南方红豆杉愈伤组织培养条件的优化及紫杉醇积累的基因表达效应分析

目的 优化南方红豆杉愈伤组织诱导与继代培养条件,获得含紫杉醇量高的红豆杉愈伤组织,明确紫杉醇合成相关基因的表达模式与紫杉醇量的关系。方法 探讨了适合南方红豆杉的愈伤组织诱导及继代培养的激素组成及浓度。比较了南方红豆杉 (种胚、幼茎、幼芽)、曼地亚红豆杉 (种胚) 和太平洋红豆杉 (种胚) 不同外植体来源的愈伤组织的生长特点和紫杉醇的量,分析了不同愈伤组织紫杉醇合成相关基因的表达差异。结果 添加 3.0 mg/L 2,4-D 的 Murashige & Skoog (MS) 培养基有利于南方红豆杉的诱导,诱导率高于 92%。添加 2.0 mg/L 2,4-D 与 1.0 mg/L 6-苄基腺嘌呤 (6-BA) 的继代培养基有利于南方红豆杉的紫杉醇积累。同一培养条件下,南方红豆杉种胚来源的愈伤组织紫杉醇量最高,达到干质量的 0.027%。含紫杉醇量高的愈伤组织,其紫杉醇合成途径中的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶 (GGPPS)、紫杉二烯合成酶 (TASY)、紫杉烷-10β-羟化酶 (T10βH)、10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-β-O-乙酰转移酶 (DBAT)、苯丙氨酸氨基变位酶基因 (PAM)、去苯甲酰紫杉-N-苯甲酰转移酶 (DBTNBT) 等酶基因的表达水平高。结论 从南方红豆杉的种胚为外植体源获得了含紫杉醇量高的愈伤组织,提高 GGPPS、TASY、T10βH、DBAT、PAM、DBTNBT 的表达水平将促进紫杉醇的合成。     

高效液相色谱法测定东北红豆杉愈伤组织中紫杉醇的含量

目的：建立东北红豆杉愈伤组织中紫杉醇的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法（HPLC）法，选用C18色谱柱，流动相为乙腈：水（60：40），检测波长227nm，柱温25℃，对东北红豆杉愈伤组织中紫杉醇的含量进行了测定。结果：紫杉醇在19．5～97．6μg·mL。之间呈良好的线性关系，紫杉醇平均回收率为100．41％，RSD=1．62％（n=6）。结论：该含量测定方法准确可行，可以作为测定东北红豆杉愈伤组织培养中紫杉醇含量的高效液相色谱方法。     

南方红豆杉芽愈伤组织的诱导和培养

目的 为研究南方红豆杉芽愈伤组织诱导条件、最适培养基组成成分和紫醇含量的积累。方法 以南方红豆杉芽为外植体,在MS培养基上,试验不同种类、不同浓度的激素及其组合对愈伤组织诱导的影响。结果 芽诱导的最适培养基是MS添加2,4－D2.0mg/L和NAA0.5mg/L。对愈伤组织的增强、驯化和紫杉醇含量的积累则以B5添加2,4－D 0.5mg/L、NAA1.0mg/L和KT0．5mg/L为最佳。结论 本研究为植物组织细胞培养生产紫杉醇提供实验依据。     

南方红豆杉愈伤组织生长动力学及紫杉醇代谢动力学研究

目的 通过愈伤组织细胞生长及其紫杉醇代谢动力学的研究,筛选确定南方红豆杉愈伤组织培养生产紫杉醇的最佳培养基配方与最佳收获期。方法 以改良MS为基本培养基添加不同质量浓度的IBA、6-BA、GA₃组合诱导培养南方红豆杉愈伤组织,通过测定愈伤组织鲜质量进行生长动力学研究,采用HPLC法检测不同生长阶段愈伤组织中紫杉醇的积累量,进行紫杉醇代谢动力学研究。结果 改良MS＋0.2 mg/L IBA＋0.05 mg/L 6-BA＋0.3 mg/L GA₃、MS＋0.2 mg/L IBA＋0.01 mg/L 6-BA＋0.7 mg/L GA₃及MS＋0.2 mg/L IBA＋0.1 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L GA₃培养条件均较有利于南方红豆杉愈伤组织的诱导培养,且紫杉醇的积累量也较高,最高可达0.037 76%。结论 在添加IBA及6-BA的基础上适当增补GA₃可使南方红豆杉愈伤组织诱导提前启动,缩短出愈时间,促进生长,降低褐变程度,增加愈伤组织中紫杉醇的积累量。愈伤组织的生长曲线呈S型,紫杉醇的积累呈线型增加,是一个逐渐积累的过程,但积累到一定程度就不再增加,且伴随着愈伤组织不断褐变。     

几种红豆杉植物及其愈伤组织的同工酶比较研究

对东北红豆杉、云南红豆杉、中国红豆杉和南方红豆衫的幼茎、针叶及其茎来源的愈伤组织的过氧化物酶（POD）、醋酶（EST）、多酚氧化酶（PPO）及超氧化物歧化酶（SOD）的同工酶，可溶性蛋白的含量及电泳谱带，多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性作了比较研究。并探索了这几种同工酶的酶谱和两种酶活性与紫杉醇的生物合成的关系。     

南方红豆杉愈伤组织培养的研究

对南方红豆杉叶愈伤组织诱导条件及最适培养基级成成分进行了探讨。结果表明,２,４－Ｄ比ＮＡＡ更有利于愈伤组织的形成。培养基中添加适度浓度的ＣＡ、Ｐｈｅ和乙酸钠能促进南方红用愈伤组织的生长和紫杉醇的积累。     

L-谷氨酰胺和桂皮酸对云南红豆杉愈伤组织生长的影响

研究了不同化合物对褐化严重的云南红豆杉愈伤组织生长的影响。结果表明,在培养基中添加０．２９ｍｇ／ＬＬ－谷氨酰胺和０．０７４－０．２２ｍｇ／Ｌ桂皮酸后能有效地抑制愈伤组织和培养基的褐化,显著改善愈伤组织的生长,并对紫杉醇的含量影响不大;     

pH对红豆杉愈伤组织生长、PAL活性和紫杉醇含量的影响

目的 研究不同pH值对东北红豆杉和南方红豆杉愈伤组织生长和紫杉醇含量的影响。方法 采用不同pH值的B5培养基培养两种红豆杉愈伤组织,测定生长率、PAL活性和紫杉醇含量。结果 不同红豆衫愈伤组织所需最适pH值不同,而有利于愈伤组织生长的pH值均不利于PAL活性的提高和紫杉醇的积累。即：愈伤组织生长快时,PAL活性将下降,紫杉醇含量也减少。结论 pH值明显影响红豆杉愈伤组织的生长及次级代谢水平,从而影响了紫杉醇的合成与积累。     

南方红豆杉外植体母株来源与培养基成分对愈伤组织生长和紫杉醇的影响

目的建立和优化获得量大而高紫杉醇愈伤组织的培养技术和方法。方法以山西陵川县野生和在西安栽培的南方红豆杉为材料,就最佳母株、外植体种类、基本培养基、植物激素种类及浓度对愈伤组织诱导、生长和紫杉醇的影响等因素进行了系统研究。结果幼茎外植体因诱导的愈伤组织时间早、频率高而最佳;培养基Y 5:M S 2,4-D 4.0 m g/L K IN 1.0 m g/L或B 5Ⅲ:B 5 2,4-D 3.0 m g/L K IN 0.1 m g/L Phe 0.1 m o l/L为最佳诱导愈伤培养基,其诱导频率高达100%。继代培养基中质量浓度2,4-D(0.5~3 m g/L)促进愈伤组织增殖;高质量浓度(8 m g/L)则有抑制作用。当2,4-D质量浓度适宜时,愈伤组织在B 5培养基上较在M S培养基上褐化轻、生长快。HPLC分析表明紫杉醇最高的继代培养基为M SⅢ,其紫杉醇质量分数高达干重的0.004%;野生母株幼芽来源的愈伤组织,其紫杉醇普遍高于栽培母株幼茎来源的愈伤组织。结论以5月份野生红豆杉幼茎为外植体,以Y 5或B 5Ⅲ为诱导培养基和继代培养基,继代8~10代,每代培养30~35 d;用M SⅢ培养基再培养1~2代,收获愈伤组织或细胞培养物,并从中提取紫杉醇是获得大量高紫杉醇愈伤组织的较佳培养程序。     

南方红豆杉组织培养研究Ⅰ.愈伤组织诱导和培养条件优化

介绍了南方红豆杉植物愈伤组织诱导和继代培养条件,在ＭＳ－培养基上,附加不同种类和浓度配比的激素,在光照条件下对植物愈伤组织的诱导率和生长量等进行了比较,其中当２,４－Ｄ１．２ ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ ２． ８ ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ３ ｍｇ／Ｌ或 ４ ｍｇ／Ｌ时,愈伤组织诱导率和生长量最高,结果表明,不同激素组合对愈伤组织诱导率、生长量和发生的性状有明显的影响。为南方红豆杉植物细胞悬浮培养建立了基础,为解决红豆杉的资源贫乏提供了新途径。     

东亚和北美产红豆杉属七种植物中紫杉醇及短叶醇的含量

应用高效液相色谱分析了东亚产四种红豆杉和北美产三种红豆杉的紫杉醇和短叶醇含量。结果表明，短叶红豆杉树皮中紫杉醇含量最高，其次为中间红豆杉树皮；东亚产四种红豆杉枝叶中，云南红豆杉枝叶中紫杉醇含量较高，东北红豆杉和美丽红豆杉次之；短叶醇含量则以短叶红豆杉针叶最高，东北红豆杉及云南红豆杉次之。     

东亚和北美产红豆杉属七种植物中紫杉醇及短叶醇的含量

应用高效液相色谱分析了东亚产四种红豆杉和北美产三种红豆杉的紫杉醇和短叶醇含量。结果表明,短叶红豆杉树皮中紫杉醇含量最高,其次为中间红豆杉树皮;东亚产四种红豆杉枝叶中,云南红豆杉枝叶中紫杉醇含量较高,东北红豆杉和美丽红豆杉次之;短叶醇含量则以短叶红豆杉针叶最高,东北红豆杉及云南红豆杉次之。     

云南红豆杉中的非紫杉烷类化合物

从始江产云南红豆杉Ｔａｘｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｉｓｉｓ中分得５个非紫杉烷类化合物：３β－ｈｙｄｒｏｘｙ－５ａ,８ａ－ｅｐｉｄｉｏｘｙｅｒ－ｇｏｓｔａ－６,２２ｄｉｅｎｅ（１）,β－谷甾醇（β－ｓｉｉｔｏｓｔｅｒｏｌ,Ⅱ）,ｐｌｕｖｉａｔｉｌｏａ（Ⅲ）,α－ｃｏｎｉｄｅｎｄｒｉｎ（Ⅳ）和ｓｅｃｏｉｓｏｌａｒｉｃｉｒｅｓｉｎｏｌ（Ⅴ）。其中１是首次从红豆杉科植物中得到。我们利用核磁共振波谱与质谱等技术     

东北红豆杉细胞两液相培养生产紫杉醇的研究

反应-分离耦合技术是红豆杉细胞培养生产紫杉醇的关键技术。作者采用两液相培养技术，深入研究有机溶剂的种类、浓度、加入时间和相毒性对红豆杉细胞悬浮培养细胞生长和产生的影响。结果表明油酸和邻苯二甲酸二丁酯适合作此体系两液相培养的有机溶剂，合适的浓度为8％，加入时间为第7日～10日，与对照组相比，两液相培养的紫杉醇产量提高4倍。     

南方红豆杉悬浮培养细胞团区域化及营养功能分化的研究

对南方红豆杉Ｔａｘｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｖａｒ,ｍａｉｒｅｉ细胞悬浮培养过程中的分化、细胞团区域化及营养功能分化等现象进行了研究。通过光学显微镜和电子显微镜对细胞团切片及淀粉颗粒染色从形态学上进行系统观察,发现悬浮培养细胞团从外向里呈明显的３个区域;表层细胞由成年细胞组成,中层细胞是由增殖能力旺盛的细胞组成,中心区域的细胞细胞核已消失,出现分化的管状分子。在电镜下可见胞间连丝。通过对细胞内淀粉     

HPLC测定银杏愈伤组织内酯A的研究

建立了一种可用于银杏离体细胞培养物中内酯Ａ含量分析的ＲＰ－ＨＰＬＣ方法。样品经低浓度甲醇提取后，用中性或酸性氧化铝固相萃取柱纯化，用示差检测器检测，银杏内酯Ａ的最低检测限为 ０，０１２ μｇ，方法回收率为（９６．０±２）％，ＲＳＤ为 ３．１％。     

葡萄属低聚茋含量的HPLC测定

采用HPLC法测定11种葡萄属植物低聚茋的含量，方法简便，快速准确，为合理利用和评价本届药用植物提供依据。