过氧化氢诱导BMSCs氧化衰老模型的建立及其对相关基因p16、p21、p53表达的影响

【目的】探究过氧化氢(H2O2)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)氧化应激损伤所致衰老的相关机制,摸索合适的H2O2衰老造模浓度,为后期的药物干预实验研究奠定基础。【方法】采用全骨髓贴壁法培养BMSCs,H2O2分别以100、200、300、400、500、600、700、800、1 000μmol/L浓度作用于BMSCs 2、12、24、48 h,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞代谢活力;β-半乳糖苷酶染色判断细胞衰老的建立成功与否;采用反转录荧光定量技术(RT-q real-time PCR)观察衰老相关基因p16、p21、p53表达水平的变化。【结果】当H2O2浓度700μmol/L时,BMSCs凋亡明显升高,而H2O2浓度400μmol/L时,变化不明显,甚至有刺激BMSCs增殖的作用;以500μmol/L H2O2作用BMSCs 24 h后,β-半乳糖苷酶染色阳性率显著增加,p21、p16、p53基因表达显著升高,差异均具有统计学意义(P0.05或P0.01)。【结论】以500μmol/L H2O2浓度作用于BMSCs 24 h后,可造成BMSCs氧化损伤衰老模型,并可使衰老相关基因p16、p21、p53表达上调。     

血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂RGDS对血小板释放反应的影响

【目的】观察血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（GPⅡb/Ⅲa）拮抗剂——四肽Arg-Gly-Asp-Ser（RGDS）对血小板聚集和CD62p表达的作用,探讨RGDS对血小板聚集和释放反应的影响。【方法】检测二磷酸腺苷（ADP;终浓度5μmol/L,下同）诱导血小板聚集的最大聚集率（rPA,max）、静息血小板和ADP诱导的血小板CD62p表达,检测不同浓度RGDS对ADP诱导的rPA,max的抑制率和血小板CD62p表达的抑制率,进行回归分析。【结果】5种浓度（50、100、200、400、800μmol/L）的RGDS对rPA,max均有显著抑制作用。正常人静息血小板CD62p表达率为（3.5±0.6）%;ADP激动的血小板CD62p表达率为（65.6±13.8）%,两组比较有显著性差异（P〈0.01）;50、100μmol/L的RGDS对血小板CD62p表达无抑制作用;当RGDS浓度≥200μmol/L时（200、400、800μmol/L）,其可抑制血小板CD62p的表达;RGDS对rPA,max的抑制作用和其对血小板CD62p表达的抑制作用相关。【结论】RGDS浓度〈200μmol／L时，对ADP诱导的血小板释放反应无影响；RGDS浓度≥200μmol/L时，可抑制ADP诱导的血小板释放反应；与RGDS显著的抗聚集效应相比，其对血小板释放反应的影响比较小：RGDS抑制血小板释放反应的作用与其抗血小板聚集有关。     

EGb761对谷氨酸诱导海马神经元兴奋毒性损伤中p75NTR表达的影响

目的：观察谷氨酸诱导海马神经元兴奋毒性损伤中神经营养因子受体p75（p75neurotrophin receptor,p75NTR）表达水平的变化,探讨银杏叶提取物（EGb761）抗兴奋毒性神经保护作用与p75NTR的相关性.方法：建立谷氨酸诱导的新生大鼠海马神经元兴奋毒性损伤模型,观察25200mg/L剂量下EGb761的神经保护作用;RT-PCR,Western Blot及细胞免疫荧光染色方法检测p75NTR的表达变化.结果：100mg/LEGb761预处理给药的神经保护效果最明显;谷氨酸刺激后,p75NTR在mRNA和蛋白质水平的表达较对照组明显增高（P〈0.01）;EGb761本身对p75NTR表达无影响,而EGb761预处理组p75NTR在mRNA和蛋白质水平的表达较谷氨酸组均显著降低（P〈0.05）.结论：p75NTR在谷氨酸诱导兴奋毒性神经损伤中起着重要作用,EGb761抗兴奋毒性神经保护作用可能与抑制p75NTR的表达有关.     

血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂RGDS对血小板释放反应的影响

 【目的】观察血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（GPⅡb/Ⅲa）拮抗剂——四肽Arg-Gly-Asp-Ser（RGDS）对血小板聚集和CD62p表达的作用,探讨RGDS对血小板聚集和释放反应的影响。【方法】检测二磷酸腺苷（ADP;终浓度5μmol/L,下同）诱导血小板聚集的最大聚集率（rPA,max）、静息血小板和ADP诱导的血小板CD62p表达,检测不同浓度RGDS对ADP诱导的rPA,max的抑制率和血小板CD62p表达的抑制率,进行回归分析。【结果】5种浓度（50、100、200、400、800μmol/L）的RGDS对rPA,max均有显著抑制作用。正常人静息血小板CD62p表达率为（3.5±0.6）%;ADP激动的血小板CD62p表达率为（65.6±13.8）%,两组比较有显著性差异（P〈0.01）;50、100μmol/L的RGDS对血小板CD62p表达无抑制作用;当RGDS浓度≥200μmol/L时（200、400、800μmol/L）,其可抑制血小板CD62p的表达;RGDS对rPA,max的抑制作用和其对血小板CD62p表达的抑制作用相关。【结论】RGDS浓度〈200μmol／L时，对ADP诱导的血小板释放反应无影响；RGDS浓度≥200μmol/L时，可抑制ADP诱导的血小板释放反应；与RGDS显著的抗聚集效应相比，其对血小板释放反应的影响比较小：RGDS抑制血小板释放反应的作用与其抗血小板聚集有关。     

p21Waf1／Cip1甲基化调控细胞衰老

目的：探讨 p21Waf1／Cip1启动子甲基化改变对细胞衰老进程的影响。方法采用克隆、测序的方法定量检测p21Waf1／Cip1启动子在人胚肺二倍体成纤维细胞（2BS）衰老过程中的甲基化改变;RT‐PCR和Western blot检测p21Waf1／Cip1的表达;采用5‐氮杂‐2‐脱氧胞苷去甲基化处理2BS细胞,通过M T T和β‐半乳糖苷酶染色检测细胞衰老。结果 p21Waf1／Cip1启动子在年轻2BS中,CpG甲基化的发生率为1．25％;在中年细胞中为27．27％;在衰老2BS细胞中为0．64％;p21Waf1／Cip1的表达在细胞衰老过程中呈波动性变化,先增加,后降低,到细胞开始衰老时,表达又显著增加;中年2BS细胞经5‐氮杂‐2‐脱氧胞苷处理后,p21Waf1／Cip1表达增加,细胞增殖速率较正常中年细胞显著降低,同时细胞β‐半乳糖苷酶染色阳性率增加。结论 p21Waf1／Cip1去甲基化加速细胞衰老。     

氧化应激对内皮细胞NF-κB、iNOS和NO信号表达的影响

目的观察氧化剂第三丁基过氧化氢（t-BHP）对体外培养的内皮细胞存活率及核转录因子κB（NF-κB）、iNOS和一氧化氮（NO）的影响。方法体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,用不同浓度的t-BHP处理,具体如下：（1）检测细胞存活率。t-BHP作用浓度分别为12.5,25,50,100μmol/L,作用时间分别为30,60,90,120 min,采用MTT法观察;（2）检测NF-κB p65、iNOS蛋白表达量及细胞内NO水平。t-BHP的作用浓度为50μmol/L,作用时间分别为30,60,90,120 min,采用Western blot测NF-κB p65、iNOS蛋白表达量,Griess化学显色法测细胞内NO水平;（3）iNOS抑制剂左旋硝基精氨酸甲酯（L-NAME,600μmol/L）预处理内皮细胞24 h,用Griess化学显色法检测细胞内NO水平。结果 t-BHP可降低内皮细胞的存活率,且呈时间及剂量依赖性,50μmol/Lt-BHP作用30 min细胞核NF-κB活化片段p65蛋白表达达高峰,作用60 min细胞质iNOS蛋白达高峰;iNOS抑制剂L-NAME可明显抑制内皮细胞NO升高。结论氧化应激可引起内皮细胞损伤,其效应可能通过NF-κB-iNOS-NO途径介导。     

低氧对人胃癌细胞p53 异构体表达的影响及意义

目的 探讨p53 异构体在缺氧诱导的胃癌细胞中的作用及分子机制,为筛选胃癌精准治疗靶分子, 以及临床诊断和治疗提供新思路。方法 将不同浓度的二氯化钴CoCl2（25、50 及100μmol/L）作用于人胃 癌细胞株SGC7901 模拟低氧微环境,采用CCK-8 法检测细胞活力;实时荧光定量聚合酶链反应检测HIF- 1α mRNA 的表达;巢式逆转录多聚酶链反应（nRT-PCR）检测Δ133p53α、Δ133p53β、Δ133p53γ 及 p53βmRNA 的表达;应用划痕愈合实验检测胃癌细胞迁移能力。结果 不同浓度的CoCl2 作用于人胃癌细 胞24 h,细胞活力随浓度的升高而增强（P <0.05）;不同浓度的CoCl2 对人胃癌细胞HIF-1α、Δ133p53α、 Δ133p53β 及p53β mRNA 的表达有影响（P <0.05）;25μmol/L 和50μmol/L CoCl2 组与对照组比 较,差异无统计学意义（P >0.05）;100μmol/L CoCl2 组与对照组比较,差异有统计学意义（P <0.05）,且 100μmol/L CoCl2 组HIF-1α、Δ133p53α 及Δ133p53β mRNA 相对表达量高于对照组,而p53β mRNA 相对表达量低于对照组。对照组与实验组未检测到Δ133p53γ mRNA 的表达。划痕愈合实验结果显示缺氧 的胃癌细胞迁移速度加快。结论 低氧微环境可促进胃癌细胞生长、迁移,但缺氧需达到一定程度。p53 异 构体Δ133p53α、Δ133p53β 高表达及p53β 低表达可能是胃癌发生、发展的重要因素。     

五味子水提取液延缓叔丁基过氧化氢导致的SH-SY5Y细胞衰老研究

目的:探讨五味子水提取液(SWE)对叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞衰老的保护作用并探讨其机制。方法:将SH-SY5Y细胞分为正常组、模型组(叔丁基过氧化氢100μmol·L-1孵育12 h)和给药组(衰老处理后加不同浓度SWE);MTT法检测各组神经细胞的活力,检测乳酸脱氢酶释放量,RT-PCR法检测各组SH-SY5Y细胞中p53和p21 m RNA的表达。结果:与正常组比较,用不同浓度的t-BHP处理的SH-SY5Y细胞存活能力显著降低,并得到t-BHP诱导SH-SY5Y细胞衰老的最适条件为100μmol/L孵育12 h。与模型组比较,给予不同浓度的SWE能显著提高t-BHP损伤细胞的存活率,改善受损SH-SY5Y细胞的形态,降低LDH的释放量。给药组SH-SY5Y细胞的活力较模型组显著增强(P0.01);LDH释放量显著降低(P0.01);p53和p21 m RNA的表达明显降低(P0.01),以500μg/m L效果最好。结论:SWE对t-BHP诱导的SH-SY5Y细胞衰老有明显的神经保护作用,这可能与抑制了p53-p21通路有关。     

苦参碱诱导U937细胞分化及其相关机制

目的:观察苦参碱对U937细胞诱导分化作用,并探讨其可能作用机制.方法:采用流式细胞仪检测细胞周期分布;硝基四氮唑蓝(NBT)还原实验、CD11b,CD14表面抗原的表达及细胞形态学检测细胞分化;Western Blot检测p21Waf1/Cip1的蛋白表达.结果:苦参碱作用U937细胞后,细胞周期分析提示发生S期阻滞;NBT阳性细胞率明显增高(P<0.05),CD11b表达增加(P<0.05);细胞内p21Waf1/Cip1表达增高(P<0.05).结论:苦参碱能诱导U937细胞分化,其机制可能与细胞周期调控蛋白p21Waf1/Cip1表达的改变有关.     

吡哆胺和替米沙坦对血管紧张素II诱导的大鼠心肌细胞氧化应激的影响

 目的 探讨吡哆胺和替米沙坦对血管紧张素II诱导的大鼠心肌细胞氧化应激的影响。方法 大鼠心肌细胞培养并随机分为正常对照组【C组】,血管紧张素Ⅱ组【10-6mol/L,AngⅡ组】,吡哆胺组【吡哆胺（10 mmol/L）+ AngⅡ（ 10-6mol/L）,P组】,替米沙坦组【替米沙坦（10-6mol/L）+ AngⅡ （10-6mol/L）,T组】,联合治疗组【替米沙坦（10-6mol/L)＋吡哆胺（10 mmol/L）+ AngⅡ（ 10-6mol/L）,TP组】。 流式细胞仪检测细胞上清液中的活性氧簇（ROS）浓度,硫代巴比妥酸法（TBA）测定丙二醛（MDA）浓度,黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物岐化酶（SOD）活力,荧光实时定量PCR方法检测心肌细胞所表达的晚期糖基化终产物受体（RAGE）mRNA表达量。 结果 与AngⅡ组比较,T组、P组及TP组MDA、ROS浓度均显著降低、SOD活力显著升高（P<0.05）;与T组比较,P组、TP组的ROS浓度明显降低、SOD活力明显升高（P<0.05）;与AngⅡ组比较,T组、P组和TP组RAGE mRNA表达量明显降低（P<0.01）;与T组、P组比较,TP组的RAGE mRNA表达进一步降低（P<0.05）。结论 吡哆胺和替米沙坦协同下调大鼠心肌细胞RAGE mRNA的表达,二者均可改善氧化应激,但吡哆胺较替米沙坦强。     

NF-κB p50和p65蛋白保守结构域原核表达系统的建立

目的 为了获得具有DNA结合活性的人NF—κB p50和p65蛋白,建立人NF-κB p50和p65蛋白保守结构域的原核表达系统。方法 通过PCR法扩增获得人NF-κB p50和p65蛋白保守结构域的cDNA,后分别将其克隆到原核表达载体pET-22b( )上,转化E．coli BL-21,经诱导表达及包涵体的变性和复性处理,获得可溶性p50和p65,同时用Western—Blot鉴定NF-κB p50和p65蛋白的表达,EMSA实验检测NF-κB p50和p65蛋白的DNA结合活性。结果 构建了pET-22b／p50和pET-22b／p65原核表达质粒;p50、p65蛋白在大肠杆菌中的表达均为包涵体;变性、复性后得到了可溶性p50和p65蛋白,浓度达218μg／ml和158μg／ml;并证实可溶性p50和p65蛋白均具有DNA结合活性。结论 成功建立了pET-22b／p50和pET-22b／p65原核表达系统,获得了具有DNA结合活性的NF-κB p50和p65蛋白。     

氧化应激及p16和p53/p21与细胞衰老关系的研究进展

细胞衰老的机制主要包括外在的氧化应激理论和内在的基因调控理论。近年来,活性氧簇引发细胞衰老的途径以及p16、p53/p21等衰老相关基因的表达调节的研究取得了突出进展,进一步阐述了细胞衰老的机制。随着对细胞衰老认识的加深,细胞衰老与个体衰老、肿瘤发生的关系及细胞衰老更深刻的意义等课题,也引起了越来越多的科学研究的注意。     

肝细胞癌和慢性肝病组织中p27kip1基因表达及甲基化分析

目的研究肝细胞癌和慢性肝病中细胞周期调控因子p27kip1的表达和甲基化的关系.方法应用免疫组织化学、原位分子杂交技术分别检测正常肝组织、肝硬化、癌周肝硬化和肝细胞癌共68例标本中P27蛋白和p27mRNA的表达.应用甲基化特异性PCR技术检测正常肝组织、肝硬化和肝细胞癌共44例标本中p27基因甲基化情况.结果P27蛋白阳性率在正常肝组织(66.7%,4/6)、肝硬化(60.0%,6/10)和癌周肝硬化(50.0%,12/24)各组间差异没有统计学意义(P>0.05),p27mRNA阳性率在正常肝组织(83.3%,5/6)、肝硬化(70.0%,7/10)和癌周肝硬化(75.0%,18/24)各组间差异也没有统计学意义(P>0.05),但肝细胞癌组P27蛋白(21.4%,6/28)和mRNA(25.0%,7/28)的阳性率与各组比较均显著下降(P<0.05).P27蛋白阳性信号在正常肝组织和肝硬化组主要定位于胞核,而癌周肝硬化组和肝细胞癌组主要定位于胞浆.正常组与肝硬化合并组P27蛋白和p27mRNA表达具有相关性,癌周肝硬化组和肝细胞癌组P27蛋白与p27mRNA表达不具有相关性.44例样本中检出1例肝细胞癌的p27基因发生甲基化,其蛋白和mRNA表达均呈阴性.结论P27蛋白及p27mRNA表达下降或缺失可能参与了肝细胞癌的发生和发展,p27基因甲基化可能导致p27mRNA的失转录.     

强直性脊柱炎患者的食管运动功能

研究诱导型一氧化氮合酶 （ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ 　ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ, ｉＮＯＳ）在电离辐射导致的神经细胞凋亡中的作用。 方法：以单剂量２．０ Ｇｙ γ射线照射出生后 ０ ｄ的 Ｗｉｓｔａｒ大鼠,用 ＡＢＣ法检测照射后第 ０．５、１、２、４、６、８、１２、２４、４８小时大脑皮质内ｉＮＯＳ的表达。结果：照射组各时间点均有不同程度的ｉＮＯＳ表达,第６小时达峰值。各对照组未见ｉＮＯＳ表达。结论：ｉＮＯＳ所具有的神经毒作用可能是电离辐射导致的发育中脑神经细胞凋亡的重要因素。     

Rb2/p130基因编码蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

目的：联合检测Bb2/p130、p53和p21基因编码蛋白在非小细胞肺癌中的表达，分析其与预后的关系。方法：采用免疫组织化学方法，检测87例非小细胞肺癌病人的手术标本Rb2／p130、p53和p21基因编码蛋白的表达，并与病理组织学、临床分期、生存时间进行统计学分析。结果：Rb2／p130和p21蛋白表达阴性者分别为34例（39．1％）和42例（48．3％）。p53蛋白阳性表达者为45例（51．7％）。Rb2／p130表达缺失与肿瘤分化程度、临床分期均呈负相关（P〈0．05）。p53表达阳性率与肿瘤分化程度相关（P〈0．05），与临床分期无关。p53表达和Rb2／p130表达负相关，同时p53表达阳性和Rb2／p130表达缺失者预后差，本后生存期短（P〈0，05）。结论：在非小细胞肺癌中，Rb2／p130表达缺失和p53表达阳性提示恶性程度高，同时检测p53和Rb2／p130的表达对判断非小细胞肺癌的预后可能具有一定的临床意义。     

pRb2／p130和P27在口腔鳞癌中的表达及意义

目的探讨pRb2／p130和p27在人口腔鳞状细胞癌（Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC）中的表达及意义。方法采用sABC法免疫组织化学技术检测,38例口腔鳞癌组织和10例正常口腔粘膜的pRb2／p130和p27蛋白的表达。采用统计学分析和Image-Proplus5．0分析软件进行图像分析。结果pRb2／p130蛋白在口腔鳞癌的阳性表达低于正常口腔粘膜中的表达,二者有显著性差异（P〈0．05）,其在口腔鳞癌低分化组和高分化组中的阳性表达,二者有显著性差异（P〈0．05）;p27蛋白在口腔鳞癌低于正常口腔粘膜中的阳性表达,二者有显著性差异（P〈0．05）。在口腔鳞癌中pRb2／p130蛋白和p27蛋白表达呈显著相关性。结论pRb2／p130和p27蛋白在人口腔鳞癌中的阳性表达率随肿瘤恶性程度的增高而降低,两者可能有协同抑制人口腔鳞癌发生和恶性进展的作用。     

何首乌饮对衰老大鼠脑组织Rb细胞转导通路相关蛋白表达的影响

人体的衰老表现为各脏腑功能的衰退,尤其脑功能的衰退.细胞衰老是老年病发病的共同基础,细胞衰老过程是借助于信号转导通路阻滞实现的[1,2].生长停滞是细胞衰老的突出表现,其中Rb/p16信号通路起着重要作用,衰老大鼠脑组织中Rb细胞转导通路蛋白的表达尚未见报道.本实验应用Western blotting法探讨何首乌饮对衰老大鼠大脑皮质p16INK4a、Rb蛋白表达的影响,为研究何首乌饮抗脑组织衰老机制提供实验依据.     

肺癌组织p300/CBP基因突变机制的研究

目的探讨p300/CBP基因在肺癌中的发生、发展中的作用.方法采用PCR-SSCP及DNA序列分析技术检测30例新鲜肺癌组织p300/CBP的基因突变,以30例正常肺组织作对照.结果肺癌组织中p300/CBP基因存在1个位点的点突变,位于p300gDNA的4773碱基,T→G,突变点为编码区,丝氨酸(Ser)→精氨酸(Arg).本组30例肺癌组织中,有1例突变,结论肺癌组织中p300/CBP基因存在1个位点的点突变.     

氟桂利嗪对脑缺血再灌注损伤沙鼠脑组织p300/CBP表达的影响

目的研究氟桂利嗪对脑缺血再灌注损伤沙鼠脑组织内p300/CBP表达的影响。方法40只沙鼠随机分为对照组、假手术组、缺血再灌注组及氟桂利嗪组,每组10只。采用夹闭双侧颈总动脉制作脑缺血再灌注模型,于缺血再灌注后1 d处死动物取前脑组织;采用免疫组织化学法检查各组沙鼠脑内p300/CBP的表达情况。结果对照组及假手术组沙鼠脑内p300/CBP呈弱阳性表达,2组比较差别无统计学意义(P>0.05);缺血再灌注组沙鼠脑组织内p300/CBP阳性表达率较对照组及假手术组表达明显增强(P<0.01),氟桂利嗪组沙鼠脑组织内p300/CBP的表达较缺血再灌注组下降(P<0.05)。结论正常沙鼠脑内有p300/CBP表达;沙鼠脑缺血再灌注后脑组织内p300/CBP表达上调,氟桂利嗪可以降低其表达。     

P21/Wafl调节血管紧张素Ⅱ的抗增生作用

为了研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的抗内皮细胞增生作用及其分子生物学调节机制,将健康胎儿脐静脉内皮细胞培养至第3代,用AngⅡ培养并在不同时间计数细胞密度.用TUNEL或ELISA方法证明AngⅡ或CGP42112A诱导内皮细胞凋亡.用RT-PCR和Western Blot检测p21/waf1 mRNA和P21蛋白的表达并测定条带的光密度.结果表明,在Ang I培养后不同时间,细胞密度比对照减少30%左右(P＜0.01).AngⅡ作用后可以诱导典型的凋亡,阳性率极显著高于阴性对照组并具有剂量依赖性.AngⅡ组或CGP42112A组的p21/waf1 mRNA表达分别是对照组的(473.69±39.97)%和(391.58±48.24)%(P＜0.01).Ang Ⅱ组的P21蛋白表达比对照组极显著地增加并具有时间依赖性.认为Ang I具有抗内皮细胞增生作用,其细胞内机制是同时诱导凋亡和p21/waf1 mRNA与p21蛋白的高表达,使细胞发生G1期阻滞,增殖受抑.