肾综合征出血热患者流产胎儿分离毒株84FLi的全基因序列分析

目的：克隆和测定汉滩病毒疫苗生产株84FLi的全基因组序列,了解其分子基础。方法：采用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）,分节段扩增84FLi株L、M和S基因片段的cDNA,直接用PCR产物或克隆人pMD18-T载体后进行测序。结果：84FLi株L、M、S3个片段的全基因组序列为6533,3616和1688个核苷酸,分别编码2151,1135,429个氨基酸。A、C、G、T4种核苷酸分别为3830,2050,2510和3447个,GC含量为38．52％,AT含量为61．48％。序列同源性分析表明84FLi株与分离自广州的RG9株和分离自安徽的Chen4株高度同源。S片段核苷酸的同源性99．6％。与HTNV的国际标准毒株76－118的3个片段核苷酸同源性分别为83．7％、84．0％和87．2％,氨基酸同源性分别为97．5％、96．0％和97．9％。结论：84FLi株属于汉滩型病毒,并与分离自国内的汉滩病毒同源性较高,与中国株Chen4株和RG9株属于同一亚型。     

汉滩病毒西安分离株84 FLi的S片段全基因序列测定及分析

目的：测定我国陕西西安出血热肾病综合征(HFRS)患者流产胎儿肝分离的病毒84FLi株的全S片段基因序列，了解其分子特征，并确定其在汉坦病毒(HV)种系发生中的位置。方法：采用逆转录．聚合酶链式反应(RT-PCR)，扩增出S基因的cDNA，直接用PCR产物或克隆入pMD18-T载体中测序。结果：84FLi株的全S基因共由1688个核苷酸组成，四种核苷酸的比例分别为A31．39％、C19．25％、G23．04％和T26．30％，GC含量为42．29％，AT含量为57．71％。最大开放读码框为37～1326，共编码429个氨基酸。核苷酸序列同源性分析表明，84FLi株与汉滩病毒(HTN)型同源性高于与其他型HTV的同源性。84FLi株与中国毒株Chen4和RG9同属于一个进化分支，而与HTN型国外毒株距离较远，属于不同的进化分支。结论：84FLi株属于HTN，并与国内分离的HTN同源性较高。     

汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白M的基因克隆与序列分析

目的：建立汉坦病毒（HV）包膜糖蛋白M的克隆载体；研究M基因的变异情况，并对其序列进行系统发生树分析。方法：应用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）扩增GM04—38M片段的基因。产物纯化后克隆于PMD-18T载体。经氨苄青霉素筛选，酶切鉴定，并进行序列测定，应用DNASTAR软件将它与世界范围内分离的病毒株同一基因序列分析比较。结果：筛选出含有HVM蛋白基因的克隆。GM04—38株M片段的全基因序列共3651个核苷酸。4种核苷酸的比例分别为：A30．46％。T30．13％，G20．84％。C18．57％。序列同源分析表明。GM04—38株与Z37株核苷酸同源性最高（97.3％）。属于SEO型HV。与其他SEO各株的差别均小于18．0％：绘出了核苷酸系统发生树。结论：成功地建立汉坦病毒M蛋白基因克隆载体：中国不同地区汉坦病毒流行株基因序列存在明显差异。这为研究HV遗传与变异以及制备有效的亚单位疫苗奠定了基础。     

湖南狂犬病毒P基因和M基因分子遗传特征

目的了解湖南省狂犬病毒的分子流行病学特征以及其与疫苗株的差异。方法对4株湖南狂犬病病毒P和M基因同时进行了RT-PCR扩增、克隆和测序。结果同源性分析表明，4株湖南街毒P和M基因核苷酸同源性分别为97．3％-99．4％和98．4％-99．8％；与其它I型狂犬病病毒和疫苗株核苷酸同源性比较，P基因分别为78．4％-90．2％和81．8％-86．8％；M基因的分别为81．8％-92．1％和84．7％-90．6％。4株野毒P和M基因氨基酸同源性分别为98．0％-99．3％和98．5％-99．0％。结论4株病毒P基因和M基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列与我国现用的人用及兽用疫苗株存在一定差异。进化关系表明，4株病毒均为基因I型狂犬病毒；与我国宁夏分离株最近；与其它I型毒株分离自菲律宾和泰国等东南亚的毒株亲缘关系较近；而与翼手目的毒株关系最远。     

人巨细胞病毒地方分离株的鉴定及其UL83序列分析

目的鉴定从合肥市某医院先天性脑瘫患儿尿标本中分离的4株人巨细胞病毒（HCMV）毒株并对其UL83基因序列进行分析，为HCMV感染的预防及pp65蛋白疫苗的研制提供参考依据。方法应用细胞培养法复苏病毒，间接免疫荧光法检测pp65蛋白表达，并用特异性引物对UL73基因进行PCR，扩增的产物经凝胶纯化后测序；序列结果运用DNAMAN软件和GenBank登录的3株代表性HCMV毒株进行核苷酸和氨基酸序列比对。结果HCMV AD169株与HCMV-1分离株的UL83基因核苷酸及编码氨基酸序列的同源性均为100％，与其余3株的同源性也达99．26％～99．69％；4株HCMV分离株与Merlin株、Towne株在相应基因片段核苷酸及氨基酸的同源性最低的分别为98．95％，99．06％。结论UL83序列分析结果表明，HCMV UL83编码pp65蛋白的优势抗原决定簇氨基酸序列无变化。     

中国大陆柯萨奇病毒A组16型全基因参照序列的初步建立和分析

目的建立中国大陆柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)流行株的全基因参照序列。方法从GenBank中获得CoxA16中国大陆分离株的所有全基因序列和氨基酸序列,用DNAstar/MegAlign软件对所得序列进行多序列比对和进化分析,按照参照序列标准拟定CoxA16的全基因参照序列和氨基酸序列,并与参考序列进行比对分析。结果中国大陆分离的CoxA16毒株全基因序列共8株,分离于2005-2009年,其中2008年5株,广东省5株;通过序列比对获得了大陆CoxA16全基因和氨基酸参照序列;参考毒株间核苷酸序列同源性介于79.0%～98.8%,氨基酸序列同源性为94.3%～99.9%,与参照序列的核苷酸同源性为79.7%～97.0%,氨基酸同源性介于95.1%～99.5%之间,同源性最低的为2008年安徽阜阳的FY18株。结论比对分析了中国大陆CoxA16毒株全序列,成功建立了中国大陆CoxA16全基因和氨基酸参照序列。     

广东流行的三株登革1型病毒包膜蛋白基因的序列测定与分析

目的通过对广东省不同地区、不同流行期间分离的三株登革1型病毒(DVI)的结构蛋白E基因进行序列测定及分析．了解各流行株之间的遗传差异，追踪其可能的传染来源：方法应用RT-PCR技术扩增病毒的结构蛋白E基因，克隆到PMD18-T载体．转化JM109宿主菌，挑取阳性克隆进行鉴定及序列测定，应用计算机软件与国内外参考及流行株进行同源性分析．并绘制基因系统发生树：结果3株DVI病毒E基因序列长度均为l485bp，编码495个氨基酸，核苷酸序列同源性在91％～98％之间、推测的氨基酸序列同源性在94％～99％之间：GD23／95与A88核苷酸(氨基酸)同源性为95％(98％)，与其他株的同源性相对较低，2株属同一基因型；GD14／97和GD05／99与Cambodia共享序列非常接近．3株同属另一基因型。结论广东省1997、1999和1995年流行的登革热可能来自境外不同的疫源地。     

汉坦病毒西安分离株基因组全序列测定及分析

目的：测定分离自西安地区黑线姬鼠携带的的汉滩病毒毒株XAAal0091712全基因组序列,对各片段进行进化分析。方法：设计各片段引物,采用反转录-聚合酶链反应,分节段扩增各基因片段,直接用PCR产物或克隆入pMDl8-T载体后进行测序分析。结果：汉坦病毒毒株XAAal0091712全基因组由11845个碱基构成,其中A为3800（3l-99％）,C为2085（17．55％）,G为2551（21．47％）,T为3444（28．99％）;分s、M、L3个片段,各片段进化分析显示其与汉滩病毒贵州分离株高度同源。结论：该毒株属汉滩型病毒,与我国贵州地区汉坦病毒同源性较高,分型属于S2／M9／L4。     

PCR技术在丙型肝炎病毒RNA聚合酶基因分析中的应用

目的研究本地区HCV病毒分离株的分型,为临床治疗提供依据。方法利用PCR技术克隆并测定NS5B基因片段的核苷酸序列,并对其核苷酸和氨基酸序列进行比较分析。结果克隆的NS5B片段的核苷酸和氨基酸序列与HCV-Ⅱ型代表株相应部分序列的同源性最高,而且氨基酸序列比较结果显示,37个分离株中RNA聚合酶结构及其相关序列无任何变异。结论该分离株应属HCV—Ⅱ型。NS5B基因片段可能在病毒复制中起重要作用。     

汉坦病毒辽宁地区黑线姬鼠体内分离株的基因分型

目的 分离辽宁地区汉坦病毒，对分离株(SY13)进行基因分型，以弄清辽宁地区汉坦病毒流行株的基因型和基因亚型。方法 采用组织细胞培养法分离汉坦病毒：用RT—PCR法分别扩增SY13的M片段G1、G2区和S片段，通过DNAstar序列分析软件分别对三个基因片段的序列与从GenBank下载的序列进行同源性分析，并构建种系发生树。结果 通过对三个基因片段进行比较分析，SY13与HTN型同源性较高，为79．3％～97．0％；通过M片段G2区的比较分析，SY13与BA010、BA014、JIANG13、BA09、Q33处于同一分支，同源性达到95．0％～97．0％。结论 辽宁地区汉坦病毒分离株(SY13)与黑龙江地区分离株属同一亚型，为HTN型病毒中的H4亚型。     

汉坦病毒湖北株M片段G1编码区基因变异研究

目的 :探讨近年来汉坦病毒HTN湖北株M基因片段G1编码区部分基因序列的变异情况。方法 :根据汉坦HTNM片段G1编码区核苷酸序列设计引物 ,利用RT PCR方法对 75份病程在 7d以内的肾综合症出血热 (HFRS)患者 (经临床诊断和ELISA确诊 )血清标本进行检测 ,并对扩增出的目的基因片段选用 3种限制性内切酶AluⅠ、RsaⅠ、MboⅠ进行酶切 ,根据限制性片段长度多态性分析筛选出变异毒株 ,继而通过序列测定 ,得到变异毒株G1编码区部分核苷酸序列 ,并与标准株HTN76 118及地方株HTN 114的相应核苷酸序列及氨基酸序列进行比较分析。结果 :75份血清标本通过RT PCR方法进行检测 ,阳性率为 77.3 %。扩增片段用 3种限制性内切酶AluⅠ、RsaⅠ、MboⅠ进行酶切分析 ,发现 4份阳性产物其限制性片段长度多态性与HTN 76 118均不相同 ,但其中 3份阳性产物限制性片段长度多态性与地方株HTN 114基本相同 ,1份与HTN 114株不完全相同。对该扩增产物的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析表明 ,其核苷酸序列与标准株 76 118的同源性为 83.3 % ,与地方株HTN 114的同源性为 96 % ;推导氨基酸序列与HTN 76 118的同源性为 93.2 % ,与地方株HTN 114的同源性为 99%。结论 :①近年来引起湖北地区HFRS的主要毒株仍为HTN地方株。②从分析的病     

大仓鼠携带汉坦病毒全S、部分M核苷酸序列特征分析

目的测定从仓鼠亚科宿主动物大仓鼠肺中分离到的汉坦病毒的全S、部分M基因片段的核酸序列,明确其型别。方法RT-PCR方法扩增,连接入PMD-18T载体,转化至JM109宿主菌。阳性质粒进行测序分析。结果YU62株S基因全长1701nt,有一个完整的ORF,起始位置为37 nt,终止于1326 nt,编码N蛋白429个氨基酸。与HTN-A16株核苷酸、氨基酸同源性最高分别为99.1%,99.3%。M片段克隆出1272 bp,核苷酸与HTN-SN7有85.6%的同源性。从S片段种系发生树分析来看,YU62归于HTN型H4亚型。从M片段(265-624 bp)种系发生树分析来看YU62株属于HTN的一个新亚型。结论仓鼠携带的汉坦病毒S、M片段进化不平行,YU62可能是在大仓鼠体内发生重排的HTN的新亚型。     

汉滩病毒西安分离株84FLi M片段的克隆

目的:克隆汉滩病毒84FLi株M片段的cDNA. 方法:提取病毒总RNA,反转录为cDNA模板,用高保真的Taq酶扩增出G1和G2两个糖蛋白编码的基因片段:84M2.0(1～2058)和84M1.6(1964～3616). 将这两个片段分别与T载体-pMD18-T连接,转化感受态大肠杆菌后获得两个分别为G1和G2编码的克隆pMD84M2.0和pMD84M1.6. 再利用酶切连接的方法获得M片段全序列的cDNA克隆. 结果:获得两个分别为G1和G2糖蛋白序列编码的克隆,进而酶切组装为含有M片段全序列的cDNA克隆. 结论:获得了84FLi株M片段全序列的cDNA克隆.     

宁夏2004-2007年流行麻疹野病毒基因特征分析

目的了解宁夏2004-2007年流行的麻疹野病毒分离株基因特征,为控制、消除麻疹提供科学依据。方法用B95a、Vero/Slam细胞从疑似麻疹暴发和散发患者的标本中分离麻疹病毒,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),从分离到的麻疹病毒中扩增出核蛋白(nucleoprotein,N)基因C末端676个核苷酸片段,再对扩增产物进行核苷酸序列测定和分析,并以C末端456个核苷酸片段构建基因亲缘性关系树,进行核苷酸、氨基酸同源性分析。结果分离的36株麻疹野病毒全部为H1基因型H1a亚型。36株麻疹野病毒的核苷酸同源性为96.2%-100.0%,氨基酸同源性为94.0%-100.0%。宁夏14株麻疹病毒代表株与中国S191疫苗株的核苷酸同源性为91.0%-92.5%,氨基酸同源性为85.4%-89.4%。结论宁夏2004-2007年流行的麻疹野病毒为H1基因型H1a亚型,未发现其它基因亚型。H1a基因亚型病毒株引起了多个传播链造成宁夏各市的麻疹流行。     

Molecular Characterization of Duck Hepatitis B Virus Isolated from Hubei Brown Ducks

The objective of this study was to characterize the genome structure of duck hepatitis B virus (DHBV) isolated from Hubei brown ducks. The natural carrier rate of DHBV in adult ducks from Hubei area was investigated and the DHBV DNA-positive serum screened out. The complete genome of a DHBV strain was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into T vector and sequenced. The results showed that the carrier rate of DHBV in Hubei brown ducks was 10 %. This strain (GenBank accession number DQ276978) had a genome of 3024 nucleotides with three overlapping open reading frames encoding the surface, core and polymerase proteins respectively. Comparison of the strain with 17 DHBV strains registered in GenBank revealed a homology from 89.3 % to 93.5 % at the nucleotide level. The sequences of the structural and functional domains of these proteins were highly conserved. The strain was found to share more signature amino acids in the polymerase genes with the "Chinese" DHBV strains than those of the "Western" country strains. This finding was also corroborated by a phylogenetic tree analysis. Therefore, the DQ276978 might belong to a subtype of the Chinese DHBV strains.     

Similarity and diversity in sequence of HCV genome among Chinese, Japanese and American strains.

To estimate the homology between Chinese HCV strain, Japanese HCV strain and American HCV strain, we isolated and sequenced 8 clones, representing a 277-long fragment of high diversity. Chinese HCV strain was found to be homologous only in 68.6-72.6% for nucleotide sequence and in 69.6-73.9% for amino acid sequence to American HCV strain, but in 83.4-88.4% for nucleotide sequence and in 78.3-88.0% for amino acid sequence to Japanese main strain. The isolated strain may be the main strain in China, which can be divided into several substrains. This result is believed to be of paramount importance for the development of HCV detection method and vaccination as well as for the study on pathogenesis of HCV infection.

     

丙型肝炎病毒2a型E2区基因cDNA的变异分析

目的 了解丙型肝炎病毒2a型基因组E2区序列的一级结构及变异特征，为进一步研究HCV包膜蛋白的生物学功能打下基础。方法 用逆转录套式多聚酶链反应(RT-nPR)法从1例NANB型肝炎患者血清中扩增出一条约1100bp的片段，以限制性内切酶EcoRI、HindⅢ双酶切后连入pUC19载体中，转化感受态细胞，经限制性内切酶长度多态性分析(RFLP)和PCR法证实为阳性克隆后，用全自动序列分析仪测序。结果 测得约1100bp的核苷酸序列，其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列分别与HCV-1、HC-C2、HCV-BK、HC-J6、HC-J8相应序列作比较，显示分离株HCV在核苷酸水平上与以上分离株的同源性分别为63．1％、64．2％、64．1％、86．9％、69．3％，在氨基酸水平上的同源性分别为69．6％、70．7％、69．6％、86．2％、83．1％。结论 分离株(HCV-JF)与HC-J6同属2a型。     

青岛地区2000～2003年肾综合征出血热的病毒基因分型

①目的 调查山东省青岛地区2000～2003年汉坦病毒的流行情况，研究病毒在该地区的分子流行病学特征。②方法 采集肾综合征出血热(HFRS)急性期病人血清标本64份，提取血清中病毒RNA作为模板，根据GenBank中汉坦病毒基因序列，设计HTN型和SEO型的通用外套引物，同时分别设计HTN型特异性引物和SEO型的特异性引物作为内套引物，RT—nest—PCR扩增汉坦病毒基因组M片段G1区基因序列并测序。测序结果利用DNA Star软件进行核苷酸序列分析。③结果 在64例标本中用HTN型特异性引物扩增阳性6例，占9％；用SEO型特异性引物扩增阳性25例，占39％；总阳性率为48％。总体来看青岛地区流行的汉坦毒株以SEO型为主。SEO型汉坦病毒间核苷酸序列的差异相对较小，在核苷酸序列水平其基因的离散度为0．3％～8．9％。HTN型汉坦病毒的变异率较高，其基因的离散度为2．6％～11．2％。④结论 青岛地区汉坦病毒的流行以SEO型为主，HTN型并存，其中HTN型主要发生在胶南市。