人腹膜间皮细胞的培养及特征

目的 :建立人腹膜间皮细胞 (HPMC)培养模型 ,检测HPMC细胞外基质蛋白及白细胞介素 (IL - 8)的表达。方法 :采用胰蛋白酶 -EDTA消化法 ,从人的腹膜组织中分离HPMC。采用形态学和链霉菌抗生物素蛋白 过氧化物酶连接法 (即SP法 ) ,对培养细胞进行鉴定。采用SP法检测HPMC纤维连接蛋白 (FN)、胶原Ⅲ和胶原V及转化生长因子 (TGF) β1表达。采用逆转录多聚酶链反应 (RT -PCR)检测HPMCIL - 8mRNA和FNmRNA的表达。结果 :光镜示细胞融合后呈多边形 ,超微结构下可见丰富的微绒毛和内质网 ,免疫组化染色结果示HPMC可表达角蛋白 ,波形蛋白 ,胶原Ⅲ ,FN ,TGFβ1蛋白 ,Ⅷ因子、胶原V表达阴性。人腹膜间皮细胞亦表达FNmRNA和IL - 8mRNA。结论 :HPMC培养模型的建立 ,可为进一步研究腹膜纤维化的防治及IL - 8在腹膜透析中的作用提供理论依据。     

TGFβ_1反义RNA对腹膜间皮细胞分泌细胞外基质的影响

目的 :研究转化生长因子 β1(TGFβ1)反义RNA对体外培养的人腹膜间皮细胞 (HPMC)细胞外基质合成与分泌的影响。方法 :将反义TGFβ1基因真核表达载体转染HPMC ,用ELISA法检测转染细胞上清液中纤维连接蛋白 (FN)和Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂 (PAI 1)的蛋白质水平 ;用半定量逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)法检测转染细胞内FN ,PAI 1和胶原Ⅰ (ColⅠ )的mRNA表达 ,并与未转染HPMC对照组和转染空载体组比较其变化。结果 :TGFβ1反义RNA转染HPMC后 ,与对照组相比 ,转染 2 4h后 ,FN ,ColⅠ ,PAI 1mRNA分别下调 17% ,2 6 % ,9.6 % ;转染 4 8h后FN ,PAI 1蛋白含量亦明显下降 (P <0 .0 5 )。结论 :人反义TGFβ1基因真核表达载体可抑制HPMC合成细胞外基质 ,在腹膜纤维化的研究及防治中有潜在的应用价值     

TGFβ1反义RNA对腹膜间皮细胞分泌细胞外基质的影响

目的：研究转化生长因子β1（TGFβ1）反义RNA对体外培养的人腹膜间皮细胞（HPMC）细胞外基质合成与分泌的影响。 方法：将反义TGFβ1基因真核表达载体转染HPMC，用ELISA法检测转染细胞上清液中纤维连接蛋白（FN）和Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂（PAI-1）的蛋白质水平；用半定量逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法检测转染细胞内FN，PAI-1和胶原Ⅰ（ColⅠ）的mRNA表达，并与未转染HPMC对照组和转染空载体组比较其变化。 结果：TGFβ1反义RNA转染HPMC后，与对照组相比，转染24 h后，FN，ColⅠ，PAI-1 mRNA分别下调17％，26％，9.6％；转染48ｈ后 FN，PAI-1蛋白含量亦明显下降（P<0.05）。 结论：人反义TGFβ1基因真核表达载体可抑制HPMC合成细胞外基质，在腹膜纤维化的研究及防治中有潜在的应用价值。     

己酮可可碱对乳酸盐腹膜透析液致人腹膜间皮细胞损伤和TGF-β1、FN分泌的影响

目的研究己酮可可碱对乳酸盐腹膜透析液致人腹膜间皮细胞（HPMC）损伤和TGF-β1、FN分泌的影响。方法采用胰蛋白酶-EDTA消化法,从人腹膜组织中分离间皮细胞,并体外培养HPMC。采用自动生化分析仪检测培养液中乳酸脱氢酶（LDH）水平以示细胞损伤程度 ELISA法检测细胞培养液中TGF-β1、FN的水平。结果与单纯对照组相比,2.5%L-PDS致培养液中LDH水平明显增高（P〈0.01） 同时培养液中TGF-β1、FN蛋白质水平增加。在2.5%L-PDS刺激下,100μg/ml己酮可可碱与下调培养液LDH,提高MTT渗入量,并减少TGF-β1、FN蛋白质水平。结论己酮可可碱可拮抗乳酸盐腹膜透析液致HPMC损伤并下调TGF-β1和FN的表达。     

AGEs对人腹膜间皮细胞FN和CTGF的合成和表达作用研究

目的 观察糖基化终末产物（AGEs）对体外培养的人腹膜间皮细胞（HPMC）纤维连接蛋白（FN）和结缔组织生长因子（CTGF）表达的影响.方法 分别以不同浓度的AGEs（0、200、600、1 000mg/L）刺激HPMC 48h后,用RT-PCR法检测FN的表达情况.同时将体外培养的HPMC分为正常组（未加任何刺激因素）和AGEs组（终浓度为600mg/L）,两组均予刺激HPMC48h后,用RT-PCR及ELISA法检测细胞内FN和CTGF mRNA及蛋白的表达水平.结果 AGEs呈剂量依赖性上调HPMC FN mRNA的水平;AGEs组FN、CTGF mRNA和蛋白表达水平均较正常组明显增加（P＜0.05或0.01）.结论 AGEs可诱导体外培养HPMC的FN、CTGF基因和蛋白高表达.     

川芎素对高糖致人腹膜间皮细胞分泌FN和PAI-1的作用

目的研究高糖对人腹膜间皮细胞(HPMC)分泌纤维连接蛋白(FN)和血浆纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的影响,并进一步探讨川芎素对高糖致HPMC分泌FN和PAI-1的干预作用。方法采用胰蛋白酶消化法从人腹膜组织中分离间皮细胞,建立体外培养模型;用酶联免疫双抗夹心法(ELISA)检测HPMC培养液中FN和PAI-1蛋白质水平;用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测HPMC细胞内FN和PAI-1mRNA的表达。结果与单纯对照组相比,2.5%高糖刺激后,HPMC 培养液内FN和PAI-1蛋白质水平显著升高(P< 0.01),并上调HPMC FN和PAI-1的mRNA表达;加入低剂量(20,40μg/ml)川芎素后,FN和PAI-1蛋白质水平显著下降(P<0.01),mRNA表达水平下调。但随着剂量的加大,川芎素的上述作用减低乃至消失。结论高糖可引起HPMC FN和PAI-1蛋白质水平增加,并上调HPMC FN和PAI-1mRNA的表达,适当剂量的川芎素可拮抗高糖的上述作用。     

TGF-β1对人腹膜间皮细胞分泌细胞外基质和bFGF的影响

目的 :研究TGF - β1对人腹膜间皮细胞分泌细胞外基质和bFGF的影响。方法 :人腹膜间皮细胞(HPMC)作体外培养 ,在第三代 ,将细胞转板至细胞融合后 ,将其分为对照组 (F12 )和TGF - β1刺激组两组(F12 TGF - β15ng/ml) ,分别在 2 4 ,4 8h采用ELISA法检测上清液中纤维连接蛋白 (FN)和纤溶酶原激活物抑制剂 (PAI- 1)的含量 ;采用半定量逆转录多原酶链反应 (RT -PCR)检测HPMC细胞内FN ,PAI - 1和碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)mRNA的表达。结果 :HPMC表达FN ,PAI - 1和bFGF ;HPMC在 5ng/mlTGF - β1刺激下分泌FN及PAI - 1明显的增加 ,与对照组比较差异有显著性意义 (P <0 .0 5 ) ;HPMC经TGF- β1作用 12h后 ,FNmRNA ,PAI- 1mRNA和bFGFmRNA半定量结果与对照组相比 ,其表达量分别上调18.5 4 % ,8.6 %和 6 6 .9%。结论 :TGF - β1可促进HPMC合成与分泌细胞外基质和bFGF。     

TGF—β诱导骺板肥大区软骨细胞向成骨样细胞分化

目的 通过研究转化生长因子－β（TGF－β）对骺板软骨细胞分化的作用,揭示TGF－β软骨内成骨的作用机制。方法 采用鸡胚股骨无血清培养、酶组化检测碱性磷酸酶（ALP）、免疫组化检测Ⅰ型胶原、纤维粘连蛋白（FN）等方法,观察TGF－β在不同作用时间和剂量时对骺板肥大区软骨细胞分化的作用。结果 TGF－β可使肥大区软骨细胞表达Ⅰ型胶原和FN,使ALP表达增加,并存在着量效和时效关系。结论 TGF－β可以诱导鸡胚股骨骺板肥大区软骨细胞向成骨样细胞分化,与TGF－β的作用剂量和时间密切相关。     

PI3K/AKT信号通路在TGFβ1致人腹膜间皮细胞转分化中的作用

目的探讨磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt通路在转化生长因子β1(TGFβ1)体外诱导的人腹膜间皮细胞(HPMC)上皮-间质细胞转分化(EMT)过程中的作用。方法从人腹膜组织中分离和培养人原代腹膜间皮细胞。观察TGFβ1对人腹膜间皮细胞Akt磷酸化的影响,在不同时间点检测p-Akt的表达水平。采用免疫印迹方法检测应用PI3K特异性抑制剂Wortmannin对TGFβ1诱导后细胞内p-Akt、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙黏附蛋白(E-Cadherin)表达的影响。结果10ng/mLTGFβ1刺激HPMC0.5h后p-Akt水平开始升高,1h后达到顶峰,2h后逐渐减弱。TGFβ1诱导HPMC48h后α-SMA表达显著升高,E-cadherin表达显著下降;同时加用Wortmannin则p-Akt、α-SMA表达明显抑制。结论PI3K/Akt信号系统参与TGFβ1介导的人腹膜间皮细胞EMT过程,提示对其通路的抑制可有效阻止TGFβ1介导的腹膜纤维化。     

TGFβRII-siRNA对肝星状细胞TGFβR/Smad信号通路的影响

目的：研究转化生长因子βⅡ型受体小干扰RNA（TGFβRⅡ-siRNA）对肝星状细胞TGFβR/Smad信号通路的影响。方法：构建TGFβRⅡ-siRNA的表达质粒,将TGFβRⅡ-siRNA质粒采用脂质体转染HSC-T6细胞。转染72 h后,采用半定量RT-PCR检测TGFβRⅡ、Samd2、Smad3、Smad7的mRNA的表达变化,放射免疫法测上清液Ⅲ型前胶原、IV型胶原和透明质酸含量变化。结果：与无关siRNA比较,TGFβRⅡ、Smad2和Smad3 mRNA表达差异有显著性（P〈0.01）,但Smad7表达差异无显著性,上清液Ⅲ型前胶原、IV型胶原和透明质酸含量明显减少（P〈0.01）。结论：TGFβRⅡ-siRNA下调TGFβRⅡ、Samd2、Smad3 mRNA表达,减少肝星状细胞胶原合成,但对Smad7 mRNA无明显下调。     

Interleukin 1, transforming growth factor beta and messenger ribonucleic acid expression during the course of glomerulonephritis and glomerulosclerosis]

The accumulation of extracellular matrix is a prominent feature of progressive glomerulonephritis and glomerulosclerosis. This study was designed to evaluate the coeffective role of interleukin 1 (IL-1), transforming growth factor beta (TGF beta), and accumulation of collagen IV, fibronectin (FN), laminin (LN) in the progress of glomerulonephritis. Rat mesangial proliferation and sclerosis was induced by injection of anti-thymocyte serum (ATS). Total RNA of glomeruli were extracted from rat kidney at 3, 7, 14, 28, 60 days after ATS administration for northern blots. The results showed that IL-1, TGF beta mRNA expression was 2 to 3 folds higher than in the controls on the 7th to 14th day after injection of ATS. At the same time, there were increased accumulations of collagen IV, FN, and LN. Increased IL-1, TGF beta mRNA expression and accumulation of collagen IV, FN, LN were closely associated with mesangial proliferation, matrix expansion and focal glomerulosclerosis. These results suggest that increased IL-1, TGF beta mRNA expression and accumulation of collagen IV, FN, LN may play an important role in the progression of glomerulonephritis.     

TGF-β1刺激对人腹膜间皮细胞内Smad信号转导通路的影响

目的：探讨人腹膜间皮细胞内Smad信号转导通路在TGF-β1致腹膜纤维化过程中是否发挥作用。方法：取健康成年人大网膜进行人腹膜间皮细胞原代培养，经鉴定95%以上为人腹膜间皮细胞。用5 ng/ml TGF-β1刺激第三代培养细胞，采用免疫组织化学染色、Western blotting，ELISA以及RT-PCR等方法，分别观察人腹膜间皮细胞内磷酸化Smad2/3（p-Smad2/3）的蛋白表达以及在细胞内的迁移；细胞内Smad7的蛋白和mRNA表达；细胞外纤维连接蛋白（FN）的蛋白、细胞内FN的mRNA以及细胞内I型胶原（COL1）的蛋白和mRNA表达。结果：人腹膜间皮细胞内p-Smad2/3的蛋白表达在TGF-β1刺激后15 min即开始显著增加，此时p-Smad2/3的阳性细胞率为29%，细胞着色主要分散在细胞质中，30 min阳性细胞率81%至1 h阳性细胞率84%增加最明显，细胞着色加深且集中在细胞核及周边，2 h蛋白表达明显回落，此时阳性细胞率为37%，细胞着色转淡并又分散至细胞质中；细胞内Smad7的蛋白表达在TGF-β1刺激后24 h明显增加，48 h时达高峰，mRNA表达呈时间依从性增强；细胞外FN的蛋白、细胞内FN的mRNA以及细胞内COL1的蛋白和mRNA表达从TGF-β1刺激后24 h起均明显增加，且均显示一定的时间依从性。结论：人腹膜间皮细胞内Smad信号转导通路能被TGF-β1特异性激活，并在TGF-β1致腹膜纤维化过程中发挥效应；经TGF-β1刺激后，在该通路中主要起抑制作用的Smad7蛋白和mRNA表达均反馈性增加。     

氟伐他汀对高糖腹透液诱导人腹膜间皮细胞纤维连接蛋白表达的影响

目的:探讨氟伐他汀(fluvastatin,Flu)对高糖腹透液(high-glucose peritoneal dialysate,HGPDS)诱导人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells,HPMCs)纤维连接蛋白(fibronectin,FN)表达的影响?方法:体外培养HPMCs,同步化24 h后,分为正常对照组?HGPDS组?HGPDS+Flu组?单纯氟伐他汀组?DMSO对照组,各组分别刺激不同时间后,噻唑蓝(MTT)检测各组细胞的活力,RT-PCR检测FN的mRNA表达,ELISA法检测上清液FN蛋白表达的变化?结果:与正常对照组比较,HGPDS明显抑制细胞活力,HGPDS联合Flu共同培养24?36 h,细胞活力有所恢复,其中,1 × 10-6 mol/L Flu作用24 h,细胞活力改善差异有统计学意义(P < 0.05);与正常对照组比较,HGPDS明显增加人腹膜间皮细胞FN mRNA及蛋白表达(P < 0.05),并呈时间依赖性,其中FN mRNA于6 h达高峰,FN蛋白于24 h达高峰?Flu 可抑制HGPDS诱导的FN的高表达(P < 0.05),并呈浓度依赖性?结论:HGPDS诱导体外培养人腹膜间皮细胞FN表达增加,此作用可被Flu 抑制?     

高糖对人腹膜间皮细胞的增殖和损伤及分泌细胞因子的影响

目的：探讨高糖介导腹膜纤维化的可能机制。方法：原代培养的第3代人腹膜间皮细胞（HPMCs）分为不同时间（24，48h）的对照组（F12）和高糖组（F12＋4％葡萄糖）。用MTT法测定细胞增殖，乳酸脱氢酶（LDH）法观察细胞损伤程度，采用酶联免疫法（ELISA）测定纤维连接蛋白（FN）、转化生长因子β1（TGF-β1）和结缔组织生长因子（CTGF）蛋白水平以及采用RT-PCR测定FN，TGF-β1和纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）mRNA表达。结果：①高糖明显抑制细胞增殖，24h和48h高糖组与同一时间点对照组比较，MTT吸光度值均明显下降（P〈0．001或P〈0.01）；②高糖明显导致细胞损伤，24h和48h高糖组与同一时间点对照组比较，培养液中LDH含量均明显增加（均P〈0.001）；③高糖培养24，48h均使FN，CTGF和TGF-β1蛋白表达增加（P〈0．05或P〈0.001）；④高糖使FN，TGF-β1和PAI-1 mRNA表达均上调。结论：高糖能够抑制HPMCs增殖，损伤HPMCs，并刺激HPMCs分泌更多的TGF-β1，CTGF，FN和PAI-1，从而使HPMCs细胞外基质生成增多、降解减少，最终导致腹膜纤维化的形成。     

丹参素对高糖刺激腹膜间皮细胞分泌纤维连接蛋白和I型胶原的影响

目的:探讨丹参素对高糖刺激培养的腹膜间皮细胞(HPMCs) 分泌纤维连接蛋白(FN)和I型胶原(Col-I)的影响.方法:以高糖刺激培养HPMCs,分别加用浓度为10,5,2.5,1.25,0.625 mg/L的丹参素进行干预,并选取浓度为10 mg/L的丹参素干预0,12,24,48,72 h;应用RT-PCR,EL...     

丹参酮ⅡA对腹膜透析液诱导的人腹膜间皮细胞转分化及致纤维化因子表达的影响

目的腹膜纤维化是长期腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)的常见并发症,也是透析不充分和退出PD的主要原因,研究表明丹参酮ⅡA能改善各种组织中的纤维化。文中研究丹参酮ⅡA磺酸钠注射液对在高糖腹膜透析液(peritonealdialysis fluid,PDF)诱导下体外培养的人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells,HPMCs)纤维化及其相关因子表达的影响。方法选择非尿毒症、非糖尿病择期手术患者的大网膜作为HPMCs的来源,将培养的细胞随机分成4组:对照组、PDF组、丹参酮1组(含丹参酮ⅡA浓度为50μmol/L的PDF组)、丹参酮2组(含丹参酮ⅡA浓度为100μmol/L的PDF组),同步培养72h后,应用间接免疫荧光法检测α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、上皮钙黏素(E-cadherin)表达,实时荧光定量PCR检测E-cadherin、α-SMA、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、Ⅰ型胶原酶(CollagenⅠ)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、smad2、smad7 mRNA表达。结果免疫荧光法发现,丹参酮ⅡA能显著抑制高糖诱导的E-cadherin低表达和α-SMA高表达。Real-time-PCR发现,添加丹参酮ⅡA的PDF组α-SMA、FN、CollagenⅠ、TGF-β1、smad2 mRNA表达与PDF组比较显著下调(P<0.05);E-cadherin、smad7 mRNA表达显著上调(P<0.05)。结论在PDF中添加丹参酮ⅡA可显著减轻PDF导致的HPMCs转分化,从而抑制纤维化相关因子的表达。     

Troglitazone对人腹膜间皮细胞TGF-β1和纤维连接蛋白表达的影响

目的:研究过氧化物增生体激活受体γ(PPAR-γ)激动剂troglitazone(曲格列酮,TGZ)对高浓度葡萄糖刺激下体外培养的人腹膜间皮细胞(HPMCs)中TGF-β1和细胞外基质纤维连接蛋白(Fn)表达的影响.方法:采用胰蛋白酶消化法从人大网膜组织中分离间皮细胞,建立稳定的体外培养模型.根据细胞增殖与毒性实验选择troglitazone的最佳浓度15 μmol/L,干预高浓度葡萄糖(30 mmol/L D-葡萄糖)刺激下的人腹膜间皮细胞.采用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)半定量检测HPMCs中PPAR-γ,TGF-β1以及Fn的mRNA表达;采用双抗夹心法酶联免疫吸附实验检测HPMCs培养液中TGF-β1蛋白质水平;Western印迹检测Fn蛋白质水平.结果:高糖(30 mmol/L D-葡萄糖)刺激可在mRNA和蛋白质水平明显上调HPMCs表达TGF-β1和Fn(P＜0.01),troglitazone干预高糖孵育的HPMCs,可使TGF-β1和FnmRNA和蛋白质的表达明显下调(P＜0.05).结论:Troglitazone能够明显抑制在高糖刺激下的HPMCsTGF-β1和Fn的表达,这可能为临床防治长期腹膜透析患者的腹膜纤维化提供一种较为有效的方法.     

积雪草苷对增生性瘢痕中转化生长因子-βmRNA及基质金属蛋白酶类表达的影响

目的探讨积雪草苷对人增生性瘢痕中转化生长因子β（TGF-β）mRNA和基质金属蛋白酶及其组织抑制剂（MMPS／TIMPS）表达的影响。方法临床上收集烧伤后5～8个月经积雪草苷治疗和非积雪草苷治疗的增生性瘢痕标本各9例。采用原位杂交和免疫组织化学方法，分别检测增生性瘢痕中TGF-β1 mRNA、TGF-β2 mRNA、TGF-β3 mRNA及MMP1、MMP2、TIMP1、TIMP2和Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达水平，并利用图象分析方法进行结果分析。结果TGF-β mRNA在增生性瘢痕中主要表达于成纤维细胞胞质，经积雪草苷治疗的增生性瘢痕中TGF-β1 mRNA表达明显减少，胞质淡染，统计学上与非积雪草苷治疗组TGF-β1 mRNA表达有显著性差异（P〈0．01）；而TGF-β1，mRNA在积雪草苷治疗的增生性瘢痕中表达增多，明显高于非积雪草苷治疗组的TGF-β1 mRNA表达（P〈0．05）。MMPS／TIMPS在增生性瘢痕中也表达于成纤维细胞胞质，经积雪草苷治疗的增生性瘢痕中TIMP1。表达明显减少，与非积雪草苷治疗组TIMP1表达有显著性差异（P〈0．01）；而MMP1、MM2,及TIMP2在上述两组中表达无显著性差异（P〉0．05）。Ⅰ、Ⅲ型胶原在增生性瘢痕中表达．经积雪草苷治疗的增生性瘢痕中Ⅰ型胶原排列整齐，含量较少，与非积雪草苷治疗组有显著差异（P〈0．05）；而Ⅲ型胶原在两组增生性瘢痕中表达无显著性差异（P〉0．05）。结论积雪草苷通过降低TGF-β1 mRNA表达和增加TGF-β3 mRNA的表达，引起TIMP1表达明显减少，从而MMP1／TIMP1相对比例增加，达到促进Ⅰ型胶原降解，减轻瘢痕增生的作用。