两种果子狸血清IgG纯化方法的比较

目的探讨一种具有简便快捷、高纯度、活性好的果子狸血清IgG纯化方法。方法比较Hitrap Protein A亲和层析和PAGE电泳两种纯化法对果子狸血清IgG的纯化,用PAGE还原电泳和Western-Blot法对IgG作纯度鉴定。结果对Hitrap Protein A纯化的果子狸血清IgG,其活性虽好,但纯度不高;而非还原PAGE电泳所纯化的果子狸血清IgG不但纯度高(>95%)、并具有较强的免疫活性。结论非还原PAGE电泳法纯化果子狸血清IgG,是一种具有高纯度、免疫活性强的纯化方法。     

貉血清IgG纯化及抗血清的制备

目的制备高纯度貉血清IgG和兔抗貉IgG抗血清,作为建立多种动物抗体检测技术的储备。方法采用Hitrap Protein A亲和层析及盐析再沉淀法纯化貉血清IgG,通过PAGE电泳和Western-Blot免疫印迹法对IgG作纯度及免疫活性检测;常规免疫法制备兔抗貉IgG血清。结果貉血清IgG与Protein G虽有较强的结合力,但同时也结合血清中其他杂蛋白;用二步纯化法可从5 mL貉血清中纯化IgG约7 mg,电泳和免疫印迹测定显示,IgG纯度大于95%,常规免疫法制备抗血清免疫双扩散效价达1∶32。结论建立了可行的貉血清IgG的纯化方法和高效价的兔抗貉血清IgG抗血清,为貉血清IgG二级抗体酶联物的制备储备了资源。     

从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位

目的：建立一种有效从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位HspA的方法。方法：重组基因工程大肠杆菌发酵后，表达的Hp r HspA包涵体经洗涤，变性，复性，采用Q Sepharose High Performance阴离子交换层析和Superdex75凝胶过滤层析分离纯化，使用SDS－PAGE和HPLC检测纯度，选用ELISA和动物实验对纯化蛋白的免疫学活性和生物学活性进行鉴定。结果：Hp的HspA包涵经洗涤和溶解后，Hp的HspA的纯度＞60％，包涵体溶解液经阴离子交换层析和凝胶过滤层析后纯度超过95％，Hp的HspA纯品经检测具有良好的免疫学活性和生物学活性。结论：本研究建立的分离纯化方法可从包涵体中获得高纯度的重组HspA蛋白，为进一步的动物实验研究奠定了基础。     

长爪沙鼠IgG的纯化及抗血清的制备

目的纯化长爪沙鼠血清IgG,制备兔抗长爪沙鼠IgG抗血清。方法采用Hitrap Protein G亲和层析预装柱来纯化长爪沙鼠血清IgG;通过SDS-PAGE电泳和Western-Blotting免疫印迹法对长爪沙鼠血清IgG进行纯度鉴定,免疫兔子制备抗血清。结果7 mL长爪沙鼠血清纯化得到11 mg IgG;电泳和免疫印迹测定,IgG纯度大于95%;用纯化的IgG作抗原制备了兔抗血清,免疫双扩散测定效价达1∶32。结论建立了长爪沙鼠血清IgG的纯化方法,制备了长爪沙鼠IgG抗血清,证实长爪沙鼠血清IgG和Protein G具有较高的亲和性。     

两种鸡蛋黄IgG提取方法的对比研究

从免疫鸡的蛋黄中提取特异性IgG抗体,是一条简便而廉价的制备诊断用抗体制品的途径。作者建立并比较了两种鸡蛋黄IgG提取方法。结果显示,两法均可从每毫升超免疫鸡的蛋黄中提取到16～17mg IgG制品,而且法Ⅱ提取之蛋黄IgG制品的纯度和抗体活性比法Ⅰ高。由于法Ⅰ和法Ⅱ提取的蛋黄IgG制品分别含有22％和16％的无关蛋白质,因此,如需高纯度蛋黄IgG制品,还须对其进一步纯化。     

兔抗麻雀IgY酶标抗体的制备

目的制备辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗麻雀IgY抗体,为禽类血清学检测体系的建立提供技术储备。方法硫酸铵盐析法粗提麻雀血清IgY,进一步在SDS-PAGE上分离后,切下带有目的条带的凝胶作为免疫原,免疫实验兔制备抗血清,Protein-A柱亲和纯化兔抗IgY血清IgG,,使用改良过碘酸钠法制备酶结合物。ELISA检测酶标抗体的工作浓度,western blotting检测酶标抗体的特异性。结果硫酸铵盐析法粗提IgY,可去除部分杂蛋白,SDS-PAGE上分离后切下带有目的条带的凝胶,可以得到足够纯度的抗原,将带有IgY的凝胶作为抗原免疫后获得的抗血清经Protein-A纯化后,二抗在SDS-PAGE上鉴定,纯度达到99%以上。改良的过碘酸钠法标记获得的抗体浓度为1.008 mg/mL,ELISA检测酶标抗体效价为1∶1000。Western blotting鉴定抗体具有特异性。结论获得了优质可靠的兔抗麻雀IgY酶标抗体。     

单增李斯特菌多克隆抗体制备及其在乳胶凝集试验中的应用

目的：制备高效价高纯度兔抗单增李斯特菌（LM）多克隆抗体,并初步探讨其在乳胶凝集试验(LAT)中的应用。方法：复苏并扩大培养LM标准菌株,制备灭活疫苗免疫家兔,采用ELISA法测定耳缘静脉血抗体效价。4次免疫后,颈动脉采血分离血清,采用辛酸-饱和硫酸铵法粗分离,经蛋白亲和层析柱HiTrap Protein G HP进行IgG纯化,采用SDS-PAGE电泳、紫外分光光度法、间接ELISA法分别测定蛋白纯度、蛋白含量及抗体效价。得到的高效价提纯IgG与乳胶微球进行共价偶联,并选择偶联乳胶的IgG含量及偶联时间等条件,建立快速检测模拟样品中LM的方法。结果：制备并纯化的兔抗LM IgG蛋白浓度为23.364 g·L^-1,效价为1∶12 800~1∶25 600,与霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺菌等多种菌均无交叉反应,与斯氏李斯特菌有弱交叉反应;致敏时IgG与乳胶微球偶联比率为1∶40;利用LAT方法检测246份样品,阳性检出率为87.5％,最低检出抗原含量为0.039 8 g·L^-1。结论：制备了高效价、高纯度的兔抗LM多克隆抗体;建立的LAT方法特异性强,敏感性较高,重复性好,便于基层推广使
用,为LM的现场检测提供了一种新手段。     

蝙蝠血清IgG的纯化及兔抗蝙蝠IgG酶标抗体的制备

目的纯化蝙蝠血清IgG,制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体。方法采用亲和层析纯化法纯化蝙蝠血清IgG,SDS-PAGE电泳鉴定蝙蝠IgG纯度。免疫大白兔制备兔抗蝙蝠IgG抗血清,免疫双扩散法测定抗血清效价,亲和层析纯化法纯化抗血清IgG。用改良过碘酸钠标记法制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体,直接ELISA和Western blot法对兔抗蝙蝠IgG酶标抗体进行工作浓度测定。结果纯化的蝙蝠血清IgG,其SDS-PAGE测定纯度大于95%;免疫大白兔所制备的抗血清免疫双扩散效价为1∶64;用改良过碘酸钠标记法制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体,其直接ELISA和Western blot工作浓度分别为1∶12800和大于1∶2000。结论制备了蝙蝠血清IgG的抗血清和酶标抗体,为蝙蝠的血清学检测体系提供了技术和资源储备。     

应用辛酸硫酸胺法提取小鼠腹水和血清中的IgG抗体

目的：从小鼠腹水和血清中纯化 IgG抗体。方法：首先用辛酸沉淀小鼠腹水和血清中的非免疫球蛋白,然后用固体硫酸胺提取抗人 T和 B细胞白血病单克隆抗体 (IgG1和 IgG2b)和多克隆 IgG抗体。结果：经 SDS-PAGE和活细胞免疫荧光法鉴定,获得了纯度高、活性好的抗体,腹水中单抗的回收率达 80％以上。结论：本方法是一种简单、价廉且有效的纯化小鼠腹水和血清 IgG抗体的方法。     

重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的分离纯化工艺建立

目的 建立大肠杆菌高密度表达的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白(STH)分离纯化工艺.方法 高密度培养重组大肠杆菌并诱导表达STH,离心收集菌体,反复冻融后收集上清液经超滤、两步阴离子交换层析,分离纯化STH目的 蛋白.结果 纯化后的STH纯度为98%以上,纤溶比活性2.6×104IU/mg,活性回收率56%.结论 建立了STH的纯化工艺,该纯化工艺简便,时程短,重复性好,适合于大规模生产.     

酵母表达中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的初步纯化

目的：研究酵母表达中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）的纯化方法。方法：表达上清用（NH4）2SO4盐析、凝胶过滤、阳、阴离子交换层析等方式进行纯化。通过比较产品纯度、收率与质量确定最佳实验方案。纯化产品用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western blot、等电聚焦与高效液相色谱进行鉴定。结果：获得较高纯度的NGAL。结论：（NH4）2SO4盐析、凝胶过滤和阳离子交换是纯化酵母表达NGAL的最佳实验方案。     

重组人瘦素的分离纯化

目的：探索毕赤酵母表达的人瘦素的非亲和层析纯化方法。方法：采用强阴离子交换柱(Sepharose Qfast flow)和疏水层析柱(Phenyl Sepharose 6 fast flow)在pH7．5的条件下进行纯化。结果：经Q柱一步纯化后，产物纯度由42．3％到达89．6％，随后通过疏水层析纯化后，产物纯度达到96．2％。经SDS—PAGE证实为单一蛋白条带。结论：通过上述手段已成功分离纯化得到纯度较高的由毕赤酵母表达的重组人瘦素。     

CD80-IgG融合蛋白的表达、纯化与鉴定

目的构建CD80-IgG融合基因表达载体，表达并纯化该融合蛋白，初步探讨其增强抗肿瘤免疫的作用。方法将小鼠CD80分子胞外段和IgG Fc段cDNA串联起来，定向克隆入质粒pcDNA3．0中，使其在哺乳动物细胞中表达。采用免疫亲和层析法纯化，免疫印迹和斑点ELISA鉴定表达的融合蛋白，流式细胞术、MTT法检测其增强白血病细胞CD80分子表达及促进T细胞增殖的功能。结果DNA测序证明两段基因正确插入质粒载体；亲和层析纯化得到浓度为0．1mg／ml，纯度为95％的蛋白质溶液；免疫印迹、ELISA表明该蛋白质即为CD80-IgG融合蛋白；流式细胞术证明其能够提高白血病细胞表面CD80分子的表达。结论成功构建融合基因表达载体，表达并纯化出融合蛋白，该蛋白可增强CD80分子的表达。     

抗白色念珠菌鸡卵黄抗体(IgY)的研制

目的：观察鸡蛋黄中抗体的产量、纯度、来源及稳定性。方法：应用白色念珠菌作为抗原免疫25周龄Leghorn鸡，通过改良水溶法（WD）提取蛋黄中抗体IgY，双紫外光测定抗体含量，SDS-APGE电泳检测抗体纯度，Western blot免疫印迹法测定该抗体来源，ELISA检测热处理后的抗体活性。结果：抗体含量13mg/ml蛋黄液，抗体纯度达到95%，Western blot免疫印迹证明该抗体与鸡血清中的IgG具有相同的分子量和抗原性。ELISA检测热处理后的抗体活性，其具有良好的热稳定性。结论：鸡蛋黄内含有丰富的抗体，通过WD水溶提取法可得到高产量，高纯度的特异性抗体IgY，证明其来源于鸡血清中的IgG，对热具有高度稳定性。     

人源吲哚胺2,3-双加氧酶-2的表达与纯化

 目的  构建人源吲哚胺2,3-双加氧酶-2 (human indoleamine 2,3-dioxygenase-2,hIDO2)原核表达载体,表达、纯化获得hIDO2蛋白。方法  采用基因工程手段获得hIDO2原核表达载体并转化表达菌株,筛选合适的重组质粒及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)浓度进行蛋白表达;通过亲和层析纯化重组hIDO2,BCA法测定蛋白浓度并计算蛋白收率;SDS-PAGE电泳检测hIDO2表达情况,通过软件分析得到蛋白纯度;Western blot检测目的蛋白特异性。结果  重组质粒经电泳分析、双酶切、DNA测序鉴定表明构建成功;经筛选发现重组质粒pET28a-hIDO2比pGEX-4T-1-hIDO2的hIDO2表达效果好;SDS-PAGE电泳及Western blot均验证了在相对分子质量45 000处的特异性目的条带的存在;经测定及计算得出蛋白纯度为97.1%,蛋白浓度为20 mg/mL,蛋白收率为15 mg/L。结论  成功构建重组质粒用于表达及纯化hIDO2,蛋白浓度、纯度、收率及特异性均较高。     

hIL-15-SA双功能融合蛋白的制备

目的：对双功能融合蛋白hIL-15-SA的发酵及纯化工艺进行研究。方法：采用发酵罐高密度发酵hIL-15-SA工程菌,通过镍柱亲和层析及阴离子交换层析纯化目的蛋白。免疫印迹分析产物,淋巴细胞增殖试验以及细胞锚定试验检测双功能融合蛋白hIL-15-SA的生物学活性。结果：采用半合成培养基,以3%的接种量,pH值为7.2发酵可得到湿菌47 g/L,21.15 g/L包涵体。经纯化后目的蛋白纯度为97%。细胞增殖试验和细胞表面锚定修饰试验表明,经纯化复性的hIL-15-SA融合蛋白具有双重生物活性。结论：本研究获得了高产量、高纯度的hIL-15-SA双功能融合蛋白,为后续的体内生物学功能研究奠定了基础。     

亲和层析纯化重组中性粒细胞激活蛋白

目的:直链淀粉树脂亲和层析法分离纯化重组麦芽糖结合蛋白-中性粒细胞激活蛋白(recombinantmaltose-binding protein-neutrophil-activating protein,rMBP-NAP)。用于支气管哮喘模型小鼠进行免疫调节实验。方法:IPTG诱导基因工程菌E.coli TB1(pMAL-c2X-nap)表达rMBP-NAP,离心收获细胞,过柱缓冲液重悬菌体并超声破碎,再次离心取上清和沉淀,SDS-PAGE分析rMBP-NAP可溶性;直链淀粉树脂亲和层析法分离纯化rMBP-NAP;SDS-PAGE凝胶扫描分析纯化后rMBP-NAP纯度;蛋白定量试剂盒测定rMBP-NAP浓度。结果:IPTG诱导工程菌表达的rMBP-NAP主要以可溶性形式存在于超声上清中,相对分子质量约为57 kD,与预期结果一致;亲和层析法纯化rMBP-NAP纯度可达96.5%,浓度可达0.625 g/L。结论:用直链淀粉树脂亲和层析法,可纯化得到高纯度、高浓度的融合蛋白rMBP-NAP。     

二氢吡啶类钙拮抗剂对钙调素依赖性...

A DEAE ion exchange chromatography procedure performed by using either gradient or stepwise elution was developed for the purification of chicken IgG antibodies from the egg yolk of immunized hens. Following this procedure, highly purified yolk IgG preparations were obtained as identified by Sephadex G 200 gel filtration as well as sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Moreover, this procedure guaranteed the recovery of antibodies of undiminished activity. The results demonstrate that the procedure is simple, reliable and practical for the yolk IgG purification. The establishment of such a method is beneficial to the production and application of egg yolk antibodies.