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相似文献
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1.
目的:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G蛋白偶联受体相关分选蛋白2(G protein?coupled receptor associated sorting protein 2,GPRASP2)基因敲除的猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF),为构建GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型提供相应的供体细胞。方法:采用生物信息学方法对人与猪GPRASP2基因进行亲缘性和同源性分析,预测人与猪GPRASP2基因编码的氨基酸序列和蛋白二级结构;设计合成靶向巴马猪GPRASP2基因编码区上游和下游的单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以pX330质粒为载体,构建含有Cas9骨架的重组打靶质粒,并将此重组质粒转染至PFF中,G418药物筛选阳性单克隆细胞,测序分析其基因型。结果:生物信息学分析提示人/猪GPRASP2亲缘关系相近,同源性较高,且主要功能结构域Arm2的二维和三维结构相似。构建了靶向猪GPRASP2基因的重组打靶质粒并转染PFF,通过药物筛选、基因型分析和Western blot验证,成功获得GPRASP2基因敲除单克隆PFF。结论:人/猪GPRASP2基因亲缘关系相近且高度同源;采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术成功构建GPRASP2基因敲除的单克隆PFF,为建立GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型奠定了前期基础。  相似文献   

2.
目的:利用CRISP/Cas9基因编辑技术建立巴马小型猪F9基因敲除的胚胎成纤维(porcine fetal fibroblast,PFF)细胞系,为后续构建血友病乙巴马小型猪模型提供原材料。方法:首先通过生物信息学方法对人和猪F9基因同源性进行分析,模拟并分析人和猪FⅨ二级、三级结构的相似性;其次选取猪F9基因的第2外显子为敲除靶点,利用CRISPR在线靶点设计工具(http://www.e?crisp.org/E?CRISP/designcrispr.html)设计并合成单链向导 RNA(single guide RNA,sgRNA),以pX330质粒为骨架构建打靶载体,同G418抗性质粒一同转染至野生巴马小型猪的PFF中,经药物G418筛选获得抗性单细胞克隆,测序并鉴定其基因型。结果:生物信息学分析表明人和猪的F9基因具有较近的遗传距离,FⅨ的氨基酸序列相似值为83.33%,三维结构的均方根偏差(root mean square deviation,RMSD)值为0.149。成功构建打靶载体并转染PFF细胞,药筛后共获得55个单细胞克隆,经过测序显示有25个单细胞克隆的F9基因发生突变,计算敲除率为45.5%。结论:人和猪F9基因具有高度同源性;构建的Cas9/sgRNA 表达载体可以高效编辑PFF中的F9 基因。最终获取F9基因敲除的单细胞克隆,为构建乙型血友病巴马小型猪模型奠定了重要的前期工作基础。  相似文献   

3.
目的:利用干细胞囊胚互补技术再生同种或异种动物器官已得到验证,其重要的前提是需要构建出相应的器官缺失动物模型。本文拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪Six1单基因和Six1/Six4双基因敲除猪细胞系,为构建肾脏发育缺陷和缺失猪模型奠定重要的研究基础。方法:选取猪Six1基因和Six4基因第一外显子为敲除靶点,分别设计并合成单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),将其插入含有Cas9骨架的PX330质粒,分别构建Six1基因和Six4基因敲除打靶载体PX330?sgRNA1和PX330?sgRNA4;用T7EN1酶验证打靶载体敲除效率后,将高效打靶载体与含G418抗性的质粒(pCMV?tdTomato)共转染原代猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)中,并通过药物筛选获得单克隆细胞群落,随后对单克隆细胞进行基因型鉴定。结果:分别成功构建Six1和Six4基因的Cas9/sgRNA表达载体。转染Six1基因打靶载体经药物筛选后,利用PCR方法鉴定所获得的Six1基因敲除单克隆细胞系48个,其中Six1-/-细胞系21个。通过同样方法同时转染Six1基因和Six4基因打靶载体,经药物筛选后共获得44个单克隆细胞系,其中Six1-/- Six4-/-细胞系为13个。结论:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术可高效获得Six1单基因敲除细胞系和Six1/Six4双基因敲除细胞系,为构建肾脏发育缺陷猪动物模型提供了基础,并有助于研究Six1和Six4基因在猪肾脏发育中的功能。  相似文献   

4.
目的:基于CRISPR/Cas9技术构建猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)OSBPL2敲除细胞系,为构建小型猪致聋基因缺陷动物模型奠定重要的前期工作基础。方法:首先通过生物信息学方法对人与猪OSBPL2基因共线性和同源性进行分析,预测并模拟人与猪OSBPL2蛋白质二级、三级结构。其次,设计合成靶向猪OSBPL2第5、6外显子设计单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以pX330质粒为载体,构建含有Cas9骨架的重组载体,转染至猪PFFs中,G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后,T7EN1酶切实验检测靶向效率,序列分析检测单克隆细胞基因型。结果:生物信息学分析结果表明人与猪的OSBPL2在染色体上具有较好的共线性关系,蛋白质氨基酸同源性高达88%,且具有相似的功能结构域。成功构建打靶OSBPL2基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染PFFs细胞,药物筛选获得OSBPL2基因双敲的单细胞克隆并测序证实了基因突变型。结论:人和猪OSBPL2基因具有高度的同源性。构建成功的Cas9/sgRNA表达载体在PFFs中预期实现了OSBPL2基因编辑并获得基因双敲的单细胞克隆,为后续OSBPL2基因敲除猪模型构建提供了必需的实验材料。  相似文献   

5.
目的利用CRISPR/Cas9技术稳定敲除人口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)细胞系HSC-3中的TGFBI基因。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计能特异性针对于TGFBI外显子3上下游的小向导RNA(small guide RNA, sgRNA),并以PX330质粒为骨架构建能表达此sgRNA的真核重组质粒。将此质粒以及PGK-puro质粒共转染HSC-3细胞,用嘌呤霉素抗性筛选细胞克隆,并用PCR、核酸电泳和测序初步确定基因敲除情况,再通过实时荧光定量PCR及免疫印迹法确认细胞中TGFBI的mRNA和蛋白水平的表达变化情况。结果通过CRISPR/Cas9技术,HSC-3中的TGFBI基因外显子3的核苷酸序列已被完全敲除。免疫印迹法检测显示,相对于HSC-3,TGFBI敲除细胞中无法检测到TGFBI蛋白的表达。同时,通过RT-qPCR对部分基因进行检测,发现一系列与细胞周期和上皮间充质转化相关基因表达发生了改变(P<0.05)。结论通过CRISPR/Cas9技术成功获得了TGFBI基因敲除的HSC-3细胞系,为进一步研究TGFBI在OSCC中的作用及其机制提供了理论基础。  相似文献   

6.
目的为研究胰岛素受体底物1(Irs1)基因与代谢病之间的关系,我们利用CRISPR/Cas9系统敲除大鼠Irs1基因,为研究代谢病提供基因敲除大鼠。方法针对Irs1第一外显子,设计CRISPR/Cas9作用靶点,构建sgRNA表达质粒。利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9。将Cas9 mRNA和sgRNA混合物注射入SD大鼠的受精卵中,实现靶基因敲除。用T7EN1实验初步检测靶基因的修饰情况,再经过测序分析确定突变。结果获得了5个在Irs1基因突变的首建鼠,突变效率为83%。结论得到了稳定遗传的Irs1基因敲除大鼠。  相似文献   

7.
目的:探讨人血型抗体IgG、IgM对基因修饰猪外周血PBMC和RBC的结合和杀伤差异,为猪-人异种肾移植临床应用的供体猪血型选择提供理论依据。方法:抽取20例健康正常人、20例终末肾病患者和20例脑死亡器官捐献者血清,并根据ABO血型分成4组(A血型:n=20;B血型:n=17;AB血型:n=7;O血型:n=16)。用流式细胞术检测4组人血清分别与O血型野生型(WT)、α1、3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)、胞苷酸N-乙酰神经氨酸羟化酶基因敲除(GTKO/β4GalNT2KO)、β1、4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶2基因敲除(GTKO/CMAHKO)和3种基因敲除(TKO/hCD55)猪外周血单个核细胞(PBMC)和红细胞(RBC)的抗体结合或补体依赖的细胞毒性试验(CDC)。结果:A血型、B血型、AB血型和O血型人血清抗体IgM和IgG分别对WT猪PBMC,GTKO猪PBMC,GTKO/β4GalNT2KO猪PBMC,GTKO/CMAHKO猪PBMC,TKO/hCD55猪PBMC的结合和杀伤无明显差异。A血型、B血型、AB血型和O血型人血清抗体分别对WT猪RBC,GTKO猪RBC...  相似文献   

8.
目的:为了检测CRISPR/Cas9系统的潜在脱靶效应,分别利用野生型Cas9和切口酶Cas9?D10A构建了RNA甲基转移酶Nsun5基因敲除小鼠模型,并对两种策略得到的F0小鼠进行脱靶分析,以比较两种敲除策略的特异性。方法:针对Nsun5基因第3外显子,设计1对sgRNA,将野生型Cas9 mRNA和切口酶Cas9?D10A mRNA分别同这对sgRNA混合后注入小鼠一细胞期受精卵中,实现靶基因敲除,比较两种Cas9得到的F0代敲除小鼠的脱靶效应。结果:利用CRISPR/Cas9和Cas9?D10A成功建立Nsun5基因敲除小鼠模型,对两种Cas9得到的F0代突变小鼠进行潜在脱靶位点分析,均未检测到脱靶位点的存在。结论:两种策略都成功构建了不含脱靶位点的Nsun5基因敲除小鼠模型,为进一步研究Nsun5的生物学功能打下基础。  相似文献   

9.
目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除成体神经干细胞(neural stem cell,NSC)PIN1基因,建立PIN1基因敲除的成体神经干细胞系。方法:取8周龄C57BL/6小鼠脑室下区的脑组织进行体外培养;设计靶向小鼠PIN1基因的单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以PX330质粒为骨架,构建PIN1的Cas9打靶载体,转染小鼠的成体神经干细胞,通过puro筛选和测序鉴定获得PIN敲除的单克隆细胞;利用免疫荧光染色和Western blot测定PIN1蛋白表达水平,免疫荧光染色鉴定神经干细胞的特征性标志物巢蛋白(Nestin)的表达,Beta Ⅲ Tubulin免疫荧光染色鉴定神经干细胞分化为神经元的能力。结果:成功构建PIN1基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染后获得PIN1敲除的神经干细胞克隆9个。免疫荧光染色及Western blot显示PIN1蛋白无表达,免疫荧光染色显示PIN1敲除的神经干细胞Nestin阳性,神经干细胞分化培养时可部分分化为Beta Ⅲ Tubulin阳性的神经元细胞。结论:CRISPR/Cas9基因编辑技术可实现对小鼠成体神经干细胞PIN1基因的编辑。在PIN1基因敲除后PIN1蛋白无表达,初步表型分析显示,神经干细胞仍表达特征性标志物Nestin,并具有向神经元分化的能力。  相似文献   

10.
目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立SERPING1-/-猪胎儿成纤维细胞(PFFs)系,为构建遗传性血管性水肿模型提供细胞实验材料。方法 首先比较人/猪SERPING1氨基酸同源性。其次,分析猪SERPING1基因有效的编码区,据此选择第八外显子为敲除靶点,设计并合成靶向猪SERPING1的单导向RNA(sgRNA),连接到含有Cas9核酸内切酶的pX330载体上,构建SERPING1打靶载体pX330sgRNA,将其转染至猪胎儿成纤维细胞中,G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后,用T7E1酶切实验检测靶点编辑情况,测序验证单克隆细胞基因型。结果 生物信息学分析结果提示人/猪SERPING1蛋白氨基酸同源性较高,氨基酸比对相似性达到65.87%。成功构建打靶SERPING1的载体,并转染到细胞,药物筛选获得SERPING1基因敲除的单克隆细胞,测序确认了突变的基因型。结论 人/猪SERPING1蛋白同源性较高,适合用于构建遗传性血管性水肿模型。构建的Cas9/sgRNA表达载体实现了SERPING1基因编辑,获得基因敲除的单细胞克隆,为后续SERPI...  相似文献   

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