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相似文献
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1.
目的 克隆mTLR-2基因氨基端序列,并表达和纯化N端融合蛋白,制备抗mTLR-2 N末端的多克隆抗体.方法 采用PCR技术扩增编码mTLR-2N端1~153氨基酸的基因,并将其克隆到pET32A载体中,测序验证;用大肠杆菌表达融合蛋白,并以Probond树脂柱纯化;免疫家兔制备多克隆抗体,采用免疫组化、流式细胞术及间接ELISA检测抗体特异性及效价.结果 成功构建了融合表达载体pET-N,表达和纯化了相应的融合蛋白,所制备多克隆抗体可与pGEX-N表达的融合蛋白反应,并可结合表达TLR-2的RAW264.7及转染mTLR-2全长基因的CHO细胞.结论 获得了mTLR-2 N末端重组融合蛋白及其可与天然mTLR-2结合的多克隆抗体.  相似文献   

2.
目的 构建人类DLK1基因的原核表达载体,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体,为研究DLK1基因的功能奠定基础.方法 从GenBank中下载人类DLK1基因全长cDNA序列并针对不合信号肽的编码序列设计引物,应用RT-PCR获得目的片段,重组入原核表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,应用亲和层析法获得重组DLK1蛋白免疫大鼠制备多克隆抗体,用ELISA检测抗体滴度.结果 成功构建了DLK1基因重组表达载体pET-28a-DLK1,表达的重组蛋白纯化经SDS-PAGE鉴定后免疫大鼠,得到了高滴度的多克隆抗体.结论 成功的原核表达载体的构建、重组蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备为进一步研究DLK1基因的功能及其在肝肿瘤中的作用提供了基础.  相似文献   

3.
目的 获得原核表达GST-Syntenin1融合蛋白,制备高效价的抗Syntenin1多克隆抗体.方法 RT-PCR扩增Syntenin1 cDNA开放阅读框(CDS)序列,亚克隆到编码GST的pGEX-4T-2原核表达载体上,将编码Syntenin1的pGEX-4T-2-Syntenin1重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Syntenin1融合蛋白表达,对融合蛋白亲和纯化.SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体效价及特异性.结果 成功制备GST-Syntenin1融合蛋白及多克隆抗体.Western blot结果表明Syntenin1兔多克隆抗体效价可达到1∶20 000,且与Syntenin1蛋白特异结合.结论 成功制备Syntenin1多克隆抗体,为进一步研究Syntenin1基因的功能奠定了基础.  相似文献   

4.
【目的】克隆、表达空肠弯曲菌表面蛋白PEB1,并制备针对该蛋白的多克隆抗体。【方法】采用PCR方法从空肠弯曲菌Penner19标准株基因组中扩增出PEB1蛋白基因,用限制性内切酶消化后插入到pUC-19克隆载体中,测序正确后,再亚克隆到融合表达载体pPro-EXHTb中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的PEB1蛋白,并经Western-blotting证实。然后,在非变性条件下用Ni-NTA亲和色谱柱纯化目的蛋白。用纯化的PEB1蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,用ELISA法检测抗体效价。【结果】在非变性条件下用Ni2+-NTA亲和色谱柱纯化PEB1融合蛋白,纯化获得的蛋白纯度大于90%。用该融合蛋白免疫小鼠后,得到抗PEB1抗体,效价达1:2×105。【结论】成功构建了空肠弯曲菌PEB1基因原核表达载体,并获得了高纯度的PEB1蛋白及其高效价多抗,对进一步制备肠粘膜高亲和力的过敏原重组BCG打下了坚实的基础。  相似文献   

5.
目的 子宫球蛋白相关蛋白1(UGRP1)是一种功能未知的分泌蛋白.通过表达、纯化蛋白、制备抗体及其在组织中表达的研究,为进一步研究其功能奠定基础.方法 从人胎肺组织中克隆得到UGRP1基因,构建重组表达质粒pGEX-5X-1/UGRP1.将此质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,表达含谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的GST-UGRP1融合蛋白.此融合蛋白经纯化分离后,免疫新西兰大白兔,制备其多克隆抗体.用Western 印迹的方法检测多抗血清.通过构建含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的EGFP-N2-UGRP1载体,转染非洲绿猴肾细胞(COS细胞)表达重组蛋白,对UGRP1的表达进行亚细胞定位.结果 成功构建了pGEX-5X-1/UGRP1载体,获得了高纯度的重组蛋白和多克隆抗体.免疫组化分析表明UGRP1表达于肺支气管上皮细胞,亚细胞定位分析证实UGRP1主要表达于细胞浆.结论 研究发现UGRP1表达于肺支气管上皮细胞和在COS细胞的胞浆中表达.经纯化获得蛋白并制备抗体,为进一步研究UGRP1的功能奠定了基础.  相似文献   

6.
目的重组表达人细胞核输入蛋白α(Importin α),制备多克隆抗体。方法提取人肝癌细胞HepG2中的总RNA,RT-PCR法扩增Importin α基因。构建pGEX-6P-1-Importin α融合表达载体,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-Importin α重组蛋白,经谷胱甘肽亲和层析纯化,然后免疫小鼠,制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。结果 RT-PCR扩增出的Importin α基因片段(1300bp)与理论大小一致。SDSPAGE和蛋白质印迹分析纯化GST-Importin α重组蛋白相对分子质量为83kD,与质谱分析的相对分子质量结果相符。重组蛋白免疫小鼠后收获抗血清,ELISA显示抗体效价高。结论在大肠埃希菌中成功表达并纯化Importin α蛋白,获得多克隆抗体,为进一步研究输入系统及其应用打下基础。  相似文献   

7.
p11融合蛋白表达、纯化及抗血清的制备   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的:表达GST-p11和6xHis-p11融合蛋白并制备GST-p11特异性抗体。方法:将人p11基因克隆人两种原核表达载体pGEX-4T-2和pQE30,分别在大肠杆菌BL21和M15中表达,用Glutathione Sepharose 4B和Ni-NTA agarose亲和柱分别纯化目的蛋白。利用纯化的GST-p11蛋白制备多克隆抗体。结果:得到高表达量的融合蛋白,经亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST-p11和6xHis-p11蛋白。以GST-p11蛋白免疫新西兰兔得到p11多克隆抗体,Westernblotting证实该杭体能够识别6xHis-p11蛋白,具有较高特异性。结论:利用原核表达人p11融合蛋白制备的p11多克隆抗体具有较好的特异性,为研究p11蛋白在蛋白转运和定位过程中的作用提供重要的技术和材料保障。  相似文献   

8.
目的 分泌表达重组登革病毒2型NS1蛋白,并制备兔抗NS1多克隆抗体.方法 应用毕赤酵母表达系统表达全长登革病毒2型NS1蛋白,制备抗原,免疫家兔;采集免疫血清,制备兔抗NS1蛋白多克隆抗体;应用Western-blot、ELISA法鉴定和检测抗体效价;经辛酸-硫酸铵法、亲和层析法纯化抗体,SDS-PAGE电泳检测抗体的纯度;用Western-blot、ELISA法检测纯化后IsG性质及效价.结果 重组NS1蛋白获得分泌表达,其免疫血清经Western-blot、ELISA法证实获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,抗体效价为1:6000.结论 重组登革病毒2型NS1蛋白在毕赤酵母真核表达系统中高效表达,纯化产物有较强的免疫原性,成功获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体在登革病毒致病与免疫机制中的作用奠定了基础.  相似文献   

9.
目的 克隆migfilin-N末端基因并使其在大肠杆菌中高效表达,纯化基因表达产物并进行多克隆抗体制备,为研究migfilin与大肠癌的关系奠定基础.方法 根据人migfilin全长cDNA系列,设计PCR引物,以人大肠癌cDNA文库为模板克隆migfilin-N末端基凶,将扩增产物克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1中,经EcoRI/XhoI双酶切鉴定后,进行DNA序列测定.GST-migfilin-N融合蛋白在硫代半乳糖苷诱导下在大肠杆菌BL21中得到表达.利用谷胱甘肽亲和层析纯化融合蛋白,用纯化的GST-migfilin-N融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体.并用纯化的抗migfilin多克隆抗体在不同的细胞株中用Western blotting检测migfilin的表达.结果 成功克隆了migfilin-N端基因片段,表达并纯化了GST-migfilin-N融合蛋白,制备了migfilin特异性抗体.Western blotting检测migfilin在不同细胞株中的表达,结果显示migfilin在肺癌及大肠癌细胞株中高表达.结论 migfilin特异性抗体制备成功,为深入探讨migfilin在大肠癌中的作用奠定了基础.  相似文献   

10.
目的:构建BC022687的原核表达载体,诱导该质粒在大肠杆菌中表达并纯化其表达的融合蛋白,制备抗体并进行特异性鉴定。方法:采用RT-PCR法从18-20g体重雄性小鼠睾丸组织中扩增BC022687cDNA,经TA克隆及亚克隆方法后定向连入原核表达质粒pET-28a,将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL-21(DL3)上,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,用考马斯亮蓝染色及Western blot分析鉴定后,利用镍亲和层析法纯化表达融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,以诱导表达的融合蛋白为样本,Western blot实验检测抗体的特异性。结果:测序结果证实成功扩增出目的基因BC022687;酶切和测序结果证实pET-28a-BC022687原核表达载体构建成功;SDS-PAGE电泳显示表达出18.0kU的外源蛋白。Western blot检测结果显示,表达出的蛋白为6×His tag的融合蛋白,而且Ni-NTA亲和层析法纯化该重组蛋白成功;将纯化的融合蛋白免疫新西兰兔,制备获得了抗BC022687蛋白的多克隆抗体,鉴定实验显示抗体特异性好。结论:已成功构建、表达、纯化了BC022687融合蛋白,以及成功制备了其特异性抗体,为研究BC022687蛋白在精子发生中的作用奠定了基础。  相似文献   

11.
目的:包装带有人U6启动子及c-Met短发夹环的重组腺相关病毒,为抑制c-Met的表达及进行肿瘤基因治疗研究奠定基础。方法:通过PCR方法将带有c-Met短发夹结构的片段构建至人U6启动子下游,将U6shMet构建至腺相关病毒载体质粒pSNAV中,将pSNAVUshMet转染BHK细胞,经G418筛选后加辅毒rHSV1-repcap包装成携带U6shMet的重组腺相关病毒。SDS-PAGE电泳分析病毒纯度,斑点杂交测定病毒滴度。结果:获得了2段带有c-Met短发夹结构的片段U6shMet1和U6shMet2,成功包装了2个带有U6shMet序列的重组腺相关病毒rAAVUshMet1和rAAVUshMet2,纯化后的病毒电泳分析条带清晰、杂带少,病毒滴度均为4×1012mg•L-1。结论:成功构建了带有U6shMet的重组腺相关病毒rAAVUshMet,病毒纯度好、滴度高,为抑制c-Met的表达及进行肿瘤基因治疗提供了运载工具。  相似文献   

12.
目的:制备高纯度ATP合酶β亚基(ATP5B)单克隆抗体并进行鉴定,为其后续研究奠定基础。方法:应用PCR法扩增ATP5B基因,克隆入pET28a载体中并转入大肠杆菌BL21(DE3)。异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达并用镍亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白纯度。用纯化的融合蛋白免疫3只雌性Balb/C小鼠,取小鼠尾静脉血,间接酶联免疫吸附法(ELISA法)检测血清中ATP5B抗体效价。取血清效价最高的免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞混合培养建立杂交瘤细胞,采用间接ELISA法筛选融合细胞并行单克隆化培养,对阳性细胞进行核型分析。取12周龄Balb/C小鼠,腹腔注射杂交瘤细胞制备腹水模型,收集腹水,间接ELISA法检测效价,SDS-PAGE检测抗体纯度,应用ELISA法检测抗体亚型。结果:PCR扩增后得到1 455bp的特异性条带,连接pET28a空载体获得重组pET28a/ATP5B载体。IPTG诱导转化的菌液表达目的蛋白,SDS-PAGE检测,在相对分子质量为51 000处出现明显的诱导蛋白条带。间接ELISA法检测免疫小鼠静脉血,血清效价最高达1:64 000。杂交瘤细胞染色体核型分析,染色体总数约为骨髓瘤细胞与正常小鼠脾细胞之和。采用杂交瘤细胞株制备小鼠腹水,抗体最高效价为1:240 000,杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的亚型为IgG1。结论:通过克隆、表达和纯化重组蛋白,成功制备出抗ATP5B蛋白单克隆抗体。  相似文献   

13.
目的构建及表达具有huGM-CSF和huIL-6双重生物学活性的huGM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)融合蛋白分子.方法应用PCR技术对huGM-CSF和huIL-6的基因分别加以改造,同时在二者之间加上连接肽序列(G-G-S-G-S)3,克隆PCR产物,并构建成pBV220-GM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)表达质粒,表达质粒导入E.coli DH5α中诱导表达.通过Q Sepharose H.P.离子交换柱和Sephacryl S-200分子筛柱二步柱纯化以获取目的蛋白.使用huGM-CSF依赖细胞株TF1和huIL-6依赖细胞株B9通过MTT法测量融合蛋白的生物学活性.结果 pUC18-GM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)的测序结果表明,其序列与理论设计完全一致,表达质粒在E.coli DH5α中得到高效表达,表达的融合蛋白占总蛋白含量的25%以上,表达产物以包涵体的形式存在,通过Q Sepharose H.P.离子交换柱和Sephacryl S-200分子筛柱二步柱纯化及复性后获得目的蛋白,其纯度达到95%以上.融合蛋白具有huGM-CSF和huIL-6的双重生物学活性,其促进huGM-CSF依赖细胞株TF-1和huIL-6依赖细胞株B9增殖的比活性分别为1.08×108U/mg和1.95×107 U/mg.结论获得了具有较高纯度和双重生物学活性的GM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)融合蛋白.  相似文献   

14.
目的 表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的人LINGO-1胞外段(hLINGO-1_(aa76-319))融合蛋白,并制备兔源性抗hLINGO-1_(aa76-319)的多克隆抗体(pAb).方法 利用PCR从pCMV-SPORT6获得hLINGO-1_(aa76-319)编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pET30a(+),构建重组表达质粒pET30a(+)-hLINGO-1_(aa76-319);将阳性重组质粒转化大肠杆菌,IPTG诱导表达6×His-hLINGO-1_(aa76-319)融合蛋白,经Ni-NTA螯合树脂纯化,纯化蛋白免疫新两兰大白兔制备多克隆抗血清,Protein A Sepharose柱纯化获得多抗,ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性.结果 成功构建了pET30a(+)-hLINGO-1_(aa76-319)原核表达载体,原核蛋白hLINGO-1_(aa76-319)以包涵体形式在大肠杆菌高水平表达,通过复性与亲和层析获得纯度在90% 以上的hLINGO-1_(aa76-319)蛋白,蛋白浓度为4600 mg/L,制备的抗hLINGO-1_(aa76-319)多抗效价高达1:1.6×106,Western blotting鉴定其具有良好的特异性.结论 获得高纯度hLINGO-1_(aa76-319)蛋白并成功制备特异性pAb,为进一步研究LINGO-1的生物学功能提供实验基础.
Abstract:
Objective To express and purify the fusion protein of extracellular domain of human Ig domain-containing, neurite outgrowth inhibitor (Nogo) receptor-interacting protein-1 (LINGO-1_(aa76-319)) in prokaryotic cells and prepare the rabbit anti-LINGO-1 polyclonal antibody (pAb). Methods The 732 bp DNA sequence of hLINGO-1_(aa76-319), was obtained from pCMV-SPORT6 by PCR and inserted into pET30a (+) plasmid to construct the prokaryotic expression plasmid pET30a(+) -hLINGO-1_(aa76-319) which was subsequently transformed into E.coli. The target fusion protein was expressed with IPTG induction and purified by Ni~(2+)-NTA affinity chromatography column. The antiserum against hLINGO-1_(aa76-319) was obtained from the rabbits immunized with hLINGO-1 _(aa76-319), and the titer of the pAb was determined using enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and its specificity identified using Western blotting. Results The prokaryotic expression plasmid pET30a (+)-hLINGO-1_(aa76-319) was constructed successfully. Efficient expression of the target fusion protein was achieved with IPTG induction at the optimal concentration of 0.4 mmol/L and culture temperature at 37 ℃ for 2.5 h. The hLINGO-1_(aa76-319) fusion protein was effectively expressed in E.coli as inclusion bodies, and the soluble protein was obtained through denaturation and refolding procedures, and the purified fusion protein showed a purity above 90%. The titer of the anti-hLINGO-1_(aa76-319) pAb obtained by immunizing the rabbits with the purified protein reached l:1.6×10~6, and Western blotting confirmed its good specificity. Conclusion The fusion protein hLINGO-1_(aa76-319) with high purity has been obtained and the anti-hLINGO-1_(aa76-319) pAb obtained shows a high titer and good specificity, which provide important experimental basis for further functional investigation of LINGO-1.  相似文献   

15.
目的:制备具有免疫原性的EB病毒潜伏膜蛋白2A (latent membrane protein 2A,LMP2A)的表位串联蛋白并分析其免疫学特性?方法:用DNAstar软件分析LMP2A的抗原表位,将预测的免疫原性较强的两个表位通过基因合成串联在一起,克隆到原核表达载体pET28a中,经大肠杆菌BL21表达并纯化?制备的含LMP2A表位重组蛋白经SDS-PAGE?Western blot鉴定后,免疫小鼠制备多克隆抗体,以ELISA检测抗体的效价,免疫组织化学法检测该抗体对天然LMP2A的特异性?结果:通过原核表达与纯化,获得高纯度的表位融合蛋白,经小鼠免疫并制备效价高且特异性的小鼠抗LMP2A的多克隆抗体,该抗体可用于ELISA和免疫组织化学分析?结论:本研究制备的表位融合蛋白,具有天然抗原的免疫原性,可制备能特异性识别天然LMP2A分子的多克隆抗体,为利用表位融合蛋白筛选全人源基因工程抗体奠定了基础?  相似文献   

16.
恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定   总被引:3,自引:0,他引:3  
目的:在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白,测定重组蛋白的免疫活性。方法:采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫(海南株)GDH基因,双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清,并用琼脂双向扩散法检测效价,ELISA、Westernblotting检测重组抗原的免疫活性。结果:获到了重组表达的抗原蛋白,表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1:16。结论:恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。  相似文献   

17.
目的 :构建结核分枝杆菌 (MTb) 1hp -esat6融合基因及其原核表达载体并进行表达。方法 :用GeneSOEing法 ,将1hp基因和esat6基因体外重组 ,构建融合基因 ,克隆入pQE30质粒中进行表达。 结果 :构建的融合基因经测序证实完全正确 ,重组体转化表达菌DH5α后 ,经过IPTG诱导 ,表达出 2 6kDa左右的CFP10 -ESAT6融合蛋白。SDS -PAGE分析显示 ,IPTG诱导 4h表达量最高 ,表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中 ,表达量占全菌蛋白质的 4 0 % ,Westernblotting证实其有良好的抗原性。表达蛋白经过Ni-NTA柱纯化后 ,获得了纯度为 98%的重组蛋白。结论 :成功构建MTblhp -esat6融合基因 ,成功构建原核表达载体pQE30 -CFP10 -ESAT6 ,并获得重组CFP10 -ESAT6融合蛋白 ,为MTb重组抗原的应用奠定了基础。  相似文献   

18.
目的:制备CD20的单克隆抗体(mAb),并探讨对治疗B细胞淋巴瘤的作用机制。方法:构建重组表达质粒pGEX-4T-1-CD20和pET-32a-CD20。以融合蛋白CD20-GST为免疫源免疫BALB/c雌性小鼠制备(mAb)。结果:CD20-GST和CD20-His蛋白在大肠杆菌中可高效表达,经纯化后可获得高纯度的CD20蛋白。结论:成功制备高纯度CD20蛋白并以此为抗原制备了1株能够稳定分泌抗人CD20的鼠单mAb的杂交瘤细胞株BD11F4。临床试验结果表明,抗CD20单克隆抗体既可单独应用,亦可作为放射性同位素或细胞毒制剂的载体,其疗效显著,且使用安全,副反应小。许多研究报道已阐明了抗CD20单克隆抗体治疗B细胞淋巴瘤的几种可能的效应机制。目前,人们正致力于探索一些新的治疗策略以期提高这种疗法的特异性,减少其非特异性的毒副作用。  相似文献   

19.
目的在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白,测定重组蛋白的免疫活性。方法采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫(海南株)GDH基因,双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清,并用琼脂双向扩散法检测效价,ELISA、Western blotting检测重组抗原的免疫活性。结果获到了重组表达的抗原蛋白,表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1∶16。结论恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。  相似文献   

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