基于iTRAQ技术的肝细胞生长因子促进乳腺癌细胞侵袭的蛋白质组学研究

目的基于i TRAQ多重标记串联质谱技术系统性筛选乳腺癌患者血清蛋白表达的差异。方法提取血清蛋白,采用i TRAQ标记和ESJ-QTOF-QⅡ质谱检测,搜库和Scqffold软件分析得到各组间血清差异表达蛋白,采用蛋白质印迹法即免疫印迹法(Western Blot)对差异蛋白进行验证。结果 i TRAQ标记图谱显示乳腺癌组与健康对照组之间血清肝细胞生长因子(HGF)表达水平比较差异有统计学意义,Western Blot验证结果证实,乳腺癌患者血清中HGF表达水平同健康对照组比较,明显较高(P0.05)。结论通过i TRAQ技术系统性筛选乳腺癌患者血清蛋白表达的差异,发现乳腺癌细胞高表达HGF。     

基于多能干细胞的Alport综合征的microRNA差异性表达与碱基编辑功能分析

目的 分析Alport综合征(AS)的诱导多能干细胞(iPSCs)全基因微小核糖核酸(microRNA)的表达谱,筛选出具有差异性表达的microRNA与发生碱基突变的microRNA.方法 收集1例AS患者与1例健康人的尿液,从尿液中分离尿肾脏管细胞,尿肾脏管细胞分化诱导成iPSCs.运用高通量测序方法对iPSCs的microRNA进行测序与表达量测定,比较分析两人microRNA的表达差异,寻找具有特异性的microRNA靶点.同时,将mi-croRNA序列与miRBase数据库(http://www.mirbase.org/)中已知成熟microRNA序列进行比对,比较两标本mi-croRNA碱基编辑数量,找出发生了碱基突变的microRNA.结果 在两人标本中发现30个microRNA具有显著的差异性表达,其中19个microRNAs表达上调,11个microRNA表达下调.has-miR-3117-3p的倍比值(log2 Ratio)为7.79,在表达上调的microRNA最具有特异性;has-miR-544b的倍比值为-9.09,在表达下调的microRNA最具有特异性.同时在两标本中共有208个microRNA发生了碱基突变,其中104个microRNA,AS患者发生碱基编辑概率比健康人大;77个microRNA,健康人发生碱基编辑概率比AS患者大.结论 AS患者与健康人肾脏组织中的microRNA存在差异性,AS发生碱基编辑引起基因突变的microRNA比健康人更常见.这些差异性表达的microRNAs与microRNA碱基突变的概率可能在AS发病机制中起重要作用.     

应用同位素标记相对和绝对定量技术筛选白厚苔和黄厚苔乳腺癌患者唾液差异表达蛋白

目的：筛选乳腺癌白苔和黄苔患者与健康对照组之间的唾液差异表达蛋白,以寻找乳腺癌早期诊断的生物标记物,探索中医舌苔形成的机制。方法：纳入具有典型的白厚苔或黄厚苔的乳腺癌患者以及薄白苔健康人各10例。采集唾液提取蛋白,然后进行蛋白变性、还原及酶解,最后进行同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags forrelative and absolute quantitation,i TRAQ）标记和液相色谱串联质谱联用技术鉴定,得到的峰图用Data Analysis4.0,Mascott2.2软件和Scaffold软件分析,得出表达量差异结果。鉴定蛋白的组间比值〉1.5或〈0.6被认为存在表达差异。结果：共鉴定出464个蛋白,其中达到严格定量标准的蛋白125个。与健康对照组比较,乳腺癌白苔组和黄苔组共筛选出9个唾液差异表达蛋白,乳腺癌白苔组和黄苔组之间筛选出16个差异蛋白。结论：本研究证实i TRAQ结合液相色谱串联质谱联用技术能够快速、有效地进行差异蛋白质组学研究,发现一些蛋白与乳腺癌的发生以及中医舌苔形成机制相关。     

胃癌差异表达蛋白的蛋白质组学分析

目的筛选与鉴定胃癌差异表达蛋白质分子。方法采用定量蛋白组学方法,通过同位素i TRAQ标记胃癌与正常胃黏膜组织总蛋白,然后用强阳离子交换/反相液相色谱(SCX/nano HPLC)进行电喷雾串联质谱分析(ESI-MS/MS),获得两组样本的多肽及相对丰度信息,通过数据库搜索与比对,鉴定差异表达蛋白质。结果共鉴定出319个蛋白质,其中表达差异在2倍以上的88个,在胃癌中呈高表达的12个、呈低表达的76个。按蛋白质功能分为七大类:细胞骨架蛋白、分子伴侣、信号传导、生物代谢、凋亡,蛋白质合成与代谢类及其他蛋白质。结论成功筛选了胃癌差异表达蛋白质分子,这些蛋白质的表达改变,可能参与了胃癌的发生和发展。     

荧光双向电泳检测雌雄小鼠肝组织蛋白组学的差异

目的检测雌雄小鼠肝组织蛋白质组表达差异,探讨肝病发生的性别差异机制。方法采用双向荧光差异凝胶电泳(two dimension difference gel electrophoresis,2D-DIGE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技术检测C57BL/6J雌雄小鼠肝组织的蛋白质组差异表达谱,分离并鉴定差异表达蛋白,应用Western blot进行验证,并对差异表达蛋白进行生物信息学分析,包括蛋白功能注释、分类分析、京都基因与基因组百科全书通路分析。结果经双向荧光差异凝胶电泳-图像分析得到1767个蛋白点,其中差异倍数≥1.5(P0.05)的蛋白点325个。从中选择78个差异蛋白点进行MALDI-TOF-MS鉴定,得到48种差异性表达的蛋白质。其中,与雌鼠相比,雄鼠肝组织中高表达的蛋白有14种,低表达的蛋白有34种。选取6个差异蛋白点进行Western blot验证,证明了2D-DIGE结果的可靠性。GO分析结果显示,涉及雌雄鼠肝组织中的差异蛋白在细胞组分、分子功能、生物学过程中的分布广泛。KEGG通路分析发现差异蛋白涉及6条信号通路。结论 C57BL/6J雌雄小鼠肝组织的差异性蛋白表达的检测结果为研究性别差异性肝病发生的分子机制提供了基础生物学信息和有益的线索。     

Alport综合征iPSCs差异性表达新小核糖核苷酸的分析

目的 构建Alport综合征(AS)与正常对照者(NC)诱导多能干细胞(iPSCs)新核糖核苷酸(novel microRNA)差异性表达谱,分析其靶基因功能。方法 采用前期工作成功从尿肾状杆细胞诱导成的iPSCs,运用高通量测序平台获得AS与NC的差异性表达谱,使用靶基因预测软件TargetScan进行靶基因预测,靶基因与参考基因比较后,在候选靶基因找到显著富集的GO条目及KEGG通路。结果 在AS与NC中发现49个有意义的差异性表达novel microRNAs,其中33个表达上调,16个表达下调。在GO靶基因富集分析中,靶基因主要富集于生物调节、生物新陈代谢、细胞组成、细胞信号传导、酶催化反应、分子转运等过程。在KEGG通路分析中,靶基因主要参与代谢通路、嘌呤代谢、癌症转录调节等过程。结论 来源于AS与NC的iPSCs存在较大的差异性表达novel microRNA,其靶基因在分子功能、细胞组成、生物过程起着重要作用。这些差异性表达的novel mciroRNAs与靶基因可能是AS发病机制的潜在位点。     

miR-17-5p对动脉粥样硬化小鼠血管病变及VLDLR表达的影响

目的 探讨miR-17-5p对动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）小鼠血管病变及极低密度脂蛋白受体（VLDLR）表达的影响。 方法 用高脂饲养ApoE-/-小鼠15周构建AS小鼠模型,第13~15周尾静脉注射miR-17-5p抑制剂antagomiR-17-5p 20 mg/kg（antagomiR-17-5p组,n=10）干扰小鼠体内的miR-17-5p表达,并设AS模型组（同时点注射生理盐水,n=10）和NC miRNA组（同时点注射阴性对照抑制剂,n=10）,同时取10只C57BL/6小鼠正常饮食15周作为正常对照（NC组,同时点注射生理盐水）。HE染色检测各组小鼠动脉血管的病理变化并测量各组小鼠血管形态学改变。通过Targetscan靶基因预测数据库预测,VLDLR为miR-17-5p的靶基因,免疫荧光观察各组小鼠血管组织中VLDLR的分布变化;Real-time PCR和Western blot检测各组小鼠动脉组织中VLDLR mRNA和蛋白表达变化。 结果 HE染色结果显示AS模型组与NC组相比,其血管内皮形成了明显的斑块,平滑肌细胞排列紊乱,内膜增生,而antagomiR-17-5p处理的小鼠与NC miRNA组相比,病变程度明显减轻。AS模型组较NC组小鼠的内膜面积增加,抑制miR-17-5p的作用之后,内膜面积减少;各组小鼠中膜面积差异无统计学意义。血管管腔面积以及内膜/中膜比（I/M）值,AS模型组和NC-miRNA组小鼠比NC组减小,而antagomiR-17-5p组则缓解了这种作用（P<0.05）。免疫荧光显示:AS模型组VLDLR表达下降,antagomiR-17-5p组较NC miRNA组表达增多。AS模型组中VLDLR基因的表达量较NC组下降（P<0.01）,而antagomiR-17-5p组与NC miRNA组相比VLDLR基因的表达量上调（P<0.05）。Western blot检测的VLDLR表达结果类似。 结论 miR-17-5p抑制剂可能通过上调动脉组织中VLDLR的表达,有效缓解AS小鼠动脉血管的病理变化,有望成为治疗AS的新靶点。     

地塞米松抑制肾小球上皮间质转化

目的观察地塞米松对阿霉素肾病大鼠肾小球足细胞标志蛋白nephrin、间质转化调节因子ILK、间质标志蛋白α-SMA表达的影响,探讨其减轻蛋白尿的机制。方法 SD大鼠尾静脉1次性注射阿霉素制作肾病模型,24只诱导成功的模型鼠随机分为两组:(1)肾病组(NE组,n=12);(2)肾病+地塞米松治疗组(DE组,n=12),腹腔注射地塞米松0.3mg/kg,每周2次。另以10只SD大鼠作为对照组(NC组,n=10)。第8周测定血清C-反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)、肌酐(Cr)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys C)、清蛋白(A);尿液中24h尿白蛋白(24h AU)及尿足细胞(UPC)排泄水平;RT-PCR和Western boltting检测肾小球nephrin、ILK、α-SMA mRNA和蛋白质的表达。结果 NE组CRP、PCT、Cr、Cys C、24h AU较NC组明显升高,A水平较NC组明显降低,两两比较差异均有统计学意义(P<0.01),两组UPC的排泄无明显差异。NE组肾小球nephrin mRNA和蛋白质的表达较NC组明显降低,ILK、α-SMA mRNA和蛋白质的表达较NC组显著升高,两两比较差异均有统计学意义(P<0.01)。地塞米松明显改善ADR肾病鼠CRP、PCT、Cr、Cys C的升高和A的降低;恢复肾小球nephrin mRNA和蛋白质的表达,并抑制ILK、α-SMA mRNA和蛋白质的表达。结论地塞米松可减轻炎症反应;维持nephrin的表达,减轻尿白蛋白的排泄;抑制细胞表型转化的标记因子ILK、α-SMA的表达,抑制EMT。     

表面增强激光解吸/离子化质谱蛋白质芯片技术在筛选肾癌患者尿液标记物中的应用

目的 用表面增强激光解吸／离子化-飞行时间质谱(SEDLI-TOF-MS)蛋白质芯片技术筛选肾癌患者尿液相对特异标记物。方法 肾癌组40例,均经手术病理和／或临床影像证实;正常人群组40名,非肾癌其他泌尿系疾病组40例,二组合并为对照组。用IMAC-Cu-3芯片检测各尿液标本。结果 将肾癌组与对照组尿液标本结果相比较,发现肾癌差异明显的潜在标记物4个,相对分子量分别为4020、4637、5070、5500,分别以2．0、5．0、5．0、5．0为界值时,其诊断肾癌的敏感性为57．5％、66．7％、63．7％、65％,特异性为86．2％、95％、82．5％、75％;其中4637、5070差异表达蛋白质在对照组中高表达,肾癌组中低表达;而4020、5500差异表达蛋白质在肾癌组中高表达,对照组中低表达。结论 SELDI-TOF-MS蛋白质芯片技术是一种快速、简便易行、用量少和高通量分析方法,不仅能直接筛选出肾癌患者尿液中相对特异的潜在标记物,而且具有较好的临床应用价值。     

lncRNA-PVT1对宫颈癌Hela229细胞增殖能力的影响

目的探讨长链非编码RNA PVT1(lncRNA-PVT1)对中老年宫颈癌Hela229细胞增殖能力的影响。方法利用小干扰RNA(siRNA)技术降低Hela229细胞lncRNA-PVT1表达水平,将实验分为NC组(siNC-Hela229细胞)与Si组siPVT1-Hela229细胞)。qPCR法检测两组lncRNA-PVT1及EZH2表达水平,运用MTT法检测两组细胞增殖能力,Western blot检测两组EZH2蛋白表达水平。结果 lncRNA-PVT1表达水平Si组(0.25±0.79)较NC组(1.0±0.28)明显降低(P0.05),而EZH2 mRNA的表达水平Si组(0.78±0.16)较NC组(1.0±0.18)无明显差异(P=0.0512)。MTT结果显示1天、2天、3天的细胞活力Si组较NC组明显降低(P0.05)。Western blot显示Si组较NC组EZH2蛋白表达水平明显降低(P0.05)。结论降低Hela229细胞lncRNA-PVT1表达水平能够抑制细胞增殖,lncRNA-PVT1对EZH2 mRNA的表达水平无影响,而干扰EZH2蛋白的表达水平。