老年医学

随着科学技术的不断发展以及各学科的先进技术的渗透 ,一年来老年医学在衰老和延缓衰老、老年病基础和防治研究方面取得了长足的进步和发展。现简述如下。一、衰老机制和延缓衰老研究衰老机制的研究主要集中在分子水平和免疫水平上。北京大学基础医学院从细胞形态和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交测定端区长度两方面研究 5 氮胞苷处理对人胚肺二倍体成纤维细胞衰老进程的影响 ,结果发现 5 氮胞苷处理使老年细胞衰老表型更为突出 ,其端区长度明显缩短 ,提示甲基化水平降低及其导致的端区缩短的共同作用在细胞衰老过程中发挥重要的作用[1] 。北京…     

甲基化抑制剂5-氮杂胞苷对HL-60细胞增殖及凋亡的影响

目的:观察5-氮杂胞苷对髓系白血病细胞系HL-60的增殖抑制作用,探讨其对细胞周期、细胞凋亡的影响.方法:常规方法培养HL-60细胞,加入不同浓度的5-氮杂胞苷,以MTT法测定对HL-60的抑制作用,计算细胞生长抑制率;流式细胞术检测小剂量5-氮杂胞苷处理HL-60细胞后48 h的细胞凋亡率及细胞周期分布特点.结果:不同浓度5-氮杂胞苷均可以不同程度的抑制细胞生长,且表现为时间、浓度依赖性.在小剂量浓度5-氮杂胞苷处理HL-60细胞48 h后,随着5-氮杂胞苷浓度的增加,凋亡细胞百分比逐渐增多(P<0.05);G1期细胞逐渐增多,S期细胞减少,G2/M期细胞相对增多,细胞阻滞在G1期.结论:5-氮杂胞苷对髓系白细胞细胞系HL-60的生长抑制表现为浓度和时间依赖性,一定剂量的5-氮杂胞苷诱导细胞凋亡,使细胞阻滞在G1期.     

p21Waf1／Cip1甲基化调控细胞衰老

目的：探讨 p21Waf1／Cip1启动子甲基化改变对细胞衰老进程的影响。方法采用克隆、测序的方法定量检测p21Waf1／Cip1启动子在人胚肺二倍体成纤维细胞（2BS）衰老过程中的甲基化改变;RT‐PCR和Western blot检测p21Waf1／Cip1的表达;采用5‐氮杂‐2‐脱氧胞苷去甲基化处理2BS细胞,通过M T T和β‐半乳糖苷酶染色检测细胞衰老。结果 p21Waf1／Cip1启动子在年轻2BS中,CpG甲基化的发生率为1．25％;在中年细胞中为27．27％;在衰老2BS细胞中为0．64％;p21Waf1／Cip1的表达在细胞衰老过程中呈波动性变化,先增加,后降低,到细胞开始衰老时,表达又显著增加;中年2BS细胞经5‐氮杂‐2‐脱氧胞苷处理后,p21Waf1／Cip1表达增加,细胞增殖速率较正常中年细胞显著降低,同时细胞β‐半乳糖苷酶染色阳性率增加。结论 p21Waf1／Cip1去甲基化加速细胞衰老。     

甲基化修饰对宫颈癌细胞凋亡相关蛋白激酶表达的调控

目的 :探讨在 DNA甲基转移酶抑制剂 5 -氮胞苷 ( 5 - azacytidine)的化学干预下 ,宫颈鳞癌细胞 Si Ha和宫颈腺癌细胞 He La中凋亡相关蛋白激酶 ( DAPK)基因与甲基化调控的关系。方法 :培养 Si Ha、He L a,以 1 0μmol/L浓度的 5 -氮胞苷干预细胞。提取细胞RNA,用逆转录聚合酶链反应 ( RT- PCR)方法检测凋亡相关蛋白激酶基因 m RNA的表达。结果 :He La细胞的 DAPK基因用 5 -氮胞苷干预前后无明显变化。 Si Ha中 DAPK基因表达缺失 ,用 5 -氮胞苷处理后 ,Si Ha中 DAPK基因可重新表达。结论 :在不同类型宫颈癌细胞中 DAPK基因的调控有明显差异。 DAPK基因在宫颈鳞癌细胞中的表达受 DNA甲基化调控 ,在腺癌细胞中则不受甲基化调控     

3种结肠癌细胞株中DLC-1基因的表达及其启动子区的甲基化状态研究

目的:研究候选抑癌基因DLC-1在结肠癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态,初步探讨结肠癌细胞株DLC-1基因表达水平与其启动子区甲基化的相关性.方法:采用RT-PCR技术分别检测DLC-1基因在人结肠癌细胞株CaCo-2、HT-29和LoVo中的表达水平;应用甲基化特异性PCR(MSP)方法和亚硫酸氢盐修饰DNA测序检测启动子区域甲基化状态;分别用0、5、10 μmol·L-1浓度的去甲基化药物5氮杂胞苷处理DLC-1基因启动子区域高甲基化状态细胞后,再检测DLC-1基因mRNA表达水平.结果:人结肠癌细胞株CaCo-2和LoVo中DLC-1 mRNA呈阳性表达,HT-29中的表达呈阴性表达;CaCo-2和LoVo细胞DLC-1基因启动子区域未发生甲基化,而HT-29出现启动子区高甲基化状态;经5氮杂胞苷药物干预后,HT-29结肠癌细胞的DLC-1基因表达明显增强.结论:结肠癌细胞株HT-29中DLC-1基因表达沉默与启动子区高甲基化状态有关.     

5-氮杂胞苷对HL60细胞P16、DAPK及MGMT基因甲基化状态影响

目的：通过检测5-氮杂胞苷作用于急性早幼粒细胞白血病细胞系（HL60）细胞前后P16、死亡相关蛋白激酶（Death associated protein kinase,DAPK）及6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O-6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT）基因甲基化状态的改变及基因表达的变化情况,探讨5-氮杂胞苷对髓系白血病细胞系作用的相关机制。方法：采用常规细胞培养,加入5-氮杂胞苷培养48 h后,以甲基化特异性PCR（Methylation specific PCR,MSP）检测基因甲基化状态,以RT-PCR检测药物作用前后基因表达水平。结果：MSP显示用药前P16基因、DAPK基因及MGMT基因呈高甲基化状态,应用5-氮杂胞苷处理后P16及DAPK基因发生了完全去甲基化,MGMT基因在用药后发生了部分去甲基化;应用5-氮杂胞苷处理前后P16、DAPK及MGMT基因表达强度分别是（0.22±0.04）与（0.64±0.12）、（0.36±0.08）与（1.27±0.09）及（0.75±0.1）与（1.37±0.1）,３个基因前后表达强度均有统计学差异（P<0.05）。结论：5-氮杂胞苷通过对P16、DAPK及MGMT甲基化基因的去甲基化作用,使这些基因恢复表达,从而抑制髓系白血病细胞系的增殖,发挥肿瘤细胞增殖抑制作用。     

DR4?DR5基因甲基化对膀胱癌TRAIL耐受的影响研究

目的:探讨膀胱癌细胞中DR4、DR5甲基化状态以及与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)耐受间的关系.方法:采用RT-PCR技术检测膀胱癌T2A细胞、BIU87细胞表面DR4、DR5 mRNA表达,对低表达或无表达DR4、DR5膀胱癌细胞采用甲基化特异性PCR(MSP)检测DR4、DR5启动子甲基化状态.同时应用流式细胞仪检测TRAIL组以及TRAIL+5-氮杂胞苷组细胞凋亡状态.结果:RT-PCR示膀胱癌T24细胞无DR4、DR5表达,MSP法研究显示:DR4、DR5基因呈甲基化状态,对TRAIL诱导的凋亡表现为耐受状态(100 ng/ml TRAIL,凋亡率7.6%),经去甲基化试剂5-氮杂胞苷处理,T24细胞DR4、DR5表达随时间而增加,100 ng/ml TRAIL,凋亡率达29.2%;BIU-87细胞表达DR4、DR5并对TRAIL敏感(100 ng/ml TRAIL凋亡率30.4%),应用5-氮杂胞苷处理BIU87细胞,DR4、DR5表达无差异,100 ng/ml TRAIL,细胞凋亡率31.7%,MSP法检测DR4、DR5基因呈非甲基化状态.结论:膀胱癌T24细胞DR4、DR5启动子区域甲基化与TRAIL耐受有关,去甲基化可逆转上述耐受状态,可为TRAIL的下一步临床应用提供基础研究资料.     

3种胃癌细胞株中GSTP1基因表达及其启动子区甲基化状态的研究

目的研究候选基因GSTP1在胃癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态,初步探讨胃癌细胞株GSTP1基因表达水平与其启动子区甲基化的相关性。方法采用RT-PCR和Western blot技术分别检测GSTP1在人胃癌细胞株MGC803、BGC823和SGC7901中的mRNA和蛋白表达水平。甲基化特异性PCR(MSP)法检测启动子区域甲基化状态。分别用不同浓度的去甲基化药物5-氮杂胞苷处理GSTP1基因启动子区高甲基化状态细胞后,再检测GSTP1基因蛋白表达水平。结果人胃癌细胞株BGC823和SGC7901中GSTP1 mRNA和蛋白呈阳性表达,MGC803中mRNA和蛋白呈阴性表达;BGC823和SGC7901细胞GSTP1基因启动子区域未发生甲基化,而MGC803细胞启动子区呈高甲基化状态;经5-氮杂胞苷药物干预后,MGC803细胞的GSTP1蛋白表达明显增强。结论胃癌MGC803细胞株中GSTP1基因表达沉默与启动子区高甲基化状态有关。     

DNA甲基化异常对mir-615-5p在胰腺癌细胞株PANC-1中表达影响

目的:描述胰腺癌细胞株中DNA异常高甲基化对ndRNA表达抑制所起的作用.观察DNA甲基转移酶抑制剂对miR-615-5p在胰腺癌细胞株PANC-1中甲基化状态和表达的影响.方法:甲基化芯片筛选出在胰腺癌细胞株PANC-1中存在异常甲基化的miRNA.采用去甲基化药物5-氮杂胞苷(5-aza-2-adeoxycyfid...     

5-氮杂胞苷对Eca109细胞增殖及RUNX3基因表达的影响

目的 探讨去甲基化制剂5-氮杂胞苷(5-azaC)干预对Eca109细胞增殖及其抑癌基因RUNX3表达的影响.方法 应用MTT法来观察5-azaC对Eca109细胞增殖的抑制能力;采用10 μmol/L、20 μmol/L和50 μmol/L 3种不同浓度的5-azaC处理Eca109细胞株,采用MSP检测干预前后RUNX3基因启动子区的甲基化状况;应用RT-PCR、Western blotting检测干预前后RUNX3基因的mRNA和蛋白表达水平的变化.结果 Eca109细胞RUNX3基因启动子区处于异常的高甲基化状态,经5-azaC处理后,高甲基化的RUNX3基因启动子部分去甲基化;处理前启动子高甲基化的RUNX3基因其mRNA或蛋白均不表达,去甲基化处理后能重新激活该基因表达,经3种不同浓度5-azaC处理后,Eca109细胞生长减慢.结论 启动子区高甲基化是食管癌Eca-109细胞RUNX3基因失活的主要原因之一, 5-azaC能逆转RUNX3基因甲基化状态, 从而调控RUNX3基因表达并抑制细胞生长.     

端粒定量方法的改进

目的端粒为染色体末端的非编码重复序列，对维持染色体的稳定及细胞复制和死亡具有重要的作用。细胞端粒重复序：列的丢失与衰老和肿瘤的发生相关，在人体多种肿瘤的研究中，人们发现端粒长度的测定对诊断及预后判断具有重要价值。为了寻求一种端粒精确定量的新方法，开展了本实验研究。方法应用肽核苷酸探针（PNA）标记荧光原位杂交（FISH）-荧光素异硫氰酸（FITC）法检测黑色素瘤、转移黑色素瘤及黑色素痣石蜡切片中的端粒，以荧光显微镜、激光共聚焦显微镜生成图像，并详细记录细胞核平均面积、端粒数目、端粒面积。通过对采集图像的分析，对端粒进行了精确定量。结论FISH／FITC提供了一种方便、快速检测、精确定量组织切片中端粒的方法；定量FISH能在组织／细胞水平上提供端粒更特异的信息。     

卡托普利对心脏成纤维细胞端粒长度的作用研究

目的探讨卡托普利对心脏成纤维细胞端粒长度的影响。方法使用流式荧光原位杂交法（Flow—Fish）检测成纤维细胞端粒长度的变化。结果经过卡托普利处理过的成纤维细胞端粒明显缩短。结论本研究通过Flow—Fish法证实了卡托普利能缩短成纤维细胞端粒的长度，引起心脏成纤维细胞衰老的发生，从而抑制CFs的增殖。     

不同补肾健脾化瘀方药对老年小鼠免疫功能及自由基代谢影响的对比研究

目的:从自由基代谢、免疫衰老两方面来验证" 正虚挟瘀"是中医衰老的重要原因/机制.方法:两组老年小鼠连续4周分别灌服不同的补肾健脾化瘀方药后,检测腹腔巨噬细胞产生的白细胞介素1(Interleukin- 1,IL-1)、脾淋巴细胞产生的白细胞介素2(i nt erleukin-2,IL-2)的活性,肝脑的脂质过氧化物(lipid peroxides, LPO)含量以及红细胞清除自由基酶的活性[如超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(cat alase, CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glut athione peroxidase, GSH-Px)].结果: 老年小鼠IL-1、IL-2的产生以及SOD、CAT、GSH-Px均明显低于青年小鼠,而肝脑产生的脂质过氧化物则明显增加. 给药后,两方均可明显调整/恢复上述指标,虽然其作用强度有所不同,但基本上是一致的. 结论:老年机体确实存在脾肾两虚兼瘀血停滞(正虚挟瘀)的体质,用补肾健脾化瘀法调治可起到延缓衰老的作用.     

一氧化氮抑制单核-内皮细胞粘附的机制

目的：研究一氧化氮（ＮＯ）抑制单核内皮细胞粘附的机制。方法：以硝普钠作为ＮＯ的供体，用细胞粘附实验、流式细胞仪荧光强度测定、细胞ＥＬＩＳＡ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ等方法分别从细胞、蛋白表达、基因表达方面研究ＮＯ对内皮细胞粘附分子（ｖａｓｃｕｌａｒｃｅｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ，ＶＣＡＭ１）表达的影响。结果：ＮＯ抑制ＩＬ１α诱导的单核内皮细胞粘附，抑制ＩＬ１α诱发的ＶＣＡＭ１的表达并呈时间依赖性及浓度依赖性，ＮＯ在粘附分子ＶＣＡＭ１的基因表达水平上亦呈现抑制作用。结论：ＮＯ抑制ＶＣＡＭ１的表达是其抑制单核内皮细胞粘附及抗动脉粥样硬化的机制之一。     

人重组白细胞介素－9对白血病细胞株TF－1的刺激效应

发现人红白血病细胞株ＴＦ－１可在人重组白细胞介素－９（ＩＬ－９）刺激下长期生长达５个月，ＩＬＬ－９可抑制ＴＦ－１细胞的ＤＮＡ片段化，抗ＧＭ－ＣＳＦ抗体可抑制ＩＬ－９刺激的ＴＦ－１细胞增殖，从而提供了ＩＬ－９的一个新生物学效应。     

雷公藤多甙对皮肤角朊细胞株增殖抑制及凋亡的调节作用

目的:研究雷公藤多甙(tripterygium wilfordii hook f multi-glycosides,TWG)对角朊细胞株(COLO-16)的增殖抑制及对凋亡的影响,并探讨其治疗免疫性皮肤病的机制.方法:MTT法检测细胞增殖抑制,二苯胺及PI染色法检测细胞凋亡,RT-PCR测细胞bcl-2及bcl-Xs mRNA表达.结果:TWG 0.25 mg.L-1与角朊细胞共育72 h后,角朊细胞增殖活性受抑,此抑制作用具药物(质量)浓度依赖性;TWG 1 mg.L-1作用于角朊细胞72 h,即可使片段化DNA含量及亚二倍体细胞百分数较对照明显增加,此现象随药物质量浓度增加而增高;TWG 5 mg.L-1,可上调角朊细胞bcl-Xs mRNA表达,此作用随药物作用时间延长而增强;TWG对bcl-2 mRNA表达则无明显影响.结论:TWG可抑制角朊细胞株增殖并诱导其凋亡,此诱导凋亡机制可能与bcl-Xs上调有关.     

D-gal对鼠成纤维细胞端粒长度的影响

目的明确D-gal是否可以导致乳鼠心脏成纤维细胞端粒长度缩短.方法使用流式荧光原位杂交法(Flow-Fish)检测成纤维细胞端粒长度的变化.结果经过D-gal处理过的成纤维细胞端粒明显缩短.结论通过Flow-Fish法证实了D-gal能缩短成纤维细胞端粒的长度.在细胞水平明确了D-gal致衰老的作用,为建立心脏成纤维细胞衰老模型奠定基础.     

定量聚合酶链反应对系膜细胞端粒长度的测定研究

目的:为研究衰老和端粒长度的关系,采用一种新的简便的测定端粒DNA相对长度的方法-SYBRGREEN I定量PCR法,研究其可行性。方法:分别取年轻(10周龄)和老年(28月龄)SD大鼠的肾脏,分离、培养出肾小球系膜细胞,提取DNA后,采用实时荧光定量PCR对两组大鼠系膜细胞端粒DNA长度进行检测。结果:老年大鼠系膜细胞的端粒(T/S=1.1±0.08)短于年轻组(T/S=1.8±0.38)(t=9.28,P<0.05)。结论:随增龄大鼠肾脏系膜细胞端粒长度缩短,实时荧光定量PCR测定端粒DNA长度的方法可行。     

尿毒症患者染色体端粒长度改变的研究

目的:研究尿毒症患者染色体端粒长度的变化。方法:分别取20~30岁组和50~60岁组正常人和初次诊断为尿毒症患者的外周血,分离出白细胞,提取DNA后,采用Southern杂交对外周血白细胞染色体的端粒DNA序列长度进行检测。结果:发现50~60岁组的端粒长度短于20~30岁组(P<0.05),两年龄组尿毒症患者的端粒长度短于同年龄组正常人(P<0.05)。结论:尿毒症可使患者外周血白细胞染色体端粒长度缩短。