对叠氮-L-苯丙氨酸盐酸盐的合成及其在重组人内皮抑素中的定点引入

以对硝基-L-苯丙氨酸为原料,通过5步反应制备纯度较高的对叠氮-L-苯丙氨酸盐酸盐。利用构建好的重组表达载体和正交氨酰tRNA合成酶/tRNA(MjTyrRS/tRNA)系统将对叠氮-L-苯丙氨酸(pAzPhe)定点(31位)引入到人内皮抑素分子中,表达人内皮抑素中突变体——rhEs31m。对分离纯化所获得的目的产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定,突变体rhEs31m电泳纯度达90%以上,同时可被抗人内皮抑素抗体特异性识别。通过MTT法检测rhEs31m体外抗人脐静脉内皮细胞增殖活性,结果显示:与野生型rhEs相比,rhEs31m保留了大部分生物活性。本实验表明单个pAzPhe的定点引入并未破坏重组人内皮抑素的空间结构和生物活性。     

可诱导高拷贝的正交琥珀抑制性tRNA筛选质粒的构建

为筛选获得对大肠杆菌氨酰合成酶具有高度正交性的琥珀抑制tRNA,建立了一种基于可诱导高拷贝质粒的筛选系统。利用乳糖操纵子对oriL复制子进行调控,有IPTG存在时使其携带的琥珀抑制性tRNA大量转录。正交性不高的琥珀抑制性tRNA大量转录时导致宿主菌死亡,只有携带高正交性的琥珀抑制性tRNA的克隆可以存活,从而达到筛选目的。利用这一筛选质粒,构建了琥珀抑制性tRNA突变文库,并进行了筛选,获得了与大肠杆菌氨酰tRNA合成酶具有高度正交性的突变体,并利用含琥珀抑制突变的半乳糖苷酶突变体进行了验证,证实利用可诱导高拷贝的筛选质粒可筛选出高正交性的琥珀抑制性tRNA突变体。     

用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素

目的 利用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素（endostatin）.方法 采用PCR技术从pMFGendo质粒上扩增出小鼠endostatin完整的cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pThiohisA中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物为包涵体,将包涵体纯化后通过镍柱亲和层析得到纯化的、可溶性的小鼠内皮抑素,经SDS-PAGE分析鉴定.结果 高效表达出相对分子量约32KD的重组融合蛋白,灰度扫描软件分析显示,其表达量占菌体总蛋白质的35.9%,经镍柱亲和层析获得了高纯度的小鼠内皮抑素重组融合蛋白,纯度可达95%,得率为0.27g/L.结论 用硫氧还蛋白融合表达系统在大肠杆菌中表达的小鼠内皮抑素重组融合蛋白易纯化并具有高活性.     

用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素的方法研究

目的探索用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素(endostatin)重组蛋白的最佳生产工艺路线.方法用pThioHis-endo重组质粒转化不同的大肠杆菌BL21、JM109、DH5α,经几种不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthio-galactoside,IPTG)诱导表达重组融合蛋白,或诱导表达不同时间后,采用SDS-PAGE分析表达产物;按所优化的条件进行重组内皮抑素的表达、包涵体的提取、洗涤、变性和复性,最后经Ni 柱纯化,再通过SDS-PAGE分析纯化的结果.结果3种大肠杆菌表达效果相差无几,最佳IPTG的浓度0.9 mmol/L,最佳诱导时间为5 h,经Ni 柱纯化后可获得可溶性的重组内皮抑素.结论利用本实验的优化条件可获得高产量、高纯度、可溶性的小鼠内皮抑素重组蛋白.     

硫氧还蛋白融合表达系统表达的小鼠内皮抑素之纯化和生物学活性鉴定

目的:将硫氧还蛋白融合表达系统表达的小鼠内皮抑素(endostatin)进行纯化并对其生物学活性进行测定.方法: 将含有pThioHis-endo重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物为包涵体,将包涵体纯化后通过镍柱亲和层析得到纯化的、可溶性的小鼠内皮抑素,经SDS-PAGE分析鉴定.将纯化的蛋白质通过鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验和内皮细胞抑制实验对纯化的蛋白质进行生物学活性测定.结果:经SDS-PAGE电泳分析获得了高纯度的小鼠内皮抑素重组融合蛋白,纯度可达95%,得率为0.27 g/L.纯化的重组蛋白在体外能抑制鸡胚囊膜血管生成及具有抑制血管内皮细胞增殖的活性,加入重组蛋白内皮抑素5 μg组与10 μg组血管生成抑制率分别为(22.3±2.0)%和(47.1±4.0)%,P<0.05,和对照组经过方差分析,差异都有显著性意义;内皮细胞抑制实验可见不同剂量重组蛋白内皮抑素对内皮细胞的生长具有抑制作用[抑制率分别为(49.6±4.1)%,(53.2±2.3)%,(55.0±3.6)%,(67.1±5.7)%],经过方差分析和相关性分析,具有剂量依赖效应(r＝0.984,P<0.05).结论: 用硫氧还蛋白融合表达系统在大肠杆菌中表达的小鼠内皮抑素重组融合蛋白易纯化并具有高活性.     

抗肿瘤的人重组内皮抑素基因的克隆及表达

目的 克隆抗肿瘤因子内皮抑素基因并表达内皮抑素蛋白重组人内皮抑素(human endosbtatin,HES)。方法 从人胎盘组织中分离总RNA,用RT-PCR法扩增出570bp的DNA片段,经序列测定证实为内皮抑素基因,并成功地克隆到pUC18质粒载体中,用Xpress系统体外表达出内皮抑素蛋白并纯化成功。结果 克隆的HEScDNA其序列和国外报道一致;构建了重组HES融合蛋白表达菌株,经SDS-PAGE等分析,表达目的蛋白达细菌总蛋白的40％以上。结论 通过HES基因克隆和表达的研究与探讨,得到了HES的基因克隆和高效表达菌株,为内皮抑素在临床治疗恶性肿瘤奠定了基础。     

大鼠内皮抑素在大肠杆菌中的融合表达及活性鉴定

目的获得有活性的内皮抑素融合蛋白。方法利用已成功转化的pthiohis-Endo融合表达重组子的大肠杆菌TOP10,在IPTG诱导下表达融合蛋白,亲和层析方法纯化,纯化产物经EK酶酶切后行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western-blot鉴定;MTT法鉴定其对人脐静脉内皮细胞增殖的影响。结果纯化后的内皮抑素的融合蛋白经EK酶酶切行聚丙烯酰胺电泳和Western-blot鉴定与预期相符,并能抑制人脐静脉内皮细胞增殖。结论大鼠内皮抑素基因在大肠杆菌中获得成功表达,表达的融合蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖。     

人内皮抑素基因的克隆、表达、纯化及活性测定

目的 获得有生物学活性的人内皮抑索蛋白。方法 用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)得到人内皮抑素编码区基因，连接PGEM-T载体，测序确认，定向克隆入pBV220表达载体，转化大肠杆菌DH5α进行表达、纯化及活性测定。结果 经测序分析证实，所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素基因，构建表达载体在大肠杆菌中表达，经SDS-PAGE分析，出现特异性蛋白质条带，并具有生物学活性。结论 人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达．表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖，为应用内皮抑素进行抗血管生成治疗奠定了基础。     

人内皮抑素基因的克隆、表达、纯化及活性测定

目的 获得有生物学活性的人内皮抑素蛋白。方法 用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)得到人内皮抑素编码区基因,连接PGEM-T载体,测序确认,定向克隆入pBV220表达载体,转化大肠杆菌DH5α进行表达、纯化及活性测定。结果 经测序分析证实,所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素基因,构建表达载体在大肠杆菌中表达,经SDS-PAGE分析,出现特异性蛋白质条带,并具有生物学活性。结论 人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达,表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖,为应用内皮抑素进行抗血管生成治疗奠定了基础。     

重组人内皮抑素在酵母中的表达及对人肺腺癌Astc-a-1细胞生长的抑制

目的在一种高效外源基因表达系统———毕赤酵母系统表达重组人内皮抑素,评价纯化的内皮抑素对人肺腺癌Astc-a-1细胞生长抑制的作用,为临床研究做进一步的探讨。方法和结果在酵母系统成功表达了重组人内皮抑素(re-combinant human endostatin),经肝素亲和层析得到了较高纯度的内皮抑素,经过筛选的人内皮抑素能够有效抑制ECV-304细胞的增殖,并与对照组有非常显著性差异(P<0.01);动物实验表明其能够有效抑制裸鼠肺腺癌Astc-a-1细胞的生长,统计学分析有非常显著性差异(P<0.01)。结论酵母系统内能够大量表达具有生物学活性的重组人内皮抑素,能在人体外有效抑制裸鼠肺腺癌Astc-a-1的生长,对其应用于临床具有重要意义。     

含对硝基苯丙氨酸的B淋巴细胞刺激因子疫苗对狼疮肾炎模型小鼠的保护作用

考察含对硝基苯丙氨酸的B淋巴细胞刺激因子(BAFF)治疗BAFF过表达的自身免疫性疾病的效果。利用本研究前期构建的工程菌,表达纯化了B淋巴细胞刺激因子的可溶型突变体(smBAFF)以及在其65位定点引入了对硝基苯丙氨酸的改构体(pNO₂Phe⁶⁵smBAFF)。通过考察pNO₂Phe⁶⁵smBAFF体外促小鼠淋巴细胞增殖活性、免疫原性以及所诱导的抗血清对天然BAFF活性的抑制作用,评价了其用于治疗BAFF过表达的自身免疫性疾病的可行性;同时采用了cGVHD(graft-versus-host disease)诱导的狼疮肾炎小鼠模型评价了pNO₂Phe⁶⁵smBAFF的药理活性。结果表明:定点引入了对硝基苯丙氨酸的pNO₂Phe⁶⁵smBAFF不具有促进小鼠淋巴细胞增殖的能力;由于对硝基苯丙氨酸的引入显著增强了蛋白的免疫原性,诱导机体产生了可以抑制天然BAFF活性的交叉抗体;在cGVHD诱导的狼疮肾炎小鼠模型中,pNO₂Phe⁶⁵smBAFF可显著减轻疾病症状。定点引入了对硝基苯丙氨酸的pNO₂Phe⁶⁵smBAFF可以作为治疗BAFF过表达的自身免疫性疾病的候选分子。     

含对硝基苯丙氨酸HER2疫苗的免疫原性研究

为了打破HER2自身蛋白的免疫耐受,产生高效的免疫应答,利用遗传密码扩充技术,将免疫原性氨基酸对硝基苯丙氨酸定点引入到HER2片段的第5、26、79位,获得了含有对硝基苯丙氨酸的HER2突变体。通过镍亲和色谱柱,获得纯度达95%以上的原型和突变体HER2分子。对HER2疫苗的免疫原性进行分析,结果显示,pNO₂Phe⁷⁹HER2能够在C57BL/6小鼠体内产生高滴度的交叉性抗体。免疫小鼠的抗血清能够识别具有完整HER2受体胞外区的SKBR-3细胞,并通过ADCC效应裂解HER2高表达的HER2+B16F10细胞。这些研究结果提示,定点引入了对硝基苯丙氨酸的pNO₂Phe⁷⁹HER2可以作为靶向HER2的肿瘤疫苗候选分子。     

乌药总生物碱提取工艺的优选及镇痛作用的研究

目的 优选乌药总生物碱（TALR）的提取工艺并研究其镇痛作用。方法 采取乙醇回流法提取,考察乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数影响,进行L₉(3⁴) 正交试验设计,以乌药总生物碱的紫外吸收峰最大吸光度A值为指标进行优选。镇痛实验取最佳提取方法所得TALR的不同浓度水溶液ig给予小鼠后,采用醋酸小鼠扭体法研究TALR的镇痛作用。结果 优选工艺为：加入14倍量95%乙醇提取1 h,酸溶碱沉得TALR,因其A值远高于其他工艺,故判断此法所得TALR质量分数相对最高。药理实验表明TALR可显著减少小鼠扭体次数。结论 优选工艺简单可行,质量分数较高;TALR具有较强的镇痛作用。     

大鼠体内Pig-a基因突变试验的优化及ENU时-效关系和 量-效关系评估

目的 对大鼠Pig-a基因突变试验方法进行优化,并初步探讨阳性诱变剂N-乙基-N-亚硝基脲（ENU）在该实验中的时-效关系和量-效关系。方法 30只雄性SD大鼠随机平均分为5组,即溶剂对照组,ENU 10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg和80 mg/kg 4个剂量组,连续3 d经口灌胃染毒。分别于实验第0、15、30、45、60、75、90天尾静脉取血,分离红细胞,经Anti-CD59-APC和SYTO 13核酸染料标记后采用流式细胞仪分析CD59表型突变为成熟红细胞（RBCCD59-）率、CD59表型突变为网织红细胞（RETCD59-）率以及RET占总红细胞百分率。结果 ENU各组大鼠在染毒后第15~90天的RBCCD59-率呈现随时间和剂量反应性地增高。RETCD59-率随时间延长,ENU各组表现为先增后基本稳定伴小幅波动趋势,但均保持在较高水平,在染毒后30 d出现最高峰,在45 d时出现下降;同时,随着ENU剂量的增加,ENU各组RETCD59-率也随之增加。随时间延长,ENU各组大鼠RET百分率有所下降,30 d后呈现较为稳定的轻微波动,5组间RET%在各时间点处差异均无统计学意义。结论 本研究改良的大鼠Pig-a基因突变试验可进行快速检测,ENU短期（3 d）染毒诱导大鼠红细胞Pig-a基因突变具有时-效关系和量-效关系。     

延胡索提取工艺的优化及化学成分与药效指标相关性分析

目的 针对延胡索抑制肝癌细胞的作用,结合正交设计法,优选延胡索中延胡索乙素、原阿片碱的提取工艺条件,并对2种生物碱与药效学指标的相关性进行分析。方法 采用正交设计法,以延胡索乙素提取率、原阿片碱提取率、SMMC- 7721细胞抑制率和出膏率为评价指标,对延胡索中2种生物碱的提取工艺条件进行优选;应用SPSS 13.0统计软件进行Pearson相关系数分析。结果 最佳提取工艺为6倍量70%乙醇回流提取2 h,延胡索中2种生物碱的提取率最高,对肝癌细胞的抑制率最高。结论 该方法快速、操作简便,可以为确定延胡索中2种生物碱定量测定方法提供实验依据。     

正交试验优选阿胶、龟甲胶、鹿角胶的微波炮制胶珠工艺的研究

目的 优选微波炮制阿胶、龟甲胶、鹿角胶胶珠的工艺参数,规范胶类药材制珠工艺,提高并稳定胶珠质量。方法 用多项指标评价胶珠质量,采用L₄(2³)正交优选法对炮制胶珠工艺参数进行筛选。结果 获得了阿胶、龟甲胶、鹿角胶优化的炮制胶珠工艺参数。结论 不同种类的胶材或不同批号、不同生产厂家的同类胶材都有其最适的工艺参数,可用正交试验优选法快速筛选。     

成都某部一起感染Yamagata系乙型流感病毒血凝素基因分析

目的 分析成都某部感染乙型流感病毒遗传进化与血凝素（HA）基因突变位点。方法 通过犬肾上皮细胞（MDCK细胞）体外分离患者咽拭子标本流感病毒毒株,用PCR获取乙型流感病毒HA基因并测序,与NCBI数据库在线比对并利用MEGA 6.06软件构建系统发育进化树,分析突变位点。结果 通过MDCK细胞接种,分离出1株乙型流感病毒株,以感染病例咽拭子核酸及分离毒株的核酸为模板进行PCR扩增得到1 755 bp全长HA基因,获得的序列提交至GenBank数据库,获得基因登录号为MH236281。通过在线比对及系统发育树构建,该病例感染的病毒为Yamagata系乙型流感病毒。与乙型流感病毒Yamagata系的代表毒株Influenza B/Yamagata/16/88（GenBank No.M36105）相比,HA基因点突变碱基为57个;与世界卫生组织（WHO）推荐的疫苗株Influenza B/Utah/08/2014（GenBank No.KU592766）相比,突变碱基数为20个。进一步对HA1氨基酸突变位点进行分析,与四川地区往年流行株相比均发生了不同程度的突变,其中与2010年四川温江的分离株（GenBank No.KP461138）相比突变位点较少,仅有4处点突变;与WHO推荐的疫苗株Influenza B/Utah/08/2014相比,有2个氨基酸位点发生了变异,分别为L176Q和M255V,但突变没有处于HA1上的抗原决定簇区域。其中176位点是一个全新的突变,以往四川流行毒株、Yamagata系的代表毒株Influenza B/Yamagata/16/88及WHO推荐的疫苗株Influenza B/Utah/08/2014的HA1 176位点均为亮氨酸（L）,而本研究病例感染的乙型流感毒株HA1 176位点突变为谷氨酰胺（Q）。结论 成都地区驻地部队2017-2018流行季感染的乙型流感病毒HA基因已发生一些突变,但突变尚未造成抗原性的改变。     

蝙蝠蛾拟青霉和中国弯颈霉蛋白质氨基酸分析及质量评价

目的 对蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)和中国弯颈霉(Tol ypocladium sinenis)2种虫生真菌菌丝的蛋白质氨基酸进行含量分析及质量评价,为2种真菌的其他相关研究和应用提供依据.方法 采用盐酸水解法水解菌丝粉,用Agilent 1200高效液相色谱仪C18反相柱梯度进行分离,上柱前加入邻苯二甲醛-氯甲酸芴甲酯(OPA-FMOC)自动衍生化.参照标准品氨基酸,计算待测样品的氨基酸含量.结果 测定了17种蛋白水解氨基酸的含量,其中蝙蝠蛾拟青霉中有4种氨基酸(天冬氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸)的含量高于中国弯颈霉,中国弯颈霉中有11种氨基酸(谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、脯氨酸)的含量高于蝙蝠蛾拟青霉.中国弯颈霉氨基酸总量、必需氨基酸总量、非必需氨基酸总量高于蝙蝠蛾拟青霉,蝙蝠蛾拟青霉支链氨基酸含量高于中国弯颈霉.两者必需氨基酸的模式均符合世界卫生组织和联合国粮农组织(WHO/FAO)提出的必需氨基酸模式谱和参考标准.结论 蝙蝠蛾拟青霉与中国弯颈霉均具有较高的营养价值,但两者的蛋白质氨基酸含量并不等同.     

Fkbp51基因敲除对小鼠肝脏转录组基因可变剪接的影响

目的通过分析Fkbp51基因敲除(knock out,KO)与野生型(wild type,WT)小鼠肝脏表达谱,研究Fkbp51基因敲除对肝脏组织基因可变剪接的影响。方法利用二代测序对Fkbp51 KO与WT小鼠肝脏进行表达谱测序,用Top Hat对RNA测序结果进行可变剪接分析,筛选出KO与WT小鼠肝组织中差异的内含子保留(intron retetion,RI)和外显子跳跃(exon skipping,SE)。通过在线工具DAVID对这些差异可变剪接体进行基因功能(gene ontology,GO)和代谢通路(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析,同时用NCBI基因数据库对这些基因进行注释。结果 (1)Fkbp51缺失可导致小鼠肝脏mRNA可变剪接发生变化;(2)Fkbp51基因敲除造成小鼠肝脏mRNA可变剪接表达量的变化;(3)通过GO与KEGG分析,我们发现这些发生差异可变剪切的基因主要与脂肪相关衍生物的代谢、免疫、胆汁酸分泌等通路相关。(4)与差异内含子保留相关的基因主要与肌动蛋白细胞骨架调控,氨基酸及其衍生物代谢相关。结论 Fkbp51基因敲除能够改变基因组中mRNA的可变剪切,进而影响小鼠肝脏的代谢功能。