弓形虫三种不同毒株pMD-18-T/GRA1重组质粒的构建

目的构建弓形虫三种不同毒株pMD-18-T/GRA1重组质粒.方法从接种了弓形虫三种不同毒株RH株、桂弓株、B36株的小鼠腹水中收集、纯化虫体,提取基因组DNA.应用PCR技术,分别扩增出三个不同虫株的致密颗粒蛋白1(GRA1)目的基因片段.将此目的基因片段插入PCR产物克隆专用载体pMD-18-T中,转化大肠埃希菌JM109,PCR鉴定其准确性.结果获得弓形虫三种不同毒株GRA1目的基因片段为785 bp.构建了pMD-18-T/GRA1重组质粒,经鉴定与预期理论值相符.结论成功构建了弓形虫三种不同毒株pMD-18-T/GRA1重组质粒.进行弓形虫不同毒株的GRA1基因测序,为研究其同源性及进一步应用研究创造了条件.     

弓形虫GRA7基因的保守性鉴定

目的　比较弓形虫不同地理株 (RH株、ZS2株、GT株 ) GRA7基因的异同。方法　运用 PCR从弓形虫不同地理株的基因组 DNA中扩增出 GRA7基因 ,对 GRA7基因用限制性内切酶(Esp3I、Cfr I、Mbo I)酶切并比较。将 GRA7基因克隆至 p GEX- 4 T- 1质粒 ,转化大肠杆菌 JM10 9,进行测序并比较。结果　 PCR扩增出 3株弓形虫的目的基因片段大小均在 5 0 0 bp- 75 0 bp之间 ,约711bp。 3种限制性内切酶酶切片段的大小均与理论值相符。 3株弓形虫 GRA7基因序列相同。结论　弓形虫不同地理株 GRA7基因具有高度保守性。     

弓形虫GRA7真核表达质粒的构建

目的:构建弓形虫致密颗粒抗原GRA7的真核重组表达质粒。方法:设计GRA7的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA7的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVAX1而构建真核重组表达质粒pVAX1-GRA7。结果:PCR扩增出GRA7基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAX1,构建了真核重组表达质粒pVAX1-GRA8。结论:成功构建了GRA7的真核重组表达质粒pVAX1-GRA7。     

弓形虫529 bp重复序列基因的PCR阳性质控质粒的构建

目的：构建含有弓形虫529 bp高度重复序列基因的重组质粒,为基于该基因的弓形虫病分子生物学诊断建立标准阳性对照品。方法：以弓形虫RH株基因组DNA为模板,对529 bp的基因片段进行扩增,将纯化后的PCR产物与pMD18-T载体连接后转入大肠埃希菌DH-5α中,提取重组质粒PCR及测序鉴定。以弓形虫529 bp基因为靶基因设计的检测引物,扩增弓形虫基因组DNA及质粒DNA。结果：PCR产物序列与GENBANK中弓形虫529 bp基因序列完全一致。以弓形虫基因组DNA和质粒DNA为模板,成功扩增出预期的249bp基因片段。结论：成功构建可作为标准阳性对照品的含有弓形虫529 bp高度重复序列基因的重组质粒pMD-18-Tox,为经济实用的弓形虫诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

弓形虫RH株和B36株致密颗粒蛋白1基因的克隆和序列分析

目的分析弓形虫2个不同分离株RH株和B36株致密颗粒蛋白1（GRA1）基因的异同．方法应用PCR技术,从弓形虫RH株、B36株分别扩增出致密颗粒蛋白1（GRA1）目的基因片段．将此目的基因片段插入PCR产物克隆专用载体pMD-18-T中,转化大肠埃希菌JM109,PCR鉴定其准确性并测序．DNAstar软件序列分析结果．结果获得弓形虫两个不同分离株RH株、B36株GRA1目的基因片段pMD-18-T／GRA1重组质粒．序列测定表明GRA1目的基因片断与GenBank报道的RH株GRA1基因（注册序列号：EU983103．1）有99％的同源性．经DNAstar5．0软件分析,发现两种虫株GRA1基因序列（R—RH株、B—B36株）有100％的相似性．结论GRA1基因在2个不同分离虫株之间无明湿差异．具有较高的保守性．     

弓形虫三磷酸核苷水解酶基因真核表达载体的构建

目的：构建编码弓形虫RH株三磷酸核苷水解酶（NTPase-Ⅱ）重组真核表达载体PVAX1-NTPase-Ⅱ。方法：采用PCR从弓形虫基因组DNA中扩增NTPase-Ⅱ基因,克隆入pGEM-T Easy载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR、酶切和测序鉴定;采用亚克隆将NTPase-Ⅱ基因克隆至真核表达载体PVAX1,筛选阳性重组质粒PVAX1-NTPase-Ⅱ,进行PCR、酶切和测序鉴定。结果：NTPase-Ⅱ的重组真核表达载体经PCR、酶切和测序鉴定,大小为1 887 bp,与预期大小一致;重组真核表达载体的核苷酸序列,与GenBank中的相应序列100%同源。结论：成功构建重组真核表达载体PVAX1-NTPase-Ⅱ,为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。     

弓形虫微线体蛋白1部分基因原核表达重组质粒pWR450-1-MIC1的构建、鉴定及测序

目的：构建弓形虫ZS2分离株pWR450-1-MIC1原核表达重组质粒，为进一步表达及免疫做准备。方法：用PCGENE软件分析MIC1基因可能的TB抗原表位，自行设计引物，用聚合酶链反应（PCR）技术从弓形虫ZS2分离株的基因组DNA中扩增编码微线体蛋白1（MCC1）的基因片段，经酶切，连接，重组入pWR450-1原核表达载体，再经含氨苄培养基筛选，酶切，PCR鉴定和测序。结果：从ZS2分离株基因组DNA中扩增出特异的MIC1基因片段，克隆成功pWR450-1－MIC1重组质粒，测序表明MIC1这部分基因与RH株相应碱基序列完全一致。高度保守，为下一步表达及免疫奠定基础。     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及克隆

目的：构建弓形棒状体蛋白2（ROP2)基因重组质粒。方法：根据ROP2基因已知序列，设计合成一对引物，用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段，插入pGEX-4T-1质粒，转化大肠杆菌TG1感受态细胞，经酶切及PCR鉴定，而后进行测序。结果：ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp，重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子，测序结果与已知序列基本吻合。结论：在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因，为下一步弓形虫诊断及疫苗研究打下了基础。     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的　构建弓形虫棒状体蛋白2（POP2）基因真核表达重组质粒。方法　根据ROP2基因已知序列,设计合成一对引物,上、下游引物分别引入EcoRI、SalI酶切位点,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段,插入pGEX-4T-1质粒,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2,而后经EcoR　I、Not　I双酶切出ROP2基因片段,再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果　ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论　在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2,为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）基因真核表达重组质粒，方法 根据ROP2基因已知序列，设计合成一对引物，上，下游引物分别引入EcoRI,SalI酶切位点，用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段，插入pGEX-4T-1质粒，构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2，而后经EcoRI,NotI双酶切除ROP2基因片段，再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果 ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp，重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子，克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论 在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2。为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。     

重组弓形虫致密颗粒蛋白7的表达及免疫活性分析

目的:重组表达弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7),分析其免疫活性。方法:采用聚合酶链反应(PCR)从刚地弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因,经克隆和测序分析后,亚克隆至表达载体pET-23a(+),转化大肠埃希菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GRA7,用His-bindTM亲和层析柱纯化,免疫印迹和小鼠免疫分析其抗原性。结果:PCR扩增出大小约660bp的GRA7基因片段,并被亚克隆到原核表达载体pET-23a(+),构建了原核重组表达质粒pET-GRA7;表达纯化获得分子量约29,000的重组GRA7;重组GRA7能被弓形虫感染兔血清所识别,并诱导小鼠产生抗体滴度达1:12800。结论:获得了具有良好免疫学活性的重组抗原GRA7。     

弓形虫真核表达质粒pcDNA3／GRA1的构建及序列测定

目的：构建弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)真核表达质粒，为进一步开展DNA疫苗的保护性研究打下基础。方法：采用PCR扩增出编码GRAl目的基因，用EcoR Ⅰ／XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切，将GRA1定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ／XhoⅠ位点；对重组质粒进行PCR，双酶切初步鉴定后做序列测定。结果：特异扩增出预计的GRAl片段，大小为573bp；扩增产物双酶切后成功连接到pcDNA3中，经PCR，双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有GRA1读框。结论：成功构建弓形虫GRAl真核表达质粒。     

弓形虫真核表达质粒pcDNA3/GRA1的构建及序列测定

目的 :构建弓形虫致密颗粒抗原 1 (GRA1 )真核表达质粒 ,为进一步开展DNA疫苗的保护性研究打下基础。方法 :采用PCR扩增出编码GRA1目的基因 ,用EcoRⅠ /XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切 ,将GRA1定向克隆到pcDNA3EcoRⅠ /XhoⅠ位点 ;对重组质粒进行PCR ,双酶切初步鉴定后做序列测定。结果 :特异扩增出预计的GRA1片段 ,大小为 5 73bp ;扩增产物双酶切后成功连接到pcDNA3中 ,经PCR ,双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有GRA1读框。结论 :成功构建弓形虫GRA1真核表达质粒。