DISC1基因过表达对星形胶质细胞质膜伸展的影响

目的 构建精神分裂症断裂基因1(Disrupted-In-Schizophrenia 1,DISC1)蛋白表达质粒,检测其过表达后对星形胶质细胞(Astrocytes,ASTs)质膜伸展的影响.方法 针对小鼠DISC1基因mRNA编码序列,设计合成可扩增全长引物;以小鼠脑白质cDNA为模板进行PCR扩增,构建全长表达质粒,命名为pEGFP-n1-DISC1.分别将过表达组pEGFP-n1-DISC1和空载体对照组pEGFP-n1电转染原代培养ASTs,以Western blot及免疫荧光染色检测DISC1-GFP融合蛋白的表达,利用Image-Pro Plus 5.0软件分析对照组与DISC1过表达组星形胶质细胞质膜伸展面积的大小.结果 成功从cDNA中扩增出DISC1编码序列并插入pEGFP-n1载体,双酶切和测序结果证实,DISC1蛋白编码序列插入载体,并能正确读码翻译.构建质粒转染ASTs 60 h后,可见DISC1-GFP融合蛋白表达;与对照组相比,DISC1过表达组ASTs的质膜伸展面积明显增加(P＜0.05).结论 成功构建小鼠DISC1全长基因表达载体,DISC1基因过表达后可促使ASTs质膜伸展面积增加.     

GAPDH基因重组质粒的构建

目的构建人GAPDH基因的重组质粒。方法采用PCR方法，从人全血基因组DNA中扩增出GAPDH基因，并克隆到PUCl8载体，转化入大肠杆菌DH5ct，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符，测序结果与文献报道一致。结论成功地构建了人GAPDH基因的重组质粒PUCl8-GAPDH。     

Stat3 mRNA靶向MicroRNA重组质粒的构建及其在HepG2肝癌细胞系中的表达

目的构建并筛选靶向信号转导和转录激活因子3（Stat3mRNA）的微小RNA（MicroRNA）表达质粒。观察其在肝癌细胞系HepG2中对Stat3表达的影响。方法针对人Stat3mRNA设计3条MicroRNA序列,经退火成互补双链,将双链DNA插入线性质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒中,分别构建重组表达质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-1、2、3等3组质粒,并测序鉴定。脂质体法转染重组质粒至人肝癌HepG2细胞中,观察转染效果。RT-PCR和Western blot分别检测Stat3mRNA和蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡,MTT法检测细胞增殖能力。结果成功构建靶向Stat3的MicroRNA重组质粒,经测序证实插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致,转染人肝癌HepG2细胞后,荧光显微镜下可观察到带有绿色荧光的HepG2细胞。流式细胞仪检测3组质粒的转染效率分别为：76%、73%和63%。RT-PCR分析pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-1、2、3的抑制率分别为：73.5%、47.2%和39.6%,下调Stat3蛋白的比例分别为：89.1%、71.6%、67.3%。其中pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-1的下调效应最明显。MiR-1质粒转染组的细胞凋亡率升高,增殖受抑制,与阴性对照质粒组和未转染组比较,差异均有高度统计学意义（均P〈0.01）。结论成功构建了靶向Stat3的MicroRNA表达质粒,其对肝癌HepG2细胞Stat3的表达及增殖有显著抑制。     

靶向bcl-2基因转录shRNA重组质粒的构建和筛选

目的构建能高效抑制肝星状细胞(HSCs)bcl-2表达的小发夹RNA(shRNA)重组质粒。方法利用RNA干扰技术,设计有小发夹结构的3条DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体psiRNA-hH1neo上构建重组质粒,予以酶切和测序鉴定。重组质粒转染HSC-T6细胞株,运用实时荧光定量PCR和Western blotting进行筛选鉴定。结果酶切及测序鉴定表明,成功构建重组质粒shRNA1、shRNA2和shRNA3。实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,shRNA1和shRNA2转染后显著抑制HSC-T6中bcl-2mRNA和蛋白表达(P<0.05),其中siRNA1的bcl-2表达抑制效率>80%。结论构建的重组质粒shRNA1能有效抑制HSCs中bcl-2的表达。实验为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径奠定了基础。     

靶向bcl-2基因转录shRNA重组质粒的构建和筛选

目的 构建能高效抑制肝星状细胞(HSCs)bcl-2表达的小发夹RNA(shRNA)重组质粒.方法 利用RNA干扰技术,设计有小发夹结构的3条DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体psiRNA-hHlneo上构建重组质粒,予以酶切和测序鉴定.重组质粒转染HSC-T6细胞株,运用实时荧光定量PCR和Western blotting进行筛选鉴定.结果 酶切及测序鉴定表明,成功构建重组质粒shRNA1、shRNA2和shRNA3.实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,shRNA1和shRNA2转染后显著抑制HSC-T6中bcl-2 mRNA和蛋白表达(P＜0.05),其中siRNA1的bcl-2表达抑制效率＞80%.结论 构建的重组质粒shRNA1能有效抑制HSCs中bcl-2的表达.实验为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径奠定了基础.     

pcDNA3.1-HMOX1重组质粒载体的构建与鉴定

目的：构建pcDNA3．1－HMOX1重组质粒载体。方法使用基因合成法合成HMOX1基因,在其N端添加Kozak序列及His标签序列,将扩增后的目的基因双酶切连接至pcDNA3．1载体的BamHⅠ和 NotⅠ之间。转化DH5α大肠杆菌后,挑取阳性克隆子进行质粒抽提电泳及测序鉴定。结果 pCDNA3．1－HMOX1重组质粒经酶切电泳及DNA测序证实,目的基因HMOX1的序列完全正确,重组质粒载体构建成功。结论成功构建pCDNA3．1－HMOX1融合基因并在DH5α大肠杆菌内表达,为进一步探讨HMOX1的生物学功能奠定了基础。     

含突变型p53和LMP1双基因重组质粒的构建与鉴定

目的构建一种双基因真核表达载体，使之表达人突变型p53蛋白(p53mt)和EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)，为研究这两个蛋白在鼻咽癌变中的交互作用奠定基础。方法通过基因重组技术，构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1-p53mt；采用脂质体LipofectAMINE^TM 2000将此载体转入体外培养的HeLa细胞中，转染后48h，采用免疫细胞化学方法分析突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的表达。结果对重组载体进行限制性内切酶酶切及PCR鉴定分析，结果与预期相符合：转染试验观察到转染细胞中突变型p53基因和LMP1基因的阳性表达。结论成功构建了表达人突变型p53蛋白和EB病毒LMP1的真核载体pLMP1-p53mt，其研究思路可以为中医体质病机研究提供借鉴。     

B7-1和新型隐球菌DHA1基因嵌合重组质粒的构建

目的：构建包含新型隐球菌细胞免疫主要相关基因——迟发超敏反应抗原基因(delayed-type hypersen-tivity antigen 1,DNA)与小鼠共刺激分子B7—1的嵌合重组质粒。方法：设计合成两对寡核苷酸引物，用PCR法分别从pUCmB7—ITM和新型隐球菌重组质粒pcDNA3-DHA1中特异扩增出编码B7—1和DHA1的基因片段(921bp和984bp)，分别用HindⅢ，EcoRⅠ，XbaⅠ酶切后，逐个定向连接到质粒pcDNA3中，转化宿主菌DH-5α，分别用上述内切酶酶切及DNA到序鉴定重组质粒。结果：酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符，测序结果与文献报道序列及预计结果一致，证实符合表达框架。结论：该研究成功构建了新型隐球菌嵌合重组质粒pcDNA3-B7-1-DHA1，为进一步研究新型隐球菌DNA免疫奠定了基础。     

CVB3VP1与IL-2基因双表达重组质粒的构建及免疫效果

目的 探讨白细胞介素-2(intefleukin-2，IL-2)基因佐剂对柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3，CVB3)基因疫苗的免疫增强作用。方法 从CVB3VP1基因的重组质粒peDNA3／VP1上扩增出带有完整表达构件的VP1基因，克隆至pcDNA3／IL-2，构建成CVB3VP1基因和IL-2基因双表达质粒pcDNA3／VP1-IL-2，转化DH5a大肠杆菌。将peDNA3／VP1-IL-2、peDNA3／IL-2 peDNA3／VP1、pcD．NA3／VP1、peDNA3／IL-2、空白质粒peDNA3和生理盐水分别肌肉注射BALB／C小鼠，每周注射1次，共注射3次，每次注射后的第6天，断尾取血，用微量中和试验方法检测血清中和抗体；第3次注射后的第7天，用800TCID50CVB3感染小鼠，观察各组小鼠的生存情况。结果pcDNA3／VP1-IL-2、pcDNA3／IL-2 pcDNA3／VP1和pcDNA3／VP1组小鼠能产生中和抗体，抗体滴度随免疫次数增加而提高，pcDNA3／VP1-IL-2和pcDNA3／IL-2 pcDNA3／VP1组抗体水平高于同期pcDNA3／VP1组抗体水平，但各组小鼠的生存率无明显差异。结论IL-2基因单独或与VP1基因共表达对pcDNA3／VP1诱导抗体产生均有一定免疫增强作用。     

人TGFβ1cDNA高表达重组质粒的构建

目的为了得到基因工程制备的人重组TGFβ1,构建人TGFβ;cDNA高表达重组质粒。方法从人血小板中提取总RNA,经RT－PCR得到TGFβ;cDNA基因,并克隆到表达质粒pBLMVL2中,构建了在PL启动控制基因表达质粒pBLMVL2－TGFβ;,使其在大肠杆菌中进行温敏诱导表达。结果RT－PCR得到的TGFβcDNA经DNA序列分析与文献报道一致,pBLMVL2－TGFβ1在大肠杆菌中表达产物人重组TGFβ1经还原型SDS－PAGE电泳,呈一条蛋白条带,分子量12．5kd,表达产物约占全菌蛋白20％。结论构建的重组质粒pBLMVL2－TGFβ1能高表达人重组TGFβ1。     

TAZ基因重组质粒的构建与表达

目的构建重组质粒TAZ-pcDNA3.1及TAZ-pEGFP-C2,并应用Western Blot检测TAZ蛋白在细胞内的表达情况,初步探索TAZ分子促进细胞增殖和迁移的作用机制。方法通过PCR扩增获得TAZ基因片段,胶回收后连接T载体,蓝白斑筛选,转化,提质粒,酶切,用T4DNA Ligase连接,亚克隆进入pEGFP-C2和pcDNA3.1获得新的重组质粒,分别转染HEK293细胞,智能型荧光细胞监测仪观察TAZ分子在细胞内的分布情况,Western Blot检测其在细胞内的表达情况。结果重组质粒经双酶切鉴定和测序证明构建成功,荧光照片显示TAZ分子分布在细胞核和细胞浆中,Western Blot检测结果表明转染有重组质粒TAZ-pcDNA3.1的HEK293细胞中有大量TAZ蛋白表达。结论成功构建了两种重组质粒,并初步验证了TAZ蛋白的细胞定位,为进一步研究其促进增殖和迁移的作用机制奠定了基础。     

人脂蛋白脂酶基因重组质粒的构建及其表达

目的研究野生型人脂蛋白脂酶(LPL)cDNA重组表达质粒的构建了及其在COS-1细胞中的表达。方法采用RT-PCR法从人大网膜脂肪组织获取LPL cDNA基因,以pcDNA3.1Zeo( )质粒作为载体,运用基因克隆技术构建野生型人LPLcDNA重组质粒,限制性内切酶酶切、PCR以及双向测序鉴定重组质粒;运用L ipofectam ine 2000TM将重组pcDNA3.1Zeo( )-LPLcDNA质粒导入COS-1细胞,RT-PCR法检测LPL mRNA,ELISA法和比色法分别检测细胞裂解液及细胞培养基中LPL浓度及活性。结果经限制性内切酶酶切及PCR鉴定,证实LPL基因已被连接到pcDNA3.1Zeo( )质粒中;DNA双向测序证实其产物与基因库中LPL基因序列完全一致。LPL mRNA和蛋白表达及其活性测定结果表明,pcDNA3.1Zeo( )-LPL cDNA重组质粒已转染入COS-1细胞中。结论实验成功构建野生型人LPL cDNA重组表达质粒,并证实其能在COS-1细胞中有效表达。     

人脂蛋白脂酶基因重组质粒的构建及其表达

目的 研究野生型人脂蛋白脂酶(LPL)cDNA重组表达质粒的构建了及其在COS-1细胞中的表达.方法 采用RT-PCR法从人大网膜脂肪组织获取LPL cDNA基因,以pcDNA3.1Zeo(+)质粒作为载体,运用基因克隆技术构建野生型人LPLcDNA重组质粒,限制性内切酶酶切、PCR以及双向测序鉴定重组质粒;运用Lipofectamine 2000TM将重组pcDNA3.1Zeo(+)-LPLcDNA质粒导入COS-1细胞,RT-PCR法检测LPL mRNA,ELISA法和比色法分别检测细胞裂解液及细胞培养基中LPL浓度及活性.结果 经限制性内切酶酶切及PCR鉴定,证实LPL基因已被连接到pcDNA3.1Zeo(+)质粒中;DNA双向测序证实其产物与基因库中LPL基因序列完全一致.LPL mRNA和蛋白表达及其活性测定结果表明,pcDNA3.1Zeo(+)-LPL cDNA重组质粒已转染入COS-1细胞中.结论 实验成功构建野生型人LPL cDNA重组表达质粒,并证实其能在COS-1细胞中有效表达.     

重组质粒pEGFP-C3-caveolin-1构建及在小鼠足细胞中的表达

目的:构建真核表达重组质粒pEGFP-C3-caveolin-1及稳定转染小鼠足细胞.方法:用RT-PCR法扩增小鼠肾脏caveolin-1的开放阅读框(ORF),构建TA克隆,用EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ酶切位点亚克隆至真核表达质粒pEGFP-C3中,酶切和测序鉴定.脂质体转染法转染小鼠足细胞,荧光显微镜下动态观察转...     

携带STAT3基因的siRNA表达质粒的构建与鉴定

目的:构建含入STAT3基因不同位点的一系列siRNA真核表达质粒pSUPER,并进行测序,为以STAT3为靶点的肿瘤基因治疗研究奠定基础.方法:将人工合成的针对STAT3基因2个不同位点经基因重组定向克隆插入到真核表达质粒pSUPER中,通过PCR检测及质粒测序确定重组结果.结果:各对mRNA序列均按正确方向插入pSUPER质粒.结论:成功构建了含人STAT3基因2个不同位点的siRNA真核表达质粒.     

pQE32-HPV18L1重组质粒的构建及鉴定

目的 构建重组原核表达质粒获得HPV18 L1活性蛋白，为进一步研制HPV18基因工程疫苗打下基础。方法 以重组质粒pBR322-HPV18为模板，利用PCR方法扩增HPV18 L1DNA片段，将HPV18 L1DNA与pUC19质粒重组构建pUC19-HPV18 L1重组质粒。用酶切电泳验证重组结果的正确性；并通过测序检查质粒重组后序列有无变化。再利用pQE32质粒做表达载体构建pQE32-HPV18 L1重组质粒，并用酶切电泳验证。结果 PCR扩增DNA片段约为1.7Kb，与预期结果相同。pUC19-HPV18 L1克隆重组质粒酶切后显示4.39Kb，酶切图谱与预期相同。测序验证插入片段全序列无改变。pQE32-HPV18 L1表达重组质粒酶切后显示其大小约5.16Kb，酶切图谱亦与预期相同。结论 pQE32-HPV18 L1表达重组质粒构建成功。     

Myo5a末端4个小片段重组质粒的构建

目的 构建Myo5a末端4个小片段的重组质粒PGEX-4T-3/Myo5a. 方法 PCR扩增出Myo5a基因末端4个特异性小片段的蛋白编码序列,用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切,将酶切后小片段分别插入原核表达载体PGEX-4T-3,构建4个重组质粒PGEX-4T-3/Myo5a,并对其进行鉴定. 结果 扩增出4个大小约100 bp的基因片段,4个片段重组质粒PGEX-4T-3/Myo5a经鉴定正确. 结论 成功构建4个Myo5a特异性片段的重组质粒PGEX-4T-3/Myo5a.     

人源Dickkopf-1真核表达质粒的构建

目的构建人源Dickkopf-1（DKK-1）基因的真核表达质粒,为进一步探讨DKK-1的生物学功能奠定基础。方法Trizol法从人新鲜胎盘组织中抽提总RNA,RT-PCR法反转录为cDNA,以cDNA为模板扩增人源DKK-1的基因序列,将真核表达载体pcDNA3.1和DKK-1的PCR产物分别在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pcDNA3.1-DKK-l,转化至大肠杆菌后经菌落PCR、NHeⅠ和EcoRⅠ双酶切及测序鉴定。结果RT-PCR法从人胎盘中扩增出816bp大小的目的片段,重组质粒转化至大肠杆菌后菌落PCR同样扩增出816bp大小的目的片段,NHeⅠ和EcoRⅠ双酶切重组质粒能切出两条目的条带,测序后与Genbank中DKK-1的cDNA对比,证明DKK-1的基因序列完全正确。结论成功构建了pcDNA3.1-DKK-1重组质粒,为研究人源DKK-1的功能及其在细胞系中的作用奠定了基础。     

hLMO1编码基因重组质粒的构建及蛋白的表达和定位

目的 构建hLMO1真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO1基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中.将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞---HEK293细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hLMO1在HEK293细胞内的定位.结果 hLMO1基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP中,酶切鉴定片段为471 bp.Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为45 kDa.pEGFR-LMO1在人HEK293细胞核与细胞质均有表达.结论 成功构建了hLMO1基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-LMO1蛋白定位于HEK293细胞的细胞质和细胞核内.