改良的降落PCR与普通PCR结果比较

目的：设计并验证一改良的降落PCR(MTD—PCR)程序。方法：自盐藻bardawi1中提取基因组DNA作为PCR模板，使用TaqDNA聚合酶及pfu DNA聚合酶，运用普通PCR和MTD—PCR程序，扩增胡萝卜素生物合成相关基因(cbr)上游启动子序列，并电泳比较PCR扩增产物的特异性。结果：使用普通Taq酶进行PCR，普通PCR程序产生200bp，500bp和1272bp的3条带，而MTD—PCR程序仅克隆出1272bp的特异带；利用高保真的pfu DNA聚合酶作PCR，在MTD—PCR泳道中也仅有1272bpl条带，而普通PCR除了产生1272bp的特异带外，还出现1条500bp的非特异带。结论：无论使用普通Taq酶或高保真酶pfu，改良的MT—PCR程序均明显提高PCR的特异性，提示它可用于克隆普通PCR难以克隆的基因片段，或在假阳性难以去除的情况下提高PCR的特异性。     

降落PCR扩增人类常染色体STR D15S128

目的优化PCR程序,尝试用降落PCR扩增人类常染色体STRD15S128。方法用普通PCR和降落PCR扩增人类常染色体STRD15S128。结果普通PCR扩增产物有非特异带,降落PCR无非特异带。结论降落PCR简化了普通PCR中摸索最适退火温度的过程,可以一步找到人类常染色体STRD15S128的退火温度,是一种高效率的PCR方法。     

应用降落PCR及克隆测序检测2型糖尿病外周血白细胞胰岛素样生长因子受体IGF1R基因甲基化

目的:比较应用降落PCR(TD-PCR)及克隆测序检测2型糖尿病患者外周血白细胞中胰岛素样生长因子受体(IGF1R)基因启动子区DNA甲基化位点的方法。方法:提取2型糖尿病患者外周血白细胞DNA进行亚硫酸氢盐处理,设计引物扩增IGF1R基因启动子区富含CG位点序列,分别行普通PCR和TD-PCR扩增,对含目的条带产物进行直接测序和克隆后测序。结果:与普通PCR扩增结果相比,TD-PCR扩增条带清晰、产物量多、二聚体少;且TD-PCR减少了对退火温度不断摸索的过程。克隆后测序峰图清晰,碱基丢失错判频率减少。结论:推荐应用TD-PCR检测亚硫酸氢盐处理的DNA甲基化位点,并进行克隆后测序。     

补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR条件优化

目的对补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR反应体系及扩增程序进行优化,检测PCR优化体系的适用性和灵敏性。方法通过改进引物设计、改变PCR反应过程中Mg2＋浓度、引物浓度、退火温度、模板DNA浓度及反应循环次数,分析比较PCR扩增效果。结果优化后的补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR反应体系中,Mg2＋浓度在2-4mmol/L,引物浓度在0.025-0.4μmol/L,循环次数在30-45次之间均能扩增得到清晰均一的特异性条带;同时,引物退火温度在55.5℃-69.6℃范围内均适用;优化后PCR体系能够检测的最低DNA浓度为1.41ng/μl,即模板DNA在反应体系中的总量为约2.82ng.结论已经建立的优化后的PCR基因扩增体系特异性高且稳定可靠。     

降落式PCR和SSCP检测淋巴细胞白血病单克隆T细胞受体γ基因重排

目的 以降落式PCR和单链构型多态性(SSCP)方法检测淋巴细胞白血病单克隆T细胞受体(TCR)γ基因重排，探讨其在淋巴细胞白血病诊断中的价值。方法 盐析法提取淋巴细胞白血病患者外周血白细胞DNA，TCR-γ基因重排通用引物和降落式PCR扩增基因重排。分别采用琼脂糖凝胶电泳、SSCP和DNA直接测序方法检测PCR扩增产物。阳性细胞系DNA模板与反应增生性淋巴组织DNA按不同比例混合后扩增，检测降落式PCR的灵敏度。结果 琼脂糖电泳中，18例T淋巴细胞白血病中有15例、4例B淋巴细胞白血病中有2例为阳性。阳性标本经SSCP进一步分析，呈不连续条带。DNA直接测序证实扩增产物为TCR-γ基因重排。阳性对照模板占1％以上时可得到阳性扩增结果。结论 TCR-γ基因重排通用引物结合降落式PCR可有效扩增T淋巴细胞白血病基因重排，可用于T淋巴细胞白血病的辅助诊断。     

聚合酶链反应法测定7种抗生素耐药基因

目的：建立快速检测非培养感染物中抗生素耐药基因表达的分子生物学方法，为临床的早期诊断和治疗及研究微生物学耐药机制提供一种理想的分子生物学技术。方法：应用聚合酶链反应测定7种抗生素耐药基因，并通过优化测定体系中镁离子浓度、引物浓度引物退火温度等，对PCR反应方法进行了质控。结果：7种抗生素耐药基因扩增条带清晰，无非特异性扩增条带，与所设计的扩增片段大小相符。结论:应用PCR检测 微生物的耐药基因，灵敏度高，特异性强。可简便、快速地检测细菌、真菌、衣原体和支原体的耐药基因，尤其联合检验对临床早期诊断、治疗及鉴定耐药菌株及亚型具有一定价值。     

长片段基因FMNL2PCR实验的体会

目的 尝试扩增长片段FMNL2基因.方法 采用巢式PCR或和降落PCR相结合的方法进行了FMNL2基因编码区全长及FMNL2-NT、-CT的扩增.结果 高效、特异地扩增出FMNL2基因编码区全长及FMNL2-NT、-CT片段.结论巢式PCR或和降落PCR相结合,提高了目的 基因的扩增效率和扩增产物的特异性.     

云南省1例输入性三日疟实验室检测分析

目的对云南省1例输入性疟疾患者的血样进行实验室检测分析。方法采用疟原虫属特异性引物和种特异性引物对该样本进行巢式PCR检测,将PCR扩增结果进行序列测定,并对获得的序列进行Blast比对,分析其分子性状。结果使用疟原虫属特异性引物r PLU5和r PLU6对血样进行PCR检测,第一轮未扩增出预期条带;使用疟原虫种特异性引物对血样进行PCR检测,扩增出预期大小约141bp的三日疟条带,无对应大小的恶性疟、间日疟和卵形疟扩增条带产生。序列分析表明,扩增片段长度为115bp,进行Blast比对发现,与Genbank中注册编号为gb|KJ934253.1的三日疟对应部分的基因序列同源性为96%。结论通过使用巢式PCR、序列测定分析等方法,基本证实该病例为三日疟原虫感染。     

金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌多重PCR方法的建立与初步应用

目的建立金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌多重PCR检测方法,为实验动物细菌检测提供快速、灵敏、简便的方法。方法根据金黄色葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌Las I基因、肺炎克雷伯杆菌Pho E基因和细菌通用16S rRNA基因设计出特异性引物;经过多重PCR引物浓度和退火温度的优化,特异性和敏感性的检测,建立多重PCR体系。应用该PCR体系对人工感染标本、实验动物粪便样本进行验证检测,与传统检测方法对比。结果多重PCR分别扩增出金黄色葡萄球菌(153 bp)、绿脓杆菌(600 bp)、肺炎克雷伯杆菌(368 bp)和通用(520 bp)的目的条带。多重敏感性为10 pg,特异性检测未从其他细菌中检测出目的条带。应用建立的多重PCR体系检测出不同组合的人工感染标本,从76只粪便检测出绿脓杆菌阳性1例,与传统检测方法结果一致。结论本文建立的多重PCR方法具有特异、灵敏、简便、快速等优点,为实验动物微生物的快速检测提供了可靠的方法。     

菌液SYBR实时荧光PCR快速检测金黄色葡萄球菌

目的建立菌液SYBR荧光PCR法快速检测金黄色葡萄球菌的方法。方法根据金黄色葡萄球菌的特异基因耐热核酸酶nuc设计引物,PCR方法和SYBR荧光PCR溶解曲线法验证引物的特异性;建立菌液SYBR荧光PCR快速检测方法,奶粉加标实验和菌株特异性实验评价方法的特异性,制备基因组浓度梯度和菌落梯度检验方法的灵敏性。结果利用引物对实验室的3个标准菌株进行PCR扩增,出现的条带均为单一条带,且与目的片段长度一致。16株金黄色葡萄球菌菌株的熔解曲线均呈单峰,特异性良好,无非特异性扩增。建立的菌液SYBR荧光PCR方法对金黄色葡萄球菌有很好的特异性和灵敏性,灵敏度达1pg／山DNA浓度,并可检测1 CFU／ml的复杂样品。结论本研究建立的菌液SYBR荧光PCR方法快速、特异性好、灵敏性高,对快速检测样品中金黄色葡萄球菌有重要意义。     

Whole CanA Gene Amplification of Helicobacter pylori and Its Fingerprinting by Restriction Fragment Length Polymorphism

To set up a method of amplification for the whole CagA gene of Helicobacter pylori and its fingerprinting by restriction fragment length polymorphism(RFLP),nested PCR was employed in combination with TD-PCR to amplify the gene and EcoRI and Hind Ⅲ were used to generate the RFLP fingerprinting.Target DNA fragments from 13 of 20 samples were successfully amplified and the relevant RFLP fingerprintings were obtained.It is concluded that the method can be used to amplify the whole CagA gene and CagA gene has apparent diversity of RFLP profile.     

触减PCR在扩增抗体重链和轻链可变区中的应用

目的探讨扩增人免疫球蛋白重链和轻链可变区基因的方法。方法提取经免疫的具有乙肝表面抗体的人外周血淋巴细胞总RNA,反转录合成cDNA,采用普通PCR和触减PCR两种方法扩增抗体重链和轻链可变区基因。结果利用触减PCR方法,扩增出抗体重链和轻链的可变区基因,基因片段分别约为340bp和325bp,而普通PCR没有得到预期的结果。结论触减PCR比普通PCR更容易扩增出抗体可变区基因片段。     

普通级与清洁级灰仓鼠脏器重量与脏器系数的比较

目的 测定并比较普通级与清洁级灰仓鼠的主要脏器重量及脏器系数的差异.方法 解剖普通级与清洁级灰仓鼠各40只,使用电子天平共测定12种脏器指标,并计算了脏器系数.结果 清洁级与普通级灰仓鼠雄性之间比较,心、肝、附睾重量有统计学意义（P＜0.01）,脑、肾脏的脏器系数差异有统计学意义（P＜0.01）;清洁级与普通级灰仓鼠雌性之间比较,心脏重量差异统计学意义（P＜0.05）,肾脏脏器系数有统计学意义（P＜0.01）;普通级灰仓鼠雄雌之间脏器系数比较,脾差异统计学意义（P＜0.05）;清洁级灰仓鼠雄雌之间脏器系数比较,心脏差异有统计学意义（P＜0.01）.结论 清洁级与普通级灰仓鼠的脏器重量、脏器系数差异较大.     

运用降落PCR同时快速检测NV、EV71和CoxA16病毒

目的运用降落聚合酶链反应(touchdown PCR,TD-PCR)技术快速从腹泻、手足口病人粪便标本中同时检测诺如病毒(Norovius,NV)、肠道病毒71型(Enterovirus 71 EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsachie virus,CoxA16),并评价该技术用于检测这3种病毒的效能和敏感性。结论根据touchdown PCR原理设计TD-PCR程序,试验选择最佳反应条件,与普通PCR扩增效果进行评价。用10倍稀释检验TD-PCR方法的灵敏度,并用轮状病毒、札幌病毒、星状病毒、伤寒杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、香港海鸥形菌检测该方法的特异性。结果 TD-PCR能在一个反应条件下同时检测NV、EV71和CoxA16,扩增片段条带清晰,检测效果明显优于普通PCR,测序证实了3组片段的特异性,3种病毒cDNA的最低检测浓度分别为4.775μg/ml、2.360μg/ml、43.273μg/ml。检测该方法特异性时,其他病原体未见特异性条带扩增。结论成功建立的TD-PCR方法可同时检测腹泻和手足口病人粪便中NV、EV71和CoxA163种病毒,为快速检测相关病原体、科学防治腹泻和手足口病疫情暴发提供了可靠手段。     

人喉癌细胞端粒酶催化亚基cDNA片段的扩增与克隆

目的 :测定人喉鳞状上皮癌 hep- 2细胞的端粒酶活性水平并获得 hep- 2细胞中 h TERT c DNA片段的克隆。方法 :采用 TRAP- ELISA法测定酶活性水平 ,RT- PCR技术扩增获得目的片段。利用酶切法、PCR法和序列分析法对所获克隆进行检测。结果 :hep- 2细胞具有较高的端粒酶活性水平 ,获得含h TERT c DNA片段的克隆。结论 :利用 RT- PCR法能够从具有较高端粒酶活性水平的 hep- 2细胞中扩增获得 h TERT c DNA片段     

扩增潜伏HIV-1 DNA序列实验方法的优化

目的对PCR扩增潜伏HIV-1DNA序列的实验方法进行优化。方法收集30例经高效抗逆转录病毒治疗（HAART）6~12个月的HIV-1感染者抗凝血标本,分别从外周血单个核细胞（PBMC）和高度纯化的CD4＋T细胞提取基因组DNA,巢式PCR扩增HIV-1env的C2-V5区,电泳检测扩增产物并进行DNA序列测定。结果同一患者PBMC纯化CD4＋T细胞标本扩增HIV-1env基因C2-V5区的效率（93.3%）明显高于直接从PBMC标本扩增该目的片段的效率（10.0%）。结论 PBMC纯化CD4＋T细胞后,再提取基因组DNA进行巢式PCR扩增,可提高扩增潜伏HIV-1DNA序列的效率。     

多重聚合酶链反应检测结核菌耐异烟肼相关基因

目的：建立耐异烟肼(isoniazid,INH)结核分枝杆菌(M.tuberclasis,MTB)多重聚合酶链反应(multiple PCR,multi-PCR)检测系统，在一次扩增中快速，特异地同时检出aphC启动子，inhA和kagG基因，用于快速初步诊断结核分枝杆菌对INH的耐药性．方法：根据结核分枝杆菌的aphC启动子，inhA和kagG序列，分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物，采用multi—PCR技术，同时检出对结核分枝杆菌耐INH起作用的3个基因．结果：应用multi—PCR反应体系，对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果；multi—PCR扩增的预期结果为：单基因引物出现一条特异性扩增区带，多重基因引物出现2或3条特异性扩增区带，经实验达到预期的扩增结果；对H37Rv标准株、INH敏感株及INH耐药株分别采用常规PCR和multi—PCR进行同时扩增，结果两种扩增方法均能扩增出预期的目的片段，符合率达100％．结论：multi—PCR能有效地为多基因耐药的临床病原体的诊断提供快速、准确的诊断手段，更能提高检验效率。     

重庆地区1例宫颈癌组织人乳头瘤病毒16型E6,E7基因的结构和变异

目的：报告1例重庆地区宫颈癌组织人乳头瘤病毒16型E6，E7基因的结构及其变异，方法：应用聚合酶链式反应（PCR）从宫颈癌组织扩增出人乳头瘤病毒16型重庆株E6，E7基因，分子克隆技术进行基因的克隆，测序。结果：成功地扩增出重庆地区宫颈癌人乳头瘤病毒16型株E6，E7基因，并克隆于质粒载体pBKS( )，结论：该例宫颈癌组织人乳头瘤病毒16型E6，E7与标准株HPV16 E6，E7基因的长度相同，E6基因无变异，但E7基因有两处点突变。     

乳酸菌同源重组载体的构建与鉴定

【目的】构建乳酸菌同源重组载体,实现外源基因在乳酸菌中的整合型表达。【方法】根据乳酸菌L.lactis MG1363全基因组中ThyA基因序列设计引物,PCR扩增乳酸菌基因组中ThyA基因起始密码上游及终止密码下游约1000bp的基因序列,将获得的目的基因依次克隆至载体pMUTIN4中,以琼脂糖凝胶电泳检测目的条带,以双酶切技术、DNA测序予以确证。【结果】琼脂糖凝胶电泳结果显示,目的基因成功扩增,双酶切及DNA测序结果证实,成功构建了同源重组载体pThyA-up-down。【结论】乳酸菌同源重组载体pThyA-up-down为实现外源基因在乳酸菌中的非抗性、整合型表达奠定了基础。