胞的分离与原代无血清培养

目的：建立一种体外人皮肤角质形成细胞分离与原代培养的方法。方法：采用两步消化法对皮肤进行消化，获取角质形成细胞进行体外无血清培养基培养，进行细胞形态学观察、免疫组织化学、透射电镜鉴定及生长曲线的绘制与分析。结果：该方法可获取较多高纯度的角质形成细胞，且在体外可快速稳定增殖。结论：两步消化法和体外无血清培养是一种理想的皮肤角质形成细胞分离培养的方法。     

人外周血来源的成熟树突状细胞的体外无血清培养

目的探讨无血清条件下健康人外周血单个核细胞（PBMC）快速诱导生成成熟树突状细胞（dendritic cell,DC）的体外培养方法。方法分离获取健康者外周血PBMC,将细胞分为血清组和无血清组：设血清组A组为对照组,B、C、D组为无血清组。A组加入10%FCS的RPMI1640完全培养液,B组加入单核/巨噬细胞无血清培养液MΦ-SFM,两组均加入rhGM-CSF＋IL-4＋rhTNF-α培养9d;C组加入钙离子载体（CI）A23187,D组加入rhGM-CSF＋A23187,两组细胞均培养于MΦ-SFM中48h。于倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞术分析细胞表型,MTT比色法检测各组细胞刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果在无血清条件下,单独给予A23187或A23187＋rhGM-CSF联合刺激48h,均可诱导PBMC分化成具有典型形态的DC;与血清组细胞相比,细胞表面标志CD80、CD86和CD83分子具有相似的高表达（P〉0.05）,对同种异体T淋巴细胞的刺激能力无显著性差异（P〉0.05）。结论在无血清培养条件下配合使用钙离子载体A23187,可以更快速、有效地诱导健康人PBMC分化成更成熟、功能更强的DC。     

谷氨酰胺限制对rCHO细胞生长和代谢的影响

考察了rCHO细胞(Ch inese ham ster ovary,中国仓鼠卵巢细胞)在批培养和谷氨酰胺限制流加培养过程中的生长、代谢特性。实验发现随着谷氨酰胺浓度的下降,谷氨酰胺的比消耗速率以及氨和丙氨酸的比生成速率显著下降。与批培养相比,在谷氨酰胺限制流加培养过程中,培养时间延长,活细胞密度增加,达到2.4×106cells/mL;谷氨酰胺的代谢途径发生改变,代谢副产物生成明显减少,YAmm/G ln由1.04 mm o l/mm o l略微下降到0.92 mm o l/mm o l,YA la/G ln由0.35 mm o l/mm o l下降到0.08 mm o l/mm o l,YX/G ln由0.383×109cells/mm o l增加至0.504×109cells/mm o l,YAmm/X由2.59×1-0 9mm o l/cell下降到1.85×1-0 9mm o l/cell,表明谷氨酰胺代谢的能量利用率显著提高,也证明其参与细胞合成代谢的分率增加。     

氨基酸对中华仓鼠卵巢（CHO）细胞在无血清培养基中的作用

研究了１５种氨基酸对中华仓鼠卵巢细胞在无血清培养基中的作用。实验表明，添加的精氨酸，亮氨酸，脯氨酸及蛋氨酸对细胞生长有明显的促进作用；而高浓度的丝氨酸，色氨酸则对细胞生长有明显的抑制作用；其它几种氨基酸在细胞不同生长时期所起的作用为不同。     

新生猕猴肝脏上皮前体细胞无血清培养体系的建立

目的建立猕猴肝上皮前体细胞的无血清体外培养体系。方法取健康新生猕猴肝脏,剪切、消化、离心后在胶原培养体系中用含Ca^2＋的培养基培养,选取多角形细胞集落,在不同胞外基质中分离培养,应用细胞免疫荧光染色、细胞化学染色、RT—PCR、靛青绿吸收染色方法进行细胞表型和双向分化潜能鉴定。结果多角形细胞团块在层粘连蛋白或大鼠鼠尾胶原上增殖传代形成集落,并特异性地表达肝干细胞的特异性标志物,不表达成熟肝细胞标志。经地塞米松和抑瘤素诱导分化后表达成熟肝细胞的标志特征,在小鼠胎儿成纤维饲养层,表达胆管细胞的特异性标志蛋白并形成胆管样结构。结论利用无血清培养体系从新生猕猴肝组织中分离到具有肝前体细胞特性的多角上皮细胞,这一研究模型的建立可为人类肝脏疾病的研究和细胞治疗提供临床前的评估平台。     

无血清培养富集乳腺癌干细胞的初步研究

目的：探讨富集乳腺癌干细胞的方法,以获得稳定数量的肿瘤干细胞。方法：（1）采用无血清悬浮培养方法,从乳腺癌MDA-MB-435细胞中筛选和培养肿瘤干细胞。（2）采用相差显微镜观察含胰岛素和不含胰岛素的无血清培养基中干细胞球形成大小、数量及随时间生长变化情况。（3）采用荧光显微镜观察Hoechst33342染料对MDA-MB-435肿瘤干细胞染色情况。（4）将MDA-MB-435肿瘤干细胞转人有血清培养基培养诱导分化,观察是否能有分化现象。结果：（1）采用无血清悬浮培养方法筛选和培养MDA-MB-435肿瘤干细胞成功。（2）发现不含胰岛素的无血清培养基中,形成的肿瘤干细胞团数量多且体积大。（3）随着培养时间延长,肿瘤干细胞球数量逐渐增多,体积逐渐变大。（4）Hoechst33342染料对肿瘤干细胞染色鉴定,约有90％肿瘤干细胞蓝色荧光染料较弱,呈暗淡区。（5）MDA-MB-435肿瘤干细胞经含血清培养基再次培养,具有分化功能。结论：含生长因子的无血清培养基培养MDA-MB-435细胞,可生成肿瘤干细胞球;不含胰岛素的无血清培养基更适合作为筛选肿瘤干细胞的培养基。     

人骨髓间充质干细胞对脐血干细胞体外扩增支持作用的研究

目的：探讨以人骨髓间充质干细胞(bone nlarrow-mesenchymal stem cells，BM-MSC)为基质的无血清培养方法，体外扩增脐血造血干细胞(cord blood stem cells，CBSC)，研究BM—MSC支持造血的功能，以能最终用于临床。方法：用含血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、fit3／flk2配体(FL)和粒细胞-集落刺激因子(G—CSF)的无血清培养液，比较有或无MSC条件下，体外扩增脐血CD34^ 细胞两周后检测总细胞TC、CD34^ 细胞、集落形成单位(CFU)和长期培养-起始细胞(LTC—IC)增加倍数。结果：在TPO、FL、SCF、和G-CSF的作用下，经两周体外扩增后有MSC组的TC、CD34^ 细胞、CFU—GM、CFU—C和LTC—IC数较起始分别增加了427、39、125、104和16倍。单纯用上述4种细胞因子的无MSC组，TC、CD34^ 细胞、CFU—GM、CFU—C数分别增加了62、11、25、24倍，但LTC-IC只有扩增前的0．8倍。结论：以人BM—MSC为基质的无血清体外培养体系可以更有效扩增CBSC，有潜在的临床应用价值。     

白血病细胞在无血清体系中增生能力的探讨

采用无血清甲基纤维素半固体培养方法,对白血病细胞系和原代白血病细胞进行一次集落培养,将形成的集落细胞重新悬浮,进行二次集落培养、计数。结果白血病细胞系的二次植入效率为３１．３０％,原代髓系白血病细胞的二次植入效率为２２．６６％。提示白血病细胞存在具有高增殖能力的干细胞性细胞群;原代白血病细胞的再增殖能力低于白血病细胞系。     

全反式维甲酸联合细胞因子诱导无血清培养的骨髓基质干细胞向神经细胞分化

目的研究全反式维甲酸与表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子等细胞因子联合诱导体外无血清培养的骨髓基质干细胞（BMSCs）向神经细胞分化的作用。方法用含2%Utroser G的UltraCULTURE无血清培养体系体外扩增大鼠BMSCs，免疫细胞化学染色鉴定其表面标志，用以全反式维甲酸与表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子为主要成分的复合诱导液诱导BMSCs向神经细胞方向分化，镜下观察细胞形态学变化，用抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）抗体和抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体进行免疫细胞化学染色鉴定诱导后的神经细胞。结果经全反式维甲酸、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子联合诱导后的BMSCs表现为神经细胞形态特征，诱导后的细胞可存活14 d以上，免疫细胞化学染色显示NSE和GFAP均有阳性表达，前者阳性率为65.6%，后者阳性率为12.5%。结论全反式维甲酸与表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子联合应用可在体外高效、稳定地诱导无血清培养的BMSCs分化为神经细胞。     

无血清培养对小鼠脑微血管内皮细胞凋亡的影响及其机制

目的　研究无血清培养诱导小鼠脑微血管内皮细胞凋亡及其可能机制。方法　培养用小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd .3。用流式细胞术检测凋亡细胞的百分比;用免疫细胞化学法检测Bax及Bcl- 2蛋白表达;用WesternBlot检测caspase 3蛋白表达。结果　bEnd .3细胞经无血清饥饿体外培养12 ,2 4 ,36h后细胞凋亡率明显增加,分别为(13.79±0 .99) % ,(17.80±1.39) % ,(2 0 .5 1±0 .5 5 ) % ,与各自正常血清培养的对照组凋亡率相比,P <0 .0 1。Bax表达明显增强,Bcl -2表达明显减弱,caspase 3明显增强。结论　无血清饥饿培养可诱导bEnd .3细胞发生凋亡,其发生机制与Bax/Bcl 2的变化及caspase 3的激活有关。