血清及细胞因子对人骨髓间质干细胞增殖的影响

目的 :探讨影响体外骨髓间质干细胞增殖的因素。方法 :取胸部外科手术无血液系统疾病病人肋骨 ,采用密度梯度离心法分离单个核细胞 ,以每皿 5× 10 5个的细胞浓度接种 ,9d后 ,瑞士 吉姆萨染色 ,计数集落并进行统计分析。结果 :在 5 %～ 30 %的血清浓度范围内 ,骨髓间质干细胞集落数随血清浓度的升高而增多。bFGF ,IL 1α ,IL 3,IL 6等细胞因子可促进骨髓间质干细胞的增殖。结论 :血清浓度与细胞因子bFGF ,IL 1α ,IL 3,IL 6可促进MSC的增殖     

刺五加注射液对骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的探讨刺五加注射液对大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）增殖的影响。方法体外培养MSC，用四甲基偶氮唑法检测刺五加注射液促进大鼠MSC增殖的作用；用免疫组化法检测MSC细胞的Brdu标记阳性率。结果4种浓度的药液对MSC的增殖作用与对照组比较有显著性差异（P〈0．05）。结论刺五加注射液有促进MSC增殖的作用。     

成人骨髓间质干细胞诱导分化为神经元样细胞及其与细胞分裂的关系

目的探讨成人骨髓间质干细胞(hMSC)向神经元样细胞分化过程中分化与细胞分裂的关系。方法从成人骨髓中分离骨髓间质干细胞(MSC),培养扩增。用参芪液诱导MSC分化为神经元样细胞,经免疫组化鉴定其神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。诱导后进行神经元样细胞计数,掺入Brdu测定,计算标记系数。采用双标记间接免疫荧光法检测神经元样细胞特异性表面标记(NSE、NF)与细胞分裂的标记Brdu的关系。抑制DNA合成,计算Brdu、NSE和NF阳性细胞数。结果MSC经参芪液诱导后,可见神经元样细胞。免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF阳性,GFAP阴性。MSC诱导分化后的细胞总数增加,诱导分化后12h内细胞增殖较快。30%以上分化的神经元样细胞在表达NSE和NF的同时可见Brdu标记,而另一部分分化的神经元则无Brdu标记。抑制DNA合成,并不会阻止神经元的分化,仍有70%的分化神经元表达神经元特异性标记蛋白NSE。结论MSC诱导分化的部分神经元样细胞可进行细胞分裂,但抑制细胞分裂不影响神经元分化。     

碱性成纤维细胞生长因子对大鼠骨髓间质干细胞增殖的影响

[目的] 研究碱性成纤维细胞生长因子( bFGF)对大鼠骨髓基质干细胞( MSC)增殖的影响.[方法] 用α- MEM冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞悬液,接种在塑料培养瓶中,经体外扩增、纯化,观察其生长特性,用免疫组织化学 SABC法检测波形蛋白和纤粘连蛋白的表达,并研究不同浓度 bFGF对 MSC生长曲线和克隆形成率的影响.[结果] 原代培养时形成由基质干细胞组成的细胞集落,细胞集落 14 d时接近融合,传代后细胞体积变大,约 5～ 7 d传代 1次;免疫组化显示 MSC呈波形蛋白阳性,而纤粘连蛋白阴性.浓度 10 ng/mL和 20 ng/mL bFGF组的 MSC的细胞数和克隆形成率比 5 ng/mL bFGF组和对照组(无 bFGF)明显增加,具有高度显著性( P< 0.01).[结论] bFGF可明显促进 MSC的增殖.     

黄芪诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞.方法通过贴壁法分离大鼠MSC,体外扩增培养.中药黄芪定向诱导MSC分化为类神经元样细胞.光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志.结果大鼠骨髓间质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增.黄芪诱导90 min后大部分MSC转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性、GFAP阴性.结论大鼠骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞.     

大鼠骨髓间质干细胞体外分化为成骨细胞的实验研究

目的：建立大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)体外诱导分化为成骨细胞的模型。方法：分离大鼠骨髓间质干细胞进行体外培养，观察其生物学特性。并选用一定的诱导剂诱导成骨细胞，通过形态学变化、碱性磷酸酶染色及钙沉积对成骨细胞进行鉴定。结果：大鼠MSCs细胞形态呈长梭形，成骨细胞诱导后MSC细胞形态由长梭形向多边形转变，ALP染色阳性，Von Kossa染色阳性，呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征。结论：大鼠骨髓MSCs体外能被诱导分化为成骨细胞，为骨组织工程研究的优良种子细胞。     

丙泊酚对大鼠胚胎神经干细胞增殖及分化的影响

目的探讨丙泊酚对体外培养大鼠胚胎神经干细胞(NSCs)增殖及分化的影响。方法采用孕14～16 d Wistar大鼠,进行NSCs原代培养并用Nestin鉴定,按以下给药分成六组:空白对照组(control)、脂肪乳对照组(introlipid)、丙泊酚不同浓度组[5、25、50、100μmol/l],用5-溴脱氧尿(Brdu)掺入法观察丙泊酚对胚胎神经干细胞增殖的影响。胚胎神经干细胞诱导分化过程中加入50μmol/l丙泊酚,采用NeuN、GFAP免疫组化法观察丙泊酚对胚胎神经干细胞分化的影响。结果分离培养的神经干细胞95%以上呈Nestin阳性,不同浓度丙泊酚组Brdu阳性细胞百分数没有差异,丙泊酚NeuN阳性细胞百分数(23.1±0.9%)明显高于对照组(13.4±0.8%)(P<0.05),而GFAP细胞阳性细胞数与对照组相比没有明显差异。结论临床相关剂量丙泊酚对体外培养大鼠神经干细胞增殖没有影响,但能诱导神经干细胞向神经元细胞分化。     

睾酮定向诱导MSC分化的实验研究

目的：激素体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞。方法：通过贴壁法分离大鼠MSC，体外扩增培养，睾酮定向诱导MSC分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。睾酮诱导6h后大部分MSC转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性、GFAP阴性。结论：大鼠骨髓间质干细胞可在体外经睾酮诱导分化为神经元样细胞。     

心复康联合骨髓间充质干细胞移植对濒死心肌的保护作用

[目的]探讨中药心复康联合骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植在大鼠急性心肌梗死后对濒死心肌的保护作用及其机制。[方法]经密度梯度离心联合贴壁筛选法培养并纯化BMSCs,采用冠状动脉结扎法建立大鼠急性心肌梗死模型,移植前以5-溴脱氧尿核苷(Brdu)对移植细胞进行标记,术后采用中药心复康灌胃联合干细胞移植治疗。治疗后2周处死动物,免疫组织化学方法检测心肌损伤区Brdu阳性移植细胞数、CD34⁺新生血管数和细胞增殖核抗原(PCNA)阳性心肌细胞数量。[结果]心复康联合干细胞移植治疗组移植细胞存活率增加(与细胞移植组比较P<0.05),梗死边缘区新生血管数量及PCNA阳性心肌细胞数量均有所增加(与细胞移植组比较P<0.05)。[结论]中药心复康联合干细胞移植对大鼠急性心肌梗死后濒死心肌细胞有明显的保护作用,其机制可能与心复康联合干细胞移植能更有效的促进损伤区血管新生有关。     

MK-801内源性激活脑缺血后成年大鼠海马神经干细胞

目的:研究兴奋性氨基酸(NMDA)受体拮抗剂MK801对脑缺血后海马区神经干细胞(NSCs)激活的作用。方法:将40只SD大鼠分成对照组和实验组,两组大鼠均采用传统线栓法作成大脑中动脉缺血再灌注模型,实验组大鼠腹腔注射MK801,对照组腹腔注射生理盐水,通过免疫组织化学技术标记鼠脑海马齿状回颗粒细胞层(SGZ)、室管膜下层(SVZ)注射后第3,7,11,18d的Brdu、Nestin阳性细胞数。结果:对照组大鼠Brdu、Nestin阳性细胞7d在SGZ出现一小高峰,然后迅速下降,11d阳性细胞甚少;而实验组Brdu、Nestin阳性细胞3d在SVZ明显表达,7～11d在SGZ区达高峰,并可持续至18d,两组比较,有统计学意义(P<0.01)。结论:NMDA受体拮抗剂MK801在脑缺血后,能促进大鼠海马区NSCs的增殖、分化。     

龟板含药血清体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元

【目的】观察龟板含药血清体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元的能力。【方法】采用龟板含药血清体外定向诱导第五代骨髓间充质干细胞，免疫组化鉴定神经丝蛋白(NFP)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。【结果】成年大鼠骨髓间充质干细胞受龟板血清诱导后神经元样细胞NF表达阳性，诱导后12h，神经元样细胞NF阳性表达达到高峰。【结论】龟板含药血清可以在体外诱导成年大鼠骨髓间充质分化为神经元。     

大鼠间充质干细胞对BALB/c小鼠体外淋巴细胞实验的影响

目的 研究大鼠间充质干细胞(MSC)对BALB/c小鼠淋巴细胞增殖和CD4+CD25+调节性T细胞亚群的变化。方法 分离、扩增SD大鼠MSCs,流式细胞术检测表面标志以鉴定。取第5代MSC与分离的小鼠淋巴细胞在刀豆蛋白(ConA)刺激下共培养5天 ,流式细胞仪测定细胞增殖,CD4+CD25+调节性T细胞亚群比例的变化。结果 当淋巴细胞: MSCs在1:10及1:50时均可抑制ConA刺激下可抑制小鼠淋巴细胞增殖,淋巴细胞: MSCs在1:10 时CD4+CD25+调节性T细胞亚群比例明显升高。结论 大鼠MSC具有异种基因免疫抑制作用     

siRNA 沉默胸腺素β4对鹿茸间充质干细胞增殖的影响

目的：利用 siRNA 干扰技术研究胸腺素β4（Tβ4）基因沉默对鹿茸间充质干细胞（MSC）增殖的影响。方法鹿茸 MCS 分为阴性对照组、siRNA-Tβ4转染组2组。MTT 检测 MSC 增殖的变化,Real-time PCR 检测 ILK、AKT 及 CyclinD1 mRNA 表达量差异变化,Western blot 检测 AKT 及 P-AKT 蛋白含量变化。结果 siR-NA-Tβ4转染组 MSC 增殖受到显著抑制（P ＜0.01）;siRNA-Tβ4转染组 ILK、CyclinD1 mRNA 表达量下调,AKT mRNA 表达量不变;siRNA-Tβ4转染组总 AKT 蛋白含量无变化,P-AKT 蛋白含量减少。结论 Tβ4基因沉默能显著抑制 MSC 增殖,并可能通过下调 ILK、P-AKT 及细胞周期相关蛋白 CyclinD1从而抑制 MSC 细胞增殖。     

罗哌卡因对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和迁移能力的影响

目的：探讨罗哌卡因对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）增殖能力和迁移能力的影响,为BMSCs的临床应用提供进一步的研究基础。方法：使用贴壁法分离扩增大鼠BMSCs,流式细胞仪检测细胞表面分子标志物;成脂、成骨和成肌诱导分化检测细胞的分化潜能;分别使用CCK-8和Brdu掺入方法检测不同浓度罗哌卡因处理对BMSCs增殖能力的影响;细胞划痕实验和Millicell小室迁移实验检测不同浓度罗哌卡因对大鼠BMSCs迁移能力的影响。结果：培养所得细胞具备BMSCs的表面标志物特点和多向分化潜能。50,100μmol/L罗哌卡因处理可显著降低BMSCs的增殖速度,降低BMSCs的Brdu阳性率,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。划痕实验和迁移实验表明罗哌卡因处理可引起BMSCs迁移能力的明显降低（P〈0.05）。上述效应均对罗哌卡因的给药剂量呈现明显的剂量依赖关系,组间比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：罗哌卡因可显著降低大鼠BMSCs的增殖能力和细胞迁移能力,提示外科应用BMSCs时需注意罗哌卡因等长效局部麻醉剂对BMSCs造成的不利影响。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离冻存及向成骨细胞和软骨细胞诱导分化

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）体外分离、纯化、增殖、冻存的方法,并观察其体外分化为成骨细胞及软骨细胞的潜能活性.方法 取SD大鼠的股骨及胫骨,冲取骨髓液,采用密度梯度离心法结合贴壁培养法以及单独用贴壁培养法分离纯化MSC,增殖,并测定其生长曲线.MSC在12.5%DMSO条件下经液氮冻存半年复苏,测其存活率.对第3代大鼠MSC进行成骨矿化诱导,测定其碱性磷酸酶（ALP）活性及成骨矿化情况.对第3代大鼠MSC进行诱软骨细胞的诱导分化,测定诱导后的细胞表型情况.结果 大鼠MSC为均一的梭形的成纤维细胞样生长,贴壁及增殖能力强,生长曲线呈S型.MSC于液氮冻存半年后复苏,其存活率为80%.在成骨诱导剂作用下,MSC具有成骨能力,诱导后ALP活性显著提高,并出现矿化结节沉积.在成软骨诱导剂作用下,可见细胞由成纤维细胞样的梭形变为椭圆形及肾形,并分泌异染基质,甲苯胺蓝染色呈阳性,表现为软骨细胞分化特点.结论 获得的SD大鼠MSC生长旺盛,增殖能力强.在特定诱导条件下,大鼠MSC体外可定向分化为成骨细胞及软骨细胞,具有成骨及成软骨分化潜能.     

调肝益气通络方促进骨髓间充质干细胞体外增殖研究

目的：探索调肝益气通络方对大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）增殖能力的影响。方法：腹腔注射＂CCl4-橄榄油＂混悬液制备WISTAR大鼠（35只）肝纤维化模型;其中30只灌胃给予调肝益气通络方（低、中、高剂量）1个月,制备含药血清;另外5只用于MSC细胞的分离与培养;用含药血清诱导MSC向肝细胞的分化连续14d;在各检测点进行形态学观察通过MTT对细胞增殖情况进行评价,通过WesternBlot检测诱导第7天、第14天甲胎蛋白的表达程度。结果：各浓度含药血清在加入1~14d后,其细胞数量均比常规培养组增多,并同用药剂量、时间呈正比;诱导14d后高剂量组甲胎蛋白呈强阳性表达。结论：调肝益气通络方对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖能力具有显著的促进作用,并可促进甲胎蛋白的分泌。     

同种异体移植的骨髓间充质干细胞在椎间盘环境中存活及增殖能力的研究

目的观察同种异体移植的骨髓间充质干细胞（MSCs）在椎间盘环境中的存活及增殖能力。方法从30只日本大白兔中分离培养骨髓MSCs,Ad—EGFP标记后同种异体移植到椎间盘环境中,术后1周、2周、4周、8周、12周取材,Brdu处理后做石蜡切片,荧光显微镜观察细胞存活,并行Brdu免疫组化染色检测细胞增殖。结果术后1周、2周、4周、8周、12周标本内可观察到绿色荧光,术后1周、2周、4周、8周、12周标本内均有Brdu免疫组化染色阳陆细胞。结论自体移植的MSCs在椎间盘环境中能够存活并且增殖,为MSCs作为椎间盘组织工程的种子细胞提供了实验依据。     

当归对人脐血间充质干细胞增殖的影响

目的:探讨当归对人脐血间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖的影响及当归诱导后脐血间充质干细胞nestin变化情况。方法:无菌条件下收集新生儿脐血,以Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液密度梯度法分离单个核细胞(mononuclear cells,MNCs)。分离获得的MNCs采用DMEM/F12培养基/10%胎牛血清进行MNCs培养传代。向培养基内加入1μl/ml当归注射液,分为两组,阳性对照组为加当归注射液,阴性对照组不加当归注射液,进行台盼兰染色活细胞计数,以平均数为结果分别绘制两组的细胞生长曲线。对人脐血间充质干细胞进行神经标志物nestin的免疫组化检查。结果:阳性对照组脐血MSCs细胞生长曲线比阴性对照组高,在体外应用当归诱导后表达nestin。结论:当归注射液有促进脐血MSCs分化增值的作用,脐血MSC具有较强的可朔性,当归在体外使脐血间充质干细胞nestin表达增高。