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相似文献
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1.
目的 :探讨优化细胞裂解条件 ,提高植入前诊断中聚合酶链反应的扩增效率。方法 :吸取单个淋巴细胞或人胚胎单卵裂球 ,用碱裂解液、蛋白酶K裂解液和改良的蛋白酶K裂解液进行处理 ,随后以巢式 -聚合酶链反应扩增人肾上腺脑白质营养不良基因 (ALD基因 )的 3号外显子 ,比较其扩增效率。结果 :三种裂解液组对人淋巴细胞的扩增效率分别为 90 % ,74 % ,87% ,对人单卵裂球的扩增效率分别为 98% ,77% ,96 %。结论 :在植入前诊断中 ,采用碱裂解液及改良的蛋白酶K裂解液优于蛋白酶K裂解液  相似文献   

2.
运用单细胞聚合酶链式反应进行植入前诊断的性别鉴定   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的:建立一种高效、快速、可靠的植入前诊断的性别鉴定方法。方法:取成人外血血单个淋巴细胞和人胚胎单卵裂球,采用多重荧光PCR和多重巢式PCR同时扩增性别识别位点Amelogenin和5号染色体上的基因IL-3。结果:男性单个淋巴细胞荧光PCR扩增效率为72%,巢式PCR扩增效率为64.7%;女性单个淋巴细胞荧光PCR扩增效率为76%,巢式PCR扩增效率为65%,两者与供体外周血gDNA扩增结果的一致性均达100%。单卵裂球荧光PCR扩增效率为86.9%,巢式PCR扩增效率为85.7%,来源于同一胚胎的不同单卵裂球扩增结果的一致性达100%。巢式PCR与荧光PCR的扩增效率比较无显著性差异(P>0.05)。结论:巢式PCR和荧光PCR各有优劣。但荧光PCR操作简便、耗时短、灵敏度高,为今后的发展方向。  相似文献   

3.
运用单细胞聚合酶链式反应进行植入前诊断的性别鉴定   总被引:1,自引:1,他引:0  
目的 :建立一种高效、快速、可靠的植入前诊断的性别鉴定方法。方法 :取成人外周血单个淋巴细胞和人胚胎单卵裂球 ,采用多重荧光PCR和多重巢式PCR同时扩增性别识别位点Amelogenin和 5号染色体上的基因IL 3。结果 :男性单个淋巴细胞荧光PCR扩增效率为 72 % ,巢式PCR扩增效率为 6 4 .7% ;女性单个淋巴细胞荧光PCR扩增效率为 76 % ,巢式PCR扩增效率为 6 5 % ,两者与供体外周血gDNA扩增结果的一致性均达 10 0 %。单卵裂球荧光PCR扩增效率为 86 .9% ,巢式PCR扩增效率为 85 .7% ,来源于同一胚胎的不同单卵裂球扩增结果的一致性达 10 0 %。巢式PCR与荧光PCR的扩增效率比较无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 :巢式PCR和荧光PCR各有优劣 ,但荧光PCR操作简便 ,耗时短、灵敏度高 ,为今后的发展方向  相似文献   

4.
目的 用多重置换扩增(MDA)方法,对植入前胚胎的单个卵裂球全基因组扩增后进行植入前胚胎性别的遗传学诊断.方法 用单细胞多重置换扩增方法对20个胚胎共20个单卵裂球进行全基因组扩增,用荧光PCR检测SRY、AMEL、XHPRT及X22 4个性别相关的基因座,检测胚胎性别,同时用同一胚胎另一卵裂球FISH结果作为对照.结果 20个卵裂球MDA均扩增成功,扩增成功率100%.20个胚胎均得到诊断,性别诊断成功率100%,其中12例为男性胚胎,8例为女性胚胎,与FISH结果一致率100%,诊断准确率100%.结论 可以用单卵裂球MDA后荧光PCR检测多个基因座的方法对胚胎性别进行快速、准确的植入前诊断.  相似文献   

5.
目的 改进一种以含蛋白酶K的裂解液作用于石蜡包埋处理的细胞、分离DNA粗提液用于PCR扩增的实验方案。方法 石蜡包埋组织切片经常规脱蜡处理,用蛋白酶K裂解液洗脱细胞,55 ℃消化3 h后离心,吸取上清液;分光光度法检测DNA酶裂解液质量和浓度;以之为模板分别扩增人线粒体基因微卫星多态D310区、ATPase6基因区和核基因HBB、BRCA1等的DNA片段,琼脂糖凝胶电泳检测分析PCR扩增情况,并测序验证扩增产物。结果 以石蜡切片的DNA裂解粗提液为模板,扩增目的DNA片段阳性率可达100%;获得序列分析验证。结论 改进的蛋白酶K裂解液一步洗脱消化法操作简单、过程快捷、费用低廉,能快速有效地分离石蜡组织切片DNA,用于后续PCR扩增检测,具有较高效率。  相似文献   

6.
目的探讨应用多重巢式聚合酶链反应(PCR)技术在β地中海贫血(简称β地贫)植入前遗传学诊断(PGD)中的应用。方法获取β地贫基因携带者单个淋巴细胞,建立了稳定的单细胞多重巢式PCR检测技术,可同时检测β珠蛋白基因及与β珠蛋白基因紧密连锁的HumTH01基因,并对4例已出生的重型β地贫患儿及双方均为β地贫基因携带者的夫妇应用多重巢式PCR进行了β地贫的PGD。结果利用单细胞多重巢式PCR,可以同时检测中国人常见的16种β地贫突变类型,单个淋巴细胞平均扩增效率为91.3%,平均等位基因脱扣(ADO)率为17.0%。对4对夫妇进行4个周期PGD,共活检33个胚胎,获得33个卵裂球,其中30个卵裂球扩增成功,扩增效率为90.9%,ADO率为13.3%。26个胚胎经PCR分析后获得明确诊断,移植了8个胚胎,获得1例临床妊娠。孕17周时经脐带血穿刺,证实为完全正常胚胎,现已出生1名正常女婴。结论应用单细胞多重巢式PCR技术可对β地贫进行植入前遗传学诊断,达到优生目的。  相似文献   

7.
目的 寻求建立适合大批量临床标本检测TT病毒(TTV)核酸快速制备方法,直接用于PCR扩增。方法 应用蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法与直接快速裂解法,分别制备TTV核酸做PCR模板,用于TTV的聚合酶链反应的快速检测。结果 在30例非甲-非庚型肝炎血清和50例慢性乙型肝炎患血清,应用经典的蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法和直接快速裂解法,分别制备TTV核酸模板,在相同条件下进行PCR扩增,结果两种制备方法的符合率为89%。结论 TTV是一种新发现的肝炎病毒,目前主要以实验室检测病毒核酸的存在为诊断依据,建立了具有快速、简便、适合大批量临床标本中TTV核酸制备方法,对TTV肝炎的快速诊断,具有重要的意义。  相似文献   

8.
目的:采用三重PCR技术检测缺失型杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy, DMD)基因部分外显子和性别鉴定位点amelogenin基因,探讨该技术对DMD家系中致病基因携带者进行植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD)的可行性.方法:显微操作取正常男性、正常女性和DMD基因8号、47号外显子缺失型DMD患者单个淋巴细胞及无DMD家族史夫妻行体外授精-胚胎移植(in vitro fertilization pre-embryo transfer,IVF-ET)术后废弃的单个卵裂球细胞,采用三重PCR技术扩增DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因.结果:64枚正常人单个淋巴细胞的DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率分别为93.8%,93.8%和95.3%,假阳性率为2.8%;48枚8号外显子缺失型患者单个淋巴细胞的DMD基因47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率均为95.8%,假阳性率为3.3%;48枚47号外显子缺失型患者单个淋巴细胞的DMD基因8号外显子和amelogenin基因扩增阳性率均为95.8%,假阳性率为0;40枚单卵裂球细胞DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率分别为82.5%,80.0%和77.5%,假阳性率为0.结论:本研究所建立的单细胞三重PCR技术具有较高的扩增阳性率和特异性,有望在缺失型DMD家系中进行PGD的临床应用.  相似文献   

9.
目的:选择一种较为理想的从痰标本中直接抽提结核分枝杆菌DNA的方法,用于显色法芯片检测结核分枝杆菌利福平(RFP)和异烟肼(INH)的耐药基因。方法:选择3份含结核分枝杆菌分别为4.325×103、6.857×104、5.356×105Copies/ml的痰液,分别用Chelex100树脂法、煮沸法、蛋白酶K消化-异丙醇沉淀法、蛋白酶K消化-酚/氯仿抽提法、碱裂解法、异硫氰酸胍裂解法、盐酸胍裂解法、离心柱法抽提结核分枝杆菌DNA作多重聚合酶链反应,显色法芯片检测结核分枝杆菌RFP和INH耐药基因。结果:离心柱法检测结果阳性,其余方法检测结果均为阴性,离心柱法检测灵敏度为2.743×103Copies/ml。结论:离心柱法是一种较为理想的从痰标本中直接抽提结核分枝杆菌DNA的方法,可用于显色法芯片检测结核分枝杆菌RFP和INH耐药基因。  相似文献   

10.
单细胞扩增前引物延伸多基因位点检测研究   总被引:4,自引:1,他引:3  
目的:考察单细胞扩增前引物延伸(PEP)全基因组扩增,后续巢式PCR同步检测β地中海贫血突变基因CD17、nt-28及连锁基因(ATTTT)、18和21号染色体短串联重复序列D18S51、D21S11和D21S1411、囊性纤维病CF△F508及连锁基因(GATT)、杜氏肌营养不良症DMD基因外显子17种48以及Y染色体性别决定基因SRY的可行性。方法:显微操作获取单个淋巴细胞和胚胎细胞,PEP全基因组扩增,后续特异性巢式PCR,检测上述10个基因位点的单细胞扩增成功率、假阳性率、假阴性率。结果:上述10个位点的单个淋巴细胞扩增成功率、假阳性率和假阴性主分别为89.5%、0.48%和2.50%,单个胚胎细胞扩增成功率和假阳性率分别为85.56%和3.0%。结论:单细胞PEP后续巢式PCR同步检测上述10个基因位点有较高的扩增成功率和很低的假阳性率和假阴性率,具有应用于植入前遗传学诊断的实际可行性。  相似文献   

11.
目的: 对影响单细胞二重巢式PCR扩增的因素进行初步探讨.方法:针对β-珠蛋白基因CD41-42、IVS-Ⅱ654突变位点区域采用二重巢式PCR,分别以不同的引物浓度组合、不同的Taq DNA聚合酶、不同的中和缓冲液、PCR反应前采用或不采用98 ℃预变性扩增单个淋巴细胞和/或单卵裂球,了解这些因素对PCR扩增效率的影响.结果: 不同的引物浓度组中,终浓度为0.25 μmol/L R1 F1引物对与 0.3 μmol/L R2 F2引物对配对扩增效率最高;不同的Taq DNA聚合酶中TaKaRa EX Taq的扩增效率最高;中和缓冲液-1(200 mmol/L Tricine)的扩增效率显著高于中和缓冲液-2(900 mmol/L Tris·HCl, pH 8.3/300 mmol/L KCl/200 mmol/L HCl)的扩增效率(P<0.05);单细胞PCR反应前采用98 ℃预变性与不采用98 ℃预变性的扩增效率间差异无统计学意义.结论:不同引物浓度组合、不同的Taq DNA聚合酶、不同的中和缓冲液对单细胞的二重巢式PCR的扩增效率存在明显差异,而PCR反应前采用98 ℃预变性不能提高PCR扩增效率.  相似文献   

12.
目的建立单细胞水平的荧光PCR技术,探讨该技术对临床开展着床前遗传学诊断的可行性。方法分离单个颊黏膜细胞,利用荧光PCR技术扩增微卫星D16S423位点,扩增产物在ABI3730上电泳,结果用Genemarker软件分析。结果单个颊黏膜细胞的PCR扩增成功率为93.3%,等位基因脱扣率为10.7%,诊断正确率为89.3%。结论利用单细胞荧光PCR技术进行着床前遗传学诊断是可行的。  相似文献   

13.
Deng J  Peng WL  Liu Y  Zhou CQ  Li J  Fang C  Lin WQ  Zhuang GL  Zeng YH  Tong DY 《中华医学杂志》2005,85(38):2682-2685
目的探讨应用跨越断裂点荧光聚合酶链反应(PCR)技术在α地中海贫血(简称α地贫)植入前遗传学诊断(PGD)中的应用。方法获取Ot地贫东南亚缺失型携带者单个淋巴细胞,建立了稳定的单细胞跨越断裂点荧光PCR检测技术,并对4对夫妇双方均为α地贫——SEA缺失型杂合子应用荧光PCR进行了α地贫的PGD。结果单个淋巴细胞平均扩增效率为90.0%(72/80),平均等位基因脱扣(ADO)率为8.3%(6/72)。对4对夫妇进行4个周期PGO,共检测38个胚胎,获得38个卵裂球,其中34个卵裂球扩增成功,扩增效率为89.5%(34/38),ADO率为5.9%(2/34)。经PCR分析,共获得11个正常胚胎,8个杂合子胚胎,15个重型地贫胚胎。移植了11个胚胎,获得2例临床妊娠。孕17周时经脐带血穿刺,分别证实为完全正常胚胎和杂合子胚胎,现已出生两名健康男婴。结论应用单细胞荧光PCR技术可对α地贫进行植入前遗传学诊断,达到优生的目的。  相似文献   

14.
Objective To develop a reliable and sensitive method for detection of sex and multiloci of Duchenne muscular dystrophy (DMD) gene in single cell Materials & methods Whole genome of single cell were amplified by using 15-base random primers (primer extension preamplification, PEP), then a small aliquot of PEP product were analyzed by using locus-specific nest PCR amplification. The procedure was evaluated by detection dystrophin exons 8, 17, 19, 44, 45, 48 and human testis-determining gene (SRY)in single lymphocytes from known sources and single blastomeres from the couples with no family history of DMD.Results The amplification efficiency rate of six dystrophin exons from single lymphocytes and single blastomeres were 97. 2% (175/180) and 100% (60/60) respectively.Results of SRY showed that 100% (15/15) amplification in single male-derived lymphocytes and 0% (0/15) amplification in single female-derived lymphocytes. Conclusion The technique of single cell PEP-nest PCR for dystrophin exons 8, 17,19, 44, 45, 48 and SRY is highly specifc. PEP-nest PCR is suitable for Preimplantation genetic diagnosis (PGD) of DMD at single cell level.  相似文献   

15.
目的:探讨从石蜡包埋组织标本获取线粒体DNA(mtDNA)并进行PCR扩增的有效方法。方法:选取27例石蜡包埋的淋巴瘤组织,分别使用二甲苯/乙醇和0.5%Tween-20进行脱蜡,改进裂解缓冲液的成分及浓度,酚/氯仿抽提以获取mtDNA并进行电泳和PCR分析。结果:0.5%Tween-20法获取mtDNA纯度及浓度含量明显高于二甲苯/乙醇法(P〈0.01);二甲苯/乙醇法和0.5%Tween-20法获取的mtDNA PCR扩增成功率分别为11.1%和40.7%,两者差异有统计学意义(P〈0.05)。结论:二甲苯/乙醇和0.5%Tween-20两种方法都可以扩增出mtDNA的目的片段,但0.5%Tween-20法操作简便,PCR扩增成功率高,不用接触二甲苯等有毒化学试剂,是一种较为理想的mtDNA提纯方法。  相似文献   

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