流式细胞仪测定巨噬细胞吞噬率方法的建立及其应用

目的　建立流式细胞仪检测人巨噬细胞吞噬功能的方法 ,并探讨其在恶性肿瘤免疫测定中的意义 .方法　采用斑蝥素剌激皮泡法收获巨噬细胞 ,用硝基蓝四唑染色、计数并调整活细胞数 ,制备巨噬细胞悬液 .再加入荧光微球、共孵育 .应用流式细胞仪检测巨噬细胞的荧光阳性细胞数来表示巨噬细胞吞噬率 .结果　流式细胞仪检测巨噬细胞吞噬率与传统的显微镜检计数法比较 ,两者有显著的正相关性 ,P<0 .0 1.结论　流式细胞仪检测人巨噬细胞吞噬功能的方法具有简便、快捷、重复性好以及准确率高的特点 ,适合在临床推广应用 .     

流式细胞仪筛选环磷酰胺诱导骨髓嗜多染红细胞微核的技术方法

目的利用单一荧光试剂吖啶橙(acridine orange,AO)和简单的单激光流式细胞仪(FCM)计数骨髓嗜多染红细胞的微核率,达到了解化合物诱导微核作用的目的。方法分别以环磷酰胺(CP)处理雄性KM小鼠和SD大鼠,采用AO荧光染色和单激光流式细胞仪检测小鼠和大鼠骨髓含微核的嗜多染红细胞(MNPCE)及含微核的成熟红细胞(MNNCE)的微核率,并对结果进行比较分析。结果随着CP浓度的增高,骨髓中MNPCE和MNNCE也相应增多,呈良好的量效关系。实验结果同时和手工计数比较,没有显著差异。结论 AO_FCM自动化检测方法完全适用于小鼠和大鼠骨髓MNPCE及MNNCE微核率的检测。     

用DAPI和Hoechst33342染色法检测DNA的流式细胞方法探讨

目的:探索利用DAPI和Hoechst33342两种荧光染料检测DNA的流式细胞技术.方法:分别用DAPI、Hochest和PI 3种荧光染料标记HT-29细胞,通过流式细胞仪检测其G0/G1期、S期和G2/M期的DNA含量,比较3种方法测定结果.用标准荧光微球和DNA质量控制试剂盒做测试质控.结果:质控实验显示,紫外激光的变异系数(CV)为2.4;DAPI和Hoechst33342标记的小鸡红细胞核(chicken erythrocyte nuclei,CEN)出现4个峰,第2、第3和第4峰所在道数的平均值与第1峰的比值为2、3、4,且第1峰的CV均为2.4.DAPI、Hoechst33342标记小牛胸腺细胞核(calf thymocyte nuclei,CTN)出现2个峰,G2/G1为1.97,且GO/G1峰的CV为2.4.DAPI、Hoechst33342和PI 3种染料标记的HT-29细胞呈现完整的细胞周期峰,结果分别为CV值3.40、3.02和4.42,G0/G1期含量为60.86%、60.22%和60.81%,S期含量为28.85%、29.70%和29.82%,G2/M期含量为10.29%、9.09%和9.37%,3种标记法测定结果一致.结论:本文探索的DAPI和Hoechst33342标记法简单易行,可作为具备紫外激光器的流式细胞仪的首选DNA荧光染料.     

血小板膜糖蛋白自身抗体检测新方法--流式微球技术

目的 建立流式微球技术检测血小板膜表面糖蛋白特异性自身抗体（GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/IX）,探讨其在特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者体内表达情况及其与激素治疗效果之间的关系.方法 取67例ITP患者及30例健康对照组的外周血,分离、裂解血小板与单抗包被微球共同孵育后加入PE标记多克隆抗体,流式细胞仪分析,评价ITP患者激素治疗效果.结果 ITP患者血小板GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/IX自身抗体荧光强度为4.58（0.22～30.20）、4.78（0.56～22.00）,对照组为0.92（0.23～2.28）、0.87（0.22～2.13）.以微球荧光强度比率（测定/对照）CD41a＞0.025%、CD42＞2.12%定为阳性,用流式微球技术同时检测两种抗血小板抗体,诊断ITP敏感性为95.5%（64/67）、特异性为90.9%,阳性预测值为96.7%.ITP患者激素治疗效果与抗体检测结果呈负相关（r=-0.318）.结论 流式微球技术检测血小板膜糖蛋白自身抗体对ITP诊断的敏感性、特异性较高,对治疗及预后也有一定临床指导意义.     

超声联合SonoVue介导荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞的研究

目的 探讨超声协同微泡造影剂SonoVue介导荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞的方法.方法 以不同的超声辐照时间、超声机械指数和不同浓度的微泡造影剂SonoVue的参数组合,将含有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N1转染人胚肾293T细胞,接种于6孔板中,以荧光显微镜观察观察293T细胞中的绿色荧光蛋白表达情况并用流式细胞仪测算转染率.结果 当微泡造影剂SonoVue浓度为40%、超声机械指数为1.0、辐照时间5 min时,质粒的转染率最高(28.11±1.63)%.结论 超声联合微泡造影刺SonoVue能够作为载体介孚质粒转染细胞,但需优化各项超声辐照的条件以达到最佳效果.     

碱性成纤维细胞生长因子缓释微球对雪旺细胞作用的实验研究

目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）缓释微球对雪旺细胞的作用。方法 培养雪旺细胞，将bFGF、bFGF-聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球（PLGA微球）和bFGF-聚乳酸-聚乙二醇共聚物微球（PELA微球）分别加入三个组的雪旺细胞培养液中。用细胞计数法测定雪旺细胞的数量，四甲基偶氮唑盐微量反应比色法（MTT法）测定雪旺细胞的活力，流式细胞仪测定雪旺细胞的细胞周期。结果 培养1、2d时，bFGF组的雪旺细胞计数、活力明显高于PLGA微球组和PELA微球组；培养3、4d时，bFGF组和PLGA微球组的雪旺细胞计数、活力明显高于PELA微球组；培养6、8d时．PLGA微球组的雪旺细胞计数、活力明显高于bFGF组和PELA微球组。流式细胞仪检测结果显示，培养2d后，bFGF组的Gz／M＋S期百分数最高；培养4、8d后，PLGA微球组的G2／M＋S期百分数最高，差异具有统计学意义。结论 游离bFGF对雪旺细胞促分裂增殖作用效应期短，而PLGA微球能在较长时期内促进雪旺细胞的分裂增殖，PELA微球虽然达到了缓释的性能要求，但释放出的bFGF的生物活性受到了破坏。     

流式细胞仪自动化快速初筛环磷酰胺诱导微核作用的研究

目的 利用单一荧光试剂吖啶橙（acridine orange, AO）和简单的单激光流式细胞仪计数骨髓嗜多染红细胞细胞的微核率,达到了解化合物诱导微核作用的目的。方法 采用经典的染色体断裂剂环磷酰胺(cyclophosphamide, CP)腹腔注射小鼠和大鼠,24h后采集骨髓细胞,经过固定和吖啶橙（acridine orange, AO）荧光染色,利用单激光流式细胞仪计数微核,计数结果用WinDMI软件进行分析,作出等高图并设置窗口。结果 随着CP浓度的增高,骨髓细胞的含微核的嗜多染红细胞（micronucleated PCE, MNPCE）也相应增多,呈良好的量效关系。实验结果同时和手工计数比较,没有显著差异。结论 采用单一荧光染色（AO染色）和单激光流式细胞仪快速初筛化合物诱导微核作用是可靠的,较传统的手工方法更为灵敏,并节省了大量时间和成本,操作也更为简单。     

荧光磁性纳米粒子体外标记骨髓间充质干细胞研究

目的:探索高效体外示踪骨髓间充质干细胞体系的方法。方法:采用贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞CD29、CD90和CD45表达情况,用诱导剂诱导干细胞检测骨髓间充质干细胞的分化能力,采用普鲁士蓝染色,用激光共聚焦显微镜、磁共振成像仪观察荧光磁性纳米粒子标记的干细胞体外成像效果。结果:流式细胞仪检测CD29、CD90和CD45阳性表达率分别为84.69%、90.28%和0.72%;碱性磷酸酶染色和油红O染色结果均表明骨髓间充质干细胞成功分化为成骨细胞和脂肪细胞;普鲁士蓝染色、激光共聚焦显微镜成像和磁共振成像表明荧光磁性纳米粒子标记的骨髓间充质干细胞具有很好的成像效果。结论:荧光磁性纳米粒子作为示踪剂可以在体外标记骨髓间充质干细胞,为干细胞研究提供新思路。     

孕妇外周血中胎儿有核红细胞的富集

目的 :从孕妇外周血中分选富集出胎儿有核红细胞 ,以便用于无创伤性产前诊断。方法从 32例孕 11～ 2 0周的孕妇血中用Histopaque 10 77密度梯度离心富集以及流式细胞仪计数出胎儿有核红细胞 ,并用喹吖因荧光染色检测Y 染色体以及用PCR检测Y -染色体DNA特异序列。结果流式细胞仪计数 ,每毫升孕妇外周血中计数到 0 .93× 10 3 ～ 8.11× 10 3 个GPA阳性细胞 ;PCR结果与产后性别证实 ,符合率为 90 .0 6 %。结论孕妇外周血中的胎儿有核红细胞经密度梯度离心和流式细胞仪分离后 ,可得到一定程度的富集和纯化 ,11～ 2 0周内FNRBCs数与孕期似无相关性 ,为非创伤性产前诊断提供实验数据与方法基础     

超声微泡造影剂介导LMP-1基因转染树突状细胞的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂介导LMP-1基因转染外周血来源的树突状细胞的有效性及最佳的超声辐照参数.方法 体外培养树突状细胞,在不同的超声波强度、机械指数、照射时间及不同的超声微泡造影剂浓度作用下,观察LMP-1基因与绿色荧光蛋白共表达的融合重组质粒pEGFP-C3-LMP1在树突状细胞的定向转染.在荧光显微镜下观察荧光蛋白质粒在树突状细胞中的表达,流式细胞仪评价重组质粒的转染效率,台盼蓝染色检测细胞活性.结果 超声辐照机械指数1.0、照射时间60 s、微泡造影剂浓度为20%,达到最佳的基因转染效率(14.37±2.12)%,且细胞生存率>90%.结论 微泡造影剂在超声辐射下可以有效地介导基因转染树突状细胞.