HnPNPB1基因短发夹环RNA载体的构建与鉴定

目的 利用RNA干扰（RNA interfering，RNAi）技术，构建HnRNPB1表达载体，并进行鉴定。方法 采用H1启动子，分别把被7bP序列间隔的21bp长短的HnRNPB1靶序列的反向重复序列，置于PsiRNA-hH1neoG2质粒中，分别构建HnRNPB1短发夹环RNA（shRNA），产生重组质粒PSiRNA—hHl neoG2 HnRNPB1。结果 将合成的DNA序列退火后克隆到载体上，并作测序分析，经测序鉴定确定为所需序列。结论 针对HnRNPB1基因的特异性ShRNA真核表达载体PSiR—NA—hH1 neoG2 HnRNPB1的成功构建，为进一步研究其基因功能打下基础。     

Smad4/DPC4基因小发夹RNA质粒表达载体的构建和鉴定

目的：构建Smad4基因小发夹RNA（shRNA）表达载体。方法：设计、合成3对编码Smad4基因shRNA的寡核苷酸序列，并分别将其克隆人pGCsi—H1／Neo／GFP质粒，酶切、测序鉴定，脂质体法转染293细胞。实时荧光定量PCR检测RNA干扰（RNAi）的抑制效果。结果：在经Hindm和BamHⅠ双酶切分别鉴定三种重组载体后，DNA测序证实小干扰RNA（siRNA）序列正确，并被准确克隆人载体。实时荧光定量PCR检测结果表明三种重组载体psiSmad4—1、psiSmad4—2和psiSmad4—3载体，分别对293细胞中Smad4基因mRNA表达的特异性抑制率为39．00％、8．80％和73．80％。结论：成功构建Smad4pGCsi—H1／Neo／GFP／shRNA质粒，为后期研究Smad4基因在肿瘤细胞中的作用机制和基因治疗打下基础。     

大鼠PEDF基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建针对大鼠PEDF 基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体并进行鉴定,探讨PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响.方法 构建PEDF基因过表达质粒,测序鉴定.针对PEDF基因不同干扰靶点构建4种RNAi 病毒载体质粒pGCsi-U6/Neo/GFP/shRNA,测序鉴定.过表达质粒和RNAi质粒共转染293T细胞后应用Western blot方法进行外源筛靶确定PEDF基因RNAi 有效靶序列.有效RNAi 病毒质粒和其他3种辅助包装原件载体质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后, 收集细胞培养上清液,将其浓缩后用孔稀释法测定病毒滴度.结果 过表达质粒及4种RNAi质粒构建成功.Western blot外源筛靶显示2个靶点能有效敲减目的基因的表达.PEDF shRNA慢病毒表达载体Serpinf1-RNAi-LV经293T细胞包装成功,收集293T细胞分泌的病毒上清测定浓缩病毒悬液的滴度为2×1012Tu/L.结论 成功构建了PEDF基因的RNAi慢病毒载体,为研究PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响打下基础.     

促血管生成素2及其受体Tie2基因RNA干扰表达载体的构建与鉴定

目的构建促血管生成素2(Ang-2)及其受体Tie2基因的RNA干扰(RNAi)表达载体。方法以Ang-2、Tie2的mRNA已知序列为靶点,化学合成能编码针对Ang-2、Tie2基因的短发夹RNA(shRNA)序列的寡核苷酸各2对,退火处理后克隆到pSilencer1.0-U6-siRNA表达载体的U6RNA聚合酶Ⅲ启动子的下游,构建重组质粒pSliencer-1.0-U6-Ang-2/Tie2-siRNA。结果将与目的片段相符的双链shRNA和线性化的pSilencer1.0-U6-siRNA质粒连接后,经限制性内切酶HindⅢ酶切电泳及测序分析证实,2条重组质粒载体构建正确,无任何碱基突变。结论成功构建pSilencer1.0-U6-Ang-2/Tie2-siRNA重组质粒各2条,为进一步研究其对血管生成的作用打下基础。     

针对PKM2多位点RNAi质粒载体的构建和筛选

目的：构建针对M2型丙酮酸激酶（PKM2）基因3个可干扰序列设计小发夹RNA（small hairpin RNA,shRNA）载体,为下一步探索Ad-PKM2介导PKM2 RNAi对乳腺癌细胞作用及机制建立基础。方法：根据RNAi设计软件设计并合成3对shRNA模板序列,依次将它们克隆至pGenesil载体中构建重组质粒,通过MTT检测筛选出对乳腺癌细胞株MCF-7增殖效应影响最强的RNAi序列。结果：酶切鉴定和测序结果证实RNAi载体构建成功,均能高效感染MCF-7并抑制MCF-7细胞的增殖,pGenesil-PKM2-（1＋2＋3）的抑制能力最强。结论：针对PKM2多靶点RNAi载体成功构建,为下一步研究PKM2被沉默后细胞生物学行为的变化打下基础。     

使用FLAG标签肽及慢病毒载体共同筛选小鼠foxp3基因RNA干扰的有效靶点

【目的】筛选高效的foxp3 RNA干扰的靶点用于阻断CD4^＋CD25^＋ Treg细胞的免疫抑制功能。【方法】使用oligoengine软件设计foxp3基因shRNA序列，化学合成法合成4条shRNA序列，构建含foxp3的靶序列的慢病毒载体：构建出表达FLAG融合蛋白和目的基因的工具细胞293T细胞用于筛选RNA干扰的有效靶点。【结果】成功包装了4条foxp3基因靶序列相应的慢病毒颗粒；成功构建了表达融合蛋白和目的基因的293T工具细胞：在工具细胞上筛选出了2条RNAi效率分别为91.3％和95．6％的有效靶点。【结论】使用FLAG融合蛋白和慢病毒载体能够筛选出Foxp3基因的RNAi最佳靶点。     

Bcl-2shRNA表达载体的构建及其对HL-60细胞生长的抑制作用

目的构建Bcl-2短发夹样RNA（short hairpin RNA，shRNA）序列的表达载体并研究其对HL-60细胞生长的抑制作用。方法化学合成2段编码短发夹RNA序列针对Bcl-2基因66个碱基的寡核苷酸，克隆到Pgenesil-1载体的u6启动子的下游，重组构建RNAi质粒，同时设立阴性对照；然后经酶切电泳和DNA测序鉴定。采用脂质体介导的转染方法将重组的RNAi质粒转入HL-60细胞后，采用RT-PCR检测Bcl-2mRNA表达水平；采用MTT法测定细胞增殖情况。结果重组构建的两个Bcl-2 shRNA1、shRNA2载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析，结果表明66个碱基成功插入到预期位点，并且序列完全一致。转染Bcl-2 shRNA1、shRNA2载体分别入HL-60细胞24h，其Bcl-2 mRNA表达水平均降低，但转染Bcl-2 shRNA1引起的Bcl-2 mRNA表达下降更为明显，分别与转染阴性shKNA及未转染组比较，有显著性差异（P〈0.05）。MTT测定显示转染Bcl-2 shRNA1、shRNA2载体入HL-60细胞在72、96h细胞生长明显受到抑制，分别与转染阴性shRNA、单纯脂质体组及未转染组比较，差异有显著性（P〈0.05）。结论成功地构建了两个Bcl-2 shRNA1、shRNA2表达载体，且Bcl-2 shRNA可序列特异性地抑制HL-60细胞的生长。     

使用FLAG标签肽及慢病毒载体共同筛选小鼠foxp3基因RNA干扰的有效靶点

 【目的】筛选高效的foxp3 RNA干扰的靶点用于阻断CD4^＋CD25^＋ Treg细胞的免疫抑制功能。【方法】使用oligoengine软件设计foxp3基因shRNA序列，化学合成法合成4条shRNA序列，构建含foxp3的靶序列的慢病毒载体：构建出表达FLAG融合蛋白和目的基因的工具细胞293T细胞用于筛选RNA干扰的有效靶点。【结果】成功包装了4条foxp3基因靶序列相应的慢病毒颗粒；成功构建了表达融合蛋白和目的基因的293T工具细胞：在工具细胞上筛选出了2条RNAi效率分别为91.3％和95．6％的有效靶点。【结论】使用FLAG融合蛋白和慢病毒载体能够筛选出Foxp3基因的RNAi最佳靶点。     

MMP-2特异性RNA干扰真核表达载体的构建

目的 构建基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)特异的RNA干扰质粒载体,为探讨抑制MMP-2表达在急性冠脉综合征治疗中的意义奠定基础.方法 根据GenBank 数据库提供的MMP-2基因核苷酸序列,选择设计能转录小发卡结构RNA (Small hairpin RNAs,shRNA) 的DNA 序列,并与psiSTRIKETM质粒载体连接,构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子U6 的真核表达载体,使用限制性内切酶Pst Ⅰ酶切鉴定是否为阳性克隆.结果 成功构建psiSTRIKETM-MMP2载体,拟进一步采用RNAi技术观察其对MMP-2 基因表达的抑制情况,从而研究其在急性冠脉综合征治疗中的作用.结论 MMP-2 RNAi真核表达载体被成功构建.     

靶向rPTTG的shRNA慢病毒载体构建及沉默效率评价

目的构建并筛选能高效沉默大鼠垂体瘤转化基因（rPTTG）的shRNA慢病毒重组载体。方法设计并合成4组特异性针对大鼠PTTG基因的shRNA序列将其构建到慢病毒载体pGCL GFP中;评估慢病毒重组载体在大鼠肾细胞中的转染效率并运用real time PCR技术检测各组重组载体对目的基因的沉默效果。结果PCR及测序结果显示,目的片段插入正确,重组载体构建成功,慢病毒重组载体转染效率达70%以上;4组shRNA序列均有基因敲减效果,并且第4组shRNA(4# shRNA)序列效果最为明显（＞80%）。结论成功构建了高效沉默rPTTG基因的慢病毒载体;验证了慢病毒载体作为RNAi载体工具转染效率的可靠性;实验显示4# shRNA能高效抑制内源性rPTTG基因表达。     

RNA干扰抑制肝癌QGY细胞株hTERT基因表达的研究

目的 利用RNA干扰稳定筛选-抑制技术,抑制人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达,探讨靶向hTERT基因RNAi对肝癌细胞增殖的抑制效应.方法 设计靶向hTERT基因的小干扰RNA,构建重组表达质粒pGenesil-shRNA-hTERT并导入人肝癌细胞系QGY细胞株,经G418筛选,建立稳定表达siRNA-hTERT的细胞株.采用real time RT-PCR、MTT和PCR-TRAP法同时检测pGenesil-shRNA-hTERT稳定抑制组和未处理QGY细胞组hTERT基因表达、端粒酶活性及细胞增殖变化.结果 在稳定表达pGenesil-shRNA-hTERT的QGY细胞株中,RNAi效力持续、稳定存在,hTERT的mRNA表达、端粒酶活性明显降低,瘤细胞增殖被抑制.结论 RNA干扰能持续、稳定地抑制靶基因hTERT的mRNA表达及肿瘤细胞增殖,是潜在的肿瘤基因治疗新方法.     

SiRNA稳定抑制肝癌细胞hTERT基因的表达

目的：利用RNA干扰稳定筛选-抑制技术,抑制人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因表达,探讨靶向hTERT基因RNAi与抑制肝癌细胞增殖的时-效关系．方法：设计靶向hTERT基因的小干扰RNA,构建重组表达质粒pGenesil—shRNA—hTERT并导入肝癌SMMC-7721细胞株,经G418筛选,建立稳定表达siRNA—hTERT的细胞株．采用real—time RT—PCR、MTF和PCR—TRAP法同时检测pGenesil—shRNA-hTERT稳定抑制组和未处理SMMC-7721细胞组hTERT基因表达、端粒酶活性及细胞增殖变化．结果：在稳定表达pGenesil—shRNA—hTERT的SMMC-7721细胞株中,RNAi效力持续、稳定存在,hTERTmRNA表达、端粒酶活性明显降低,瘤细胞增殖被抑制．结论：RNA干扰能持续、稳定地抑制靶基因hTERT mRNA表达及肿瘤细胞增殖,是有潜力的基因治疗肿瘤新方法．     

质粒介导的RNA干扰对AD293细胞中HBcAg表达的抑制作用

目的:研究质粒介导的RNA干扰效应对HBcAg基因表达的抑制作用.方法:设计并构建针对HBcAg基因的小发夹RNA表达载体,将构建好的shRNA表达载体和HBcAg-增强型绿荧光蛋白融合蛋白表达载体共转染人胚肾细胞株AD293,以空载体组以及针对无关序列的shRNA表达载体组为阴性对照,流式细胞术和实时荧光定量PCR法检测RNAi的抑制效果.结果:构建的特异性shRNA表达载体可以抑制HBcAg基因在AD293细胞中的表达,流式细胞仪检测抑制率可达76%,实时荧光定量PCR 法检测HBcAg基因的mRNA,抑制率可达58.6%.结论:质粒介导的RNAi可以有效抑制HBcAg基因的表达,为利用RNAi进行抗乙型肝炎病毒复制研究提供了一个可供选择的方法.     

凋亡抑制蛋白Livin shRNA真核表达载体的构建

目的设计构建Livin的shRNA真核表达载体，并转染宫颈癌HeLa细胞，进一步研究该表达载体对目的基因Livin的沉默效果，为宫颈癌基因治疗探索新方法。方法以Livin为靶基因，以Pgenesil-1质粒为载体，构建重组体，根据Livin基因cDNA序列，设计shRNA寡核苷酸序列，退火后克隆到空载体Pgenesil-1中，转化DH5α菌株，提取质粒，进行酶切鉴定和测序分析。将构建好的真核表达载体转染宫颈癌HeLa细胞。结果经酶切鉴定出的重组体测序结果与目的序列相同，重组载体构建成功，并被成功转入宫颈癌HeLa细胞，可见绿色荧光蛋白表达，48 h转染效率最高。结论利用RNA干扰技术可成功构建小干扰RNA重组体，为进一步研究宫颈癌基因治疗奠定基础。     

解整合素金属蛋白酶10基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)基因RNA干扰(RNAi)重组慢病毒载体,为进一步体内外实验研究提供基础。方法:筛选确定ADAM10基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,与LentiLox3.7载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用重组慢病毒转导传代心肌细胞(H9C2),通过Western blotting检测心肌细胞ADAM10的蛋白表达。结果:获得的载体插入ADAM10的shRNA核苷酸链序列正确,包装的慢病毒颗粒转导心肌细胞,与对照组比较ADAM10 shRNA转染成功抑制ADAM10蛋白表达。结论:成功构建AD-AM10 shRNA慢病毒载体,为其在扩张型心肌病(DCM)中的生物学功能研究奠定基础。     

RNA干扰沉默哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白基因表达对大鼠血管平滑肌细胞增殖活性及移植血管内膜增生的影响

目的 构建靶向哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）基因的RNA干扰表达载体,研究其对离体培养的血管平滑肌细胞（VSMC）增殖活性及大鼠自体移植静脉内膜增生的影响。方法 设计并合成针对大鼠mTOR基因的短发夹环RNA（shRNA）序列和对照序列,插入逆转录病毒载体pLXIN,转染包装细胞获得重组的病毒载体。感染VSMC,Northern杂交和免疫蛋白印迹检测mTOR及其下游底物4E-BPl和p70s6k表达的变化,流式细胞仪检测VSMC增殖周期的变化,MTT法检测VSMC增殖活性的改变。建立大鼠自体静脉移植模型54只,随机分成转基因组、对照组、空白对照组,术后7d、14d、28d取材,常规HE染色、免疫组织化学染色、免疫蛋白印迹检测mTOR表达,TUNEL法检测VSMC凋亡。结果 shRNA序列插入pLXIN载体,成功包装并且感染VSMC,证实针对mTOR基因的pLXIN-shRNA能够显著抑制mTOR表达,mTOR通路下游的p70s6k表达减少,而4E-BP1的表达却显著增加;被感染VSMC的分裂、增殖过程受阻,更多细胞停滞在G0／G1期;局部感染移植血管能够显著减少mTOR基因的mRNA及蛋白质产物表达（均P〈0．01）,内膜增生程度亦较其他组明显减轻（P〈0．01）,凋亡细胞增多（P〈0．01）。结论 成功构建靶向mTOR基因的RNA干扰表达载体,沉默mTOR基因表达能够抑制VSMC分裂、分化和增殖,减轻内膜增生,增加VSMC凋亡。     

慢病毒介导基于microRNA系统的HBs RNAi技术抑制HBV复制

目的:构建HBs基因RNAi慢病毒载体,观察其对HBV复制和抗原表达的作用。方法:针对已经筛选确定的HBs基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluⅠ和ClaⅠ酶切后的pGCLM-GFP载体连接产生慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pGCLM-GFP、pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染包装细胞293T,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。培养HepG2.2.15细胞系,用慢病毒（MOI=1和MOI=10）对肝癌细胞进行感染,感染后细胞培养上清进行ELISA、Western印迹、HBV DNA定量分析。结果:PCR和测序结果证实,成功构建HBs shRNA的慢病毒载体。包装慢病毒后浓缩病毒悬液的滴度为5×108~2×109 TU /ml。慢病毒HBs RNAi后,对HBV复制和抗原表达的抑制作用显著。感染4 d后,抑制效应开始出现,一直持续到第9天,抑制效应达到高峰(P<0.05)。相对于阴性对照,HBs shRNA作用后细胞上清中HBsAg分泌量下降70％以上(P<0.05),而Western印迹和real-time PCR结果进一步证实了上述结果,在蛋白水平和mRNA水平都得到了进一步验证。经HBV DNA定量,发现慢病毒RNAi后DNA水平也显著下降(P<0.05)。结论:成功构建HBs基因RNAi慢病毒载体,以HBs基因为靶点的慢病毒介导的基于microRNA系统的RNAi技术能有效抑制HBV的复制和抗原表达。     

CTGF特异性siRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建CTGF特异性siRNA慢病毒表达载体并观察其介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对人肝癌细胞CTGF(connective tissue growth factor,CTGF)表达的影响?方法:针对已经筛选确定的人CTGF基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与Plk0.1-GFP-SP6载体连接产生shRNA 慢病毒载体,经PCR筛选阳性克隆进行DNA测序鉴定?用脂质体转染法将质粒共转染293T 细胞,将包装产生的慢病毒颗粒感染HepG2细胞,Real-time PCR?Western-blot检测CTGF mRNA和蛋白的表达?结果:PCR与DNA测序证实合成的含CTGF shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确?经RNA干扰后的靶细胞CTGF mRNA以及蛋白表达水平明显降低?结论:成功构建人CTGF基因RNA干扰慢病毒载体,体外感染HepG2细胞可有效降低CTGF mRNA和蛋白的表达,为以CTGF基因为靶点的肝癌基因治疗研究奠定了基础?