PAI－1糖基化位点突变体的构建及其在哺乳动物细胞中表达

Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂（ＰＡＩ－１）是一种Ｍｒ为５０×１０３的单链糖蛋白，有３７９个氨基酸残基，３个Ｎ型糖基化位点。构建ＰＡＩ－１糖基化突变体，以便研究糖链的功能。用寡核苷酸定位突变技术将３个糖基化位点２０９，２６５，３２９位进行突变，把３个糖基化位点都发生了突变的ＰＡＩ－１ｃＤＮＡ组装到真核表达载体ｐＳＶ２中，得到真核表达质粒ｐＺＨ－ｐ１－Ｍ３Ｅ；在二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯｄｈｆｒ－）中进行短暂表达，用发色底物法和夹心ＥＬＩＳＡ方法检测培养液中ＰＡＩ－１的活性和含量。结果：糖基化位点突变的ＰＡＩ－１能在ＣＨＯ细胞中表达，但表达水平及活性较低。非糖基化ＰＡＩ－１的活性和抗原分别为４．３４ＩＵ／ｍｌ和３．１５μｇ／Ｌ结论：用寡核苷酸定位突变方法获得了ＰＡＩ－１糖基化突变体，并且在ＣＨＯ细胞中得到表达。     

人类重组红细胞生成素作用的研究进展

人类重组红细胞生成素（ｒＨｕＥＰＯ）是利用ＤＮＡ重组技术人工合成的激素，它的产生，标志着贫血治疗的一个新阶段，目前ｒＨｕＥＰＯ已成为治疗肾性贫血的首选药物。近年来随着对ｒＨｕＥＰＯ研究的不断深入，人们对ｒＨｕＥＰＯ在慢性肾功能衰竭（ＣＲＦ）患者中的临床作用又增添了许多新的知识。下面就这些研究进展作一简述。１ 对红细胞质量及免疫功能的影响 研究表明ＣＲＦ患者氧自由基脂质过氧化物（ＬＰＯ）水平、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性、红细胞膜Ｎａ＋－Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ活性　，经ｒＨｕＥＰＯ治疗后，不但ＬＰＯ、ＳＯ…     

维生素C和维生素E治疗糖尿病前后氧自由基水平的变化

测定了３１例非胰岛素依赖型糟尿病（ＮＩＤＤＭ）患者，维生素Ｃ、维生素Ｅ治疗前后的血浆过氧化脂质（ＬＰＯ）水平、全血谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－ＰＸ）及红细胞超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性并与正常人进行了比较。结果表明ＮＩＤＤＭ患者治疗前后ＬＰＯ水平高于正常人组，ＧＳＨ－ＰＸ／ＬＰＯ、ＧＳＨ－ＰＸ及ＳＯＤ活性明显低于正常人组；糖尿病组治疗前与治疗后比较，后者ＬＰＯ水平下降，ＧＳＨ－ＰＸ／ＬＰＯ、ＧＳＨ－ＰＸ及ＳＯＤ活性升高。结果提示氧自由基（ＯＦＲ）参与糖尿病的病变过程。     

EXPRESSION OF HLA－CLASS Ⅱ GENES OF IDDM PATIENTS ON THE SURFACE OF THE LTK~－ CELLS

ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＯＦＨＬＡ－ＣＬＡＳＳⅡＧＥＮＥＳＯＦＩＤＤＭＰＡＴＩＥＮＴＳＯＮＴＨＥＳＵＲＦＡＣＥＯＦＴＨＥＬＴＫ~－ＣＥＬＬＳ￥ＷａｎｇＨｅｎｇ（王姮）ａｎｄＳｕｎＱｉ（孙琦）（ＰＵＭＣＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣＡＭＳ＆ＰＵＭＣ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１?..     

NON-PERFUSION COLD STORAGE METHOD FOR TOTAL THYROID-PARATHYROID PRESERVATION

ＮＯＮ－ＰＥＲＦＵＳＩＯＮＣＯＬＤＳＴＯＲＡＧＥＭＥＴＨＯＤＦＯＲＴＯＴＡＬＴＨＹＲＯＩＤ－ＰＡＲＡＴＨＹＲＯＩＤＰＲＥＳＥＲＶＡＴＩＯＮ￥ＣｈｅｎＹｕｘｉｎ（陈雨信）（Ｄｅｐｔ．ｏｆＳｕｒｇｅｒｙ，ＴａｉｓｈａｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ）Ａｂｓ...     

人端粒重复序列结合因子1^33—277在大肠杆菌中的？…

目的：建立能高效表达人端粒重复序列结合因子１第＾３３－２７７位（ＴＲＦ１＾３３－２７７）氨基酸的菌株并制备多抗。方法：设计一对引物,分别带有Ｋｐｎ Ｉ和ＥｃｏＲＩ位点,从已经克隆了ＴＲＦ１ｃＤＮＡ全长的重组质粒ｐＣＲⅡ－ＴＯＰＯ－ＴＲＦ１扩增ＴＲＦ１＾３３－２７７ｃＤＮＡ片段,克隆入ＰＧＥＭ－Ｔ质粒,测序和酶切图谱鉴定,ＥｃｏＲＩ酶切后亚克隆入ｐＧＥＸ－３Ｘ的ＥｃｏＲＩ位点之间,筛选在向插入重组子     

L－精氨酸／一氧化氮抗动脉粥样硬化的研究进展

Ｌ－精氨酸／一氧化氮抗动脉粥样硬化的研究进展ＡＤＶＡＮＣＥＳＩＮＳＴＵＤＹＯＦＬ－ＡＲＧＩＮＩＮＥ／ＮＩＴＲＩＣＯＸＩＤＥＡＧＡＩＮＳＴＡＴＨＥＲＯＳＣＬＥＲＯＳＩＳ张金盈综述（河南医科大学第一附属医院心内科郑州４５００５２）１９８０年Ｆｕｒｃｈｇｏ...     

大鼠小肠缺血／再灌注休克中一氧化氮,内皮素检测及意义

目的：观察一氧化氮（ＮＯ）对大鼠小肠缺血／再灌注（Ｉ／Ｒ）的作用及内皮素的改变。方法：复制内脏血管阻塞（ＳＡＯ）性休克模型,用左旋精氨酸（Ｌ－Ａｒｇ）及硝基精氨酸甲脂（Ｌ－ＮＡＭＥ）处理动物模型后分别测定血浆中ＥＴｓ、ＭＤＡ、组织蛋白酶Ｄ（ＣＤ）、ＮＯ－２／ＮＯ－３含量。结果：Ｌ－Ａｒｇ减缓了大鼠Ｉ／Ｒ血压下降（Ｐ＜０．０１）,降低了血浆ＭＰＯ、ＬＤＨ、ＣＤ、ＭＤＡ的含量（Ｐ＜０．０１）及肠组织中伊文思蓝（ＥＢ）的含量（Ｐ＜０．０５）;Ｌ－ＮＡＭＥ与Ｌ－Ａｒｇ相反。ＭＰＯ与ＥＢ正相关（Ｐ＜０．０１）,ＮＯ－２／ＮＯ－３与ＥＴｓ负相关（Ｐ＜０．０５）。结论：ＮＯ对小肠Ｉ／Ｒ损伤有保护作用,ＥＴｓ参与ＳＡＯ休克过程。     

一种新Pre-S(2)合成肽CTL表位糖基化方法

目的 为研究ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ（２）上糖基化（Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）结构差异（包括位置、种类、数量和糖链长度差异）与其生物学活性关系,建立一种Ｎ－或Ｏ－连接糖基化以外的合成肽α－和ε氨基糖基化方法。方法 用化学方法将单、双和聚糖共价连接在Ｐｒｅ－Ｓ（２）合成肽上的含α－和ε－氨基的氨基酸残基上,即具体连接在肽Ｎ端Ｍ１的α－氨基和Ｋ１６的ε－氨基上。此二氨基酸残基位于或接受Ｐｒｅ－Ｓ（２）上公     

神经系统疾病患者血清和脑脊液髓鞘碱性蛋白及其抗体的ELISA定量研究

用简易的髓鞘碱性蛋白（ＭＢＰ）及其抗体（Ａｎｔｉ－ＭＢＰ）酶联免疫吸附定量测定（ＥＬＩＳＡ）法对６组共３３７例神经系统疾病患者进行检测，其中脊髓压迫症（ＣＭＰ）３６例，多发性硬化（ＭＳ）３３例，脑血管疾病（ＣＶＤ）３４例，中枢神经系统感染性疾病（ＩＤ）３１例，癫痫（ＥＰ）１６１例和其他神经系统疾病（ＯＮＤ）４２例。结果显示：ＣＭＰ、ＭＳ．ＣＶＤ、ＩＤ和ＥＰ５组血清ＭＢＰ均值明显高于ＯＮＤ组（Ｐ＜０．０１），其中又以急性外伤所致脊柱骨折伴截瘫为主（３３例）的ＣＭＰ患者血清ＭＢＰ值最高，与ＭＳ组比较Ｐ＜０．０５，与ＣＶＤ、ＩＤ和ＥＰ组比较Ｐ＜０．０１。ＣＶＤ患者ＣＳＦＭＢＰ均值也明显高于ＯＮＤ组（Ｐ＜０．０５）。本法检测６组血清和ＣＳＦ的Ａｎｔｉ－ＭＢＰ含量差异不显著（Ｐ＞０．０５）。     

UFLC-MS/MS法分析蜈蚣中3种多肽成分以及在蜈蚣鉴别中的应用

  目的  建立超高效液相色谱-质谱联用(UFLC-MS/MS)法分析蜈蚣中3种酶解多肽成分TD1(LEEDLERSEERL)、TD2(EEKDKALQNAEGEVAAL)、TD3(MILPTGASSF), 比较不同品种蜈蚣中肽类成分的差异, 寻找蜈蚣特异性多肽, 用于蜈蚣的鉴别。  方法  3种肽类成分的UFLC-MS/MS法, 色谱柱为XSelect HSS T₃(4.6 mm×150 mm, 3.5 μm); 流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液,梯度洗脱。采用三重四极杆质谱检测器, 电喷雾离子化(ESI), 正离子模式下多反应监测(MRM)进行信号采集。样品采用正交试验方法, 对蛋白提取方法进行优化, 最终确定提取方法为蛋白裂解液超声处理60 min。得到的蜈蚣蛋白提取溶液经胃蛋白酶酶解并脱盐后, 注入液质联用仪分析。测定了20批蜈蚣及8批其他动物药中3种肽类成分, 并对结果进行比较。  结果  在地龙、僵蚕、水蛭、土鳖虫和全蝎中未检出TD2和TD3, TD1与TD2在少棘巨蜈蚣与哈氏蜈蚣、墨江蜈蚣中存在较大差异, TD3在少棘巨蜈蚣与黑头蜈蚣、多棘蜈蚣中有较大差异。  结论  该方法可用于区分少棘巨蜈蚣与地龙、僵蚕、水蛭、土鳖虫和全蝎, 同时通过比较3种肽段的差异, 区分药典品种少棘巨蜈蚣和4种常见非药典品种蜈蚣, 为蜈蚣的质量评价和基础研究提供参考。      

突变的肝细胞生长因子受体被肝癌细胞HLA-A2分子递呈的实验研究

目的 寻找肝癌细胞抗原肽。方法 应用细胞膜酸洗技术使抗原肽从人肝癌细胞膜表面脱落,经过凝胶层析,应用反相高效液相色谱层析得到不同组份多肽。细胞表位重建及生物学鉴定确定其活性,高效液相色谱－质谱仪联用技术获得抗原肽的一经结构,在互联网上进行氨基酸同源性分析确定其同源性序列。结果 经过反相高效液相色谱层析后可以获得20多个多肽组份,生物活性鉴定有2个活性组份,其中1个组分经过液 质联用鉴定和氨基酸同源性分析,确定其序列为SLIVHLNEV,是肝细胞生长因子受体前体第1175－1183肽段发生突变,第1180位点的苯丙氨酸变为亮氨酸。结论 液质联用技术为寻找抗原肽的有效方法,肝细胞生长因子受体突变体SLIVHLNEV为肝癌抗原体。     

肉桂提取物醇质体透皮吸收研究

目的 合成一长链肽47肽。方法 采用Fmoc/t-Bu正交保护多肽固相合成策略,使用9-芴甲氧羰基（Fmoc）保护氨基酸的α-氨基,用Liberty微波多肽合成仪,每个耦合循环用20%哌啶脱除Fmoc保护基团,连续添加氨基酸,并用茚三酮法检测反应终点,有效检测反应的进度,最后用82.5%的三氟乙酸将多肽从树脂上切割下来,得到47肽粗品。经过反相高效液相制备系统纯化得到多肽纯品,用反相高效液相分析仪和傅里叶高分辨质谱仪验证该产物。结果 高分辨质谱仪验证了该产物,纯品质量分数达98%。结论 微波可促进多肽特别是长链肽的合成。     

核壳型Fe3O4@PDA@Au纳米材料对水牛角含巯基肽类成分的富集研究

目的?通过制备核壳型Fe₃O₄@PDA@Au纳米材料对水牛角中含巯基（-SH）肽类成分进行富集、鉴定与表征。方法?采用种子生长法制备核壳型Fe₃O₄@PDA@Au磁性纳米材料,将材料应用于水牛角提取液含-SH肽类成分的富集;分别采用Ellman法和多肽试剂盒测定富集前后溶液中-SH及多肽的含量;采用nano LC-MS/MS系统分析鉴定水牛角提取液肽类组成。结果?Fe₃O₄@PDA@Au纳米材料对水牛角含-SH肽类成分的富集因子为23.41,水牛角提取液中共鉴定了4?114个肽段,其中含有半胱氨酸（Cys）的肽段共11个;富集液中共鉴定了2?254个肽段,其中含有Cys的肽段共709个,富集后的含Cys的肽段与总肽段的比值从0.003增加到0.314,表明材料对水牛角提取物中含-SH肽段完成了较好的富集。结论?Fe₃O₄@PDA@Au纳米材料对水牛角中含巯基肽类成分具有良好的富集效果,对水牛角功效物质基础研究具有重要意义。      

梅毒螺旋体溶血素生物信息学分析

目的本研究旨在对梅毒螺旋体(Tp)的5种溶血素进行进一步的生物信息学分析,为后续研究溶血素家族蛋白在Tp致病过程中的致病机制提供依据。 方法通过使用NCBI、BLAST、CDD、BioEdit、ExPASy、SignalP、TMHMM、MEGA、PSORTb 3.0、ABCpred等生物信息学分析方法分析梅毒螺旋体溶血素家族蛋白的一般性质、信号肽、糖基化、磷酸化位点、亚细胞位置、二级结构、功能结构域及抗原表位。 结果预测了Tp中5个溶血素家族蛋白一般性质,Tp1037功能结构域不同于其余4种,Tp0028含有1个信号肽,Tp0027含有1个糖基化位点,Tp0027和Tp1037有多个跨膜结构域,5个溶血素家族蛋白均含有多个磷酸化位点和B细胞、T细胞表位。 结论Tp含有5个溶血素家族蛋白基因,提示Tp入侵宿主时这些基因产物极有可能通过其膜成孔毒性损伤靶细胞,从而致病。     

酶法糖基化合成一种新型补骨脂定葡萄糖苷

目的为提高补骨脂定的水溶性和稳定性,用体外酶法糖基化反应对其进行结构修饰。方法通过UDP-糖基转移酶对补 骨脂定进行糖基化修饰,合成一种新的葡萄糖苷化合物（1）。使用高分辨电喷雾电离质谱（HR-ESI-MS）和核磁共振（NMR）分 析,鉴定化合物1的结构;利用高效液相色谱峰面积计算出样品溶液的浓度;MTT法检测化合物对3种肿瘤细胞（SMMC7721、 MCF-7、SW480）增殖的影响。结果根据波谱分析,鉴定制备出的新型葡萄糖苷化合物为psoralidin-6’,7-di-O- β-D-glucopyranoside（1）。水溶性检测结果表明,化合物1的水溶性是底物（补骨脂定）水溶性的32.6倍。此外,化合物1在pH 8.8和高温条件下较补骨脂定更加稳定。在抗肿瘤细胞增殖实验中,只有补骨脂定对3种肿瘤细胞都显示出较强的抑制能力。 结论体外酶法糖基化是进行结构修饰、改善水溶性和稳定性的强有力方法。     

蝎毒素BmK M2的分离鉴定及其电生理活性研究

从东亚钳蝎蝎毒中分离鉴定出新型的Na⁺通道毒素,采用Sephadex-G-50分子筛、高效液相色谱、多肽指纹图谱及氨基酸测序等技术从野生东亚钳蝎毒液中分离鉴定了一种长链多肽毒素BmK M2,其相对分子质量为7 235.5,由64个氨基酸组成,包含4对二硫键。序列比对显示,BmK M2的序列与已发现的Na⁺通道毒素BmK M1、BmK M3、BmK M9等具有较高的序列和结构相似性,是一种潜在的新型Na⁺通道调节剂。全细胞膜片钳实验结果显示,BmK M2可显著增强电压门控Na⁺通道Nav1.7的激活,延迟Nav1.7的稳态失活及关闭状态失活,但对Nav1.8无活性。实验结果表明BmK M2可作为一种新型的Na⁺通道探针,用于Nav1.7结构功能研究以及靶向药物的开发。     

新型甲型H7N9流感病毒血凝素基因进化分析

目的探讨2013年4月流行的新型甲型H7N9禽流感病毒的表面蛋白血凝素(HA)基因的进化,以及氨基酸的变异情况。方法从美国国家生物技术信息中心(NCBI)和全球禽流感基因共享数据库(GISAID)中下载H7N9流感病毒以及有代表性的H7N2、H7N3、H7N7亚型流感病毒的HA基因序列,运用Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)version 5.05软件进行序列分析,用邻接法构建基因进化树;通过氨基酸序列分析HA蛋白受体结合位点、糖基化位点和裂解位点的变化。结果 2013年新型甲型H7N9流感病毒与2011年浙江禽类H7N3流感病毒株(JQ906573.1)的相似性达到95.3%～95.6%;受体结合位点氨基酸发生变异,为Q226L,5个糖基化位点高度保守;HA裂解位点位于aa339和aa340之间,仅有1个碱性氨基酸:R。结论 2013年新型甲型H7N9流感病毒HA基因是由中国禽类H7亚型进化而来,Q226L变异导致的受体结合位点的变化可能是新型流感病毒具有人感染性的原因。     

多肽药物关键水解酶体外高通量分析方法的建立

为了建立测定多肽药物体内代谢关键水解酶的高通量分析方法,本研究基于高效液相色谱技术,确定通用的体外酶解反应条件为:pH 7.8或9.0,缓冲体系为0.01 mol/L PBS或50 mmol/L Tris缓冲液,实现对多肽药物关键水解酶的统一高通量体外检测。利用该方法对多肽药物普兰林肽的关键水解酶进行分析,研究结果显示,基肽释放相关酶5和二肽基肽酶4对普兰林肽的水解作用最强,与微量热泳动分析结果一致。因此,本研究所建立的方法可用于分析多肽药物的关键水解酶,为优化多肽药物的酶稳定性提供方法参考与指导。     

瞿麦中环肽化合物的TLC与HPLC鉴别简

目的 建立用高效液相色谱法和薄层色谱法鉴别瞿麦中的环肽化合物的方法.方法 用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别对瞿麦的正丁醇提取物进行萃取,对收集的Ⅱ（15-19）部位经Sephadex LH-20柱色谱分离,Ⅱc部位再次进行硅胶柱色谱分离,其中Ⅱc11为甲醇洗脱部位（204-209）,其中含有环肽成分.结果 高效液相色谱法成功分离出瞿麦中的环肽成分,薄层色谱也显示出环肽的斑点.结论 本实验建立的高效液相色谱条件与薄层的分离鉴别方法适用于初步鉴定瞿麦的环肽成分.