pGEX-5X-1-hLMO4原核质粒构建及重组蛋白表达

目的:构建hLMO4的原核表达载体并诱导、纯化和鉴定其表达。方法:hLMO4全长编码基因经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)在BL21大肠杆菌中诱导GST-hLMO4融合蛋白表达,利用Glutathione Sepharose 4B纯化诱导的融合蛋白,并经Western blot鉴定结果。结果:hLMO4编码序列克隆至pGEX-5X-1载体中,双酶切鉴定片段大小为500 bp,在E.coli BL21中IPTG诱导融合蛋白的表达,分子质量约为49 000 Da,成功纯化出GST及GST-hLMO4蛋白,Western blot检测到蛋白表达。结论:构建了hLMO4基因原核表达载体,鉴定了GST-hLMO4融合蛋白表达。     

小鼠CD36基因片段合成、表达及GST融合蛋白的表达和纯化

目的获取小鼠CD36基因片段,并高效表达和纯化GST-CD36融合蛋白。方法设计合成CD36的基因功能片段,测序后,通过酶切克隆至表达载体pGEX-5X-2,构建重组表达载体,并导入E.coli BL21宿主菌中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组的GST融合蛋白,亲和层析纯化表达产物,SDS-PAGE进行分析鉴定。结果获得小鼠CD36基因片段,测序结果与GenBank的基因序列一致,重组GST融合蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子量28.5kDa处,出现特异性蛋白条带,重组蛋白经GST亲和层析柱纯化后,得到了高纯度的融合蛋白。结论合成小鼠CD36基因片段,并在E.coli BL21中高效表达,亲和层析后获得高纯度GST-CD36融合蛋白。     

人SCG10基因原核质粒构建及其重组蛋白表达

目的 构建SCG10的原核表达载体并诱导、纯化和鉴定其表达.方法 pcDNA3.1-SCG10质粒用BamHI和XhoI双酶切后,克隆至pGEX-5X-1栽体,IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)在BL21大肠杆茵中诱导glutathione S-transferase(GST)-SCG10 融合蛋白表达,利用GST-beads纯化诱导的融合蛋白,经Western blot印迹鉴定.结果 SCG10全长编码序列克隆至pGEX-5x-1载体中,双酶切鉴定片段大小为500 bp,在BL21大肠杆茵中IPTG诱导融合蛋白的表达分子量为47 kDa,成功纯化出GST及GST-SCGl0蛋白,Wstem blot检测到蛋白表达.结论 构建了SCG10基因原核表达载体,鉴定了GST-SCG10融合蛋白表达.     

不同激酶活性的hPAK6基因原核表达载体的构建及重组蛋白的表达

目的 构建不同激酶活性的hPAK6原核表达载体并诱导和鉴定其融合蛋白表达.方法 野生型、激酶活型和激酶死型pcDNA3.1-PAK6经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后,克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,在E.coli BL21中诱导不同型GST-hPAK6融合蛋白表达,并经免疫印迹鉴定结果.结果 野生型、激酶活型和激酶死型hPAK6编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,双酶切及测序鉴定正确,并在E.coli BL21中获得了诱导表达,蛋白的分子量均为101 kDa,免疫印迹检测到了融合蛋白表达.结论 成功构建不同激酶活性的hPAK6基因原核表达载体,并分别诱导表达出GST-PAK6融合蛋白.     

HCK SH3结构域与HIV-1 Nef蛋白体外结合活性的检测

目的构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1/SH3,检测原核表达的SH3蛋白的生物学活性。方法利用PCR方法扩增HCK SH3基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒pGEX-4T-1/SH3,转化E.coli DH5α,进行双酶切和测序鉴定。筛选阳性质粒,转化至E.coli BL21(DE3)中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹检测,同时纯化SH3蛋白。表达并纯化HIV-1 Nef蛋白,利用GST pull-down方法检测SH3蛋白与Nef蛋白的结合活性。结果成功获得重组质粒pGEX-4T-1/SH3,测序正确,高效表达并纯化了SH3蛋白。GST pull-down实验结果显示SH3与HIV-1 Nef蛋白具有良好的结合活性。结论成功地克隆、表达和纯化了GST-SH3蛋白,SH3与Nef蛋白具有体外特异性结合活性,为进一步研究针对Nef与SH3结合的靶向药物的筛选提供了实验基础。     

小鼠TSR2-3/TSP-1基因片段的克隆及其GST融合蛋白的表达和纯化

目的：获取小鼠TSR2—3／TSP-1基因片段，并高效表达和纯化GST—TSR2—3融合蛋白。方法：应用RT—PCR技术，从小鼠肺总RNA中，获得编码TSR2—3的基因片功能片段，测序后，通过酶切克隆至表达载体pGEX-5X-2，构建重组表达载体，并导入E.coli BL21宿主菌中，IPTG诱导表达重组的GST融合蛋白，亲和层析纯化表达产物，SDS—PAGE和Westem blot进行分析鉴定。结果：获得小鼠TSR2-3基因片段，测序结果与GenBank的基因序列一致，重组GST融合蛋白经SDS-PAGE和Westem blot分析，在相对分子量39kDa处，出现特异性蛋白条带，重组蛋白经GST亲和层析柱纯化后，得到了高纯度的融合蛋白。结论：成功克隆小鼠TSR2—3基因片段，并在Ecoli BL21中高效表达，亲和层析后获得高纯度GST—TSR2—3融合蛋白。     

结核分枝杆菌RD1区PPE68/GST融合蛋白表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌PPE68/GST融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌JM109中诱导表达. 方法: 利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因,并将其定向克隆pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并转化E.coli JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.采用GST蛋白纯化试剂盒进行重组融合蛋白纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组表达产物. 结果:成功构建原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并表达出约Mr 63 000大小的PPE68/GST融合蛋白,占总菌体的40%. Western Blot检测该融合蛋白能和结核患者多价抗血清发生反应. 结论:成功地构建了原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873,并在大肠杆菌得到表达.     

癌症转移相关基因Syntenin1多克隆抗体的制备与鉴定

目的 获得原核表达GST-Syntenin1融合蛋白,制备高效价的抗Syntenin1多克隆抗体.方法 RT-PCR扩增Syntenin1 cDNA开放阅读框(CDS)序列,亚克隆到编码GST的pGEX-4T-2原核表达载体上,将编码Syntenin1的pGEX-4T-2-Syntenin1重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Syntenin1融合蛋白表达,对融合蛋白亲和纯化.SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体效价及特异性.结果 成功制备GST-Syntenin1融合蛋白及多克隆抗体.Western blot结果表明Syntenin1兔多克隆抗体效价可达到1∶20 000,且与Syntenin1蛋白特异结合.结论 成功制备Syntenin1多克隆抗体,为进一步研究Syntenin1基因的功能奠定了基础.     

h-arrestin1重组蛋白不同亚型筛选及互作鉴定

 目的 构建GST/-arrestin1融合蛋白表达载体,筛选其不同亚型重组子,并诱导表达、纯化蛋白,初步进行蛋白亚型互作比较,为进一步功能研究提供实验基础。方法 提取人结肠癌细胞SW480的mRNA,反转录为cDNA。用PCR法扩增h?-arrestin1全长编码基因,通过SalI和NotI酶切位点将h?-arrestin1全长定向插入pGEX-5X-1中,构建原核表达载体pGEX-5X-1-?-arrestin1,并通过BglⅡ单酶切筛选A、B亚型,然后将重组质粒转入E.coli BL21 中,异丙基硫代β-D 半乳糖苷诱导表达,用谷胱甘肽-琼脂糖珠亲和纯化表达的GST/?-arrestin1A、B, SDS-PAGE鉴定,互作实验比较亚型的结合能力。结果 酶切及测序结果证明,成功构建了?-arrestin1A、B原核表达载体,并通过SDS-PAGE证实：经IPTG诱导表达及亲和纯化,从转化重组质粒的BL21菌株中获得了融合蛋白GST/?-arrestin1A、B亚型,通过GST Pulldown初步比较了重组?-arrestin1A、B蛋白亚型的结合能力结论 成功构建pGEX-5X-1-?-arrestin1A、B原核表达载体并确定了融合蛋白的诱导表达及纯化方法,且互作实验显示?-arrestin1A有较强的结合能力,为进一步研究?-arrestin1的生物学功能奠定了基础。     

大鼠Nogo基因片段的克隆及与GST融合蛋白的表达和纯化

目的: 获取大鼠Nogo基因片段并高效表达纯化. 方法: 用RT-PCR技术,从成年SD大鼠脊髓的总RNA中,获得编码Nogo基因功能片段的DNA. 测序后,通过酶切亚克隆至表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达载体,并导入E. coli DH5α中,IPTG诱导表达重组的GST融合蛋白. 对重组融合蛋白过谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化. 结果: 获得成年SD大鼠Nogo(570～691和1028～1089氨基酸残基)的基因,测序结果与已发表的基因序列相一致. 重组GST融合蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子质量(Mr) 39 000和32 000处,有特异的蛋白条带. 重组蛋白经谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白. 结论: 成功克隆成年大鼠Nogo基因片段,并在E. coli DH5α中高效表达,亲和层析后获得高纯度GST融合蛋白.