基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒DNA多聚酶P结构域反式调节基因

目的：应用基因芯片技术，对乙型肝炎病毒DNA(HBVDNA)聚合酶P结构域蛋白／逆转录酶(PR)的基因表达谱进行分析，探索PR对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能。方法：设计并合成PR基因序列特异性的引物，应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增PR蛋白编码基因片段，以常规的分子生物学技术将获得的PR编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定，构建真核表达载体pcDNA3．1(-)-PR。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取mRNA，逆转录为cDNA，与转染空白表达载体pcDNA3．1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析。结果：基因芯片技术所检测的1152个基因表达谱的筛选中，79条基因表达水平上调，90条基因表达水平下调。结论：应用基因表达谱芯片成功筛选了HBVDNA聚合酶PR转染细胞后差异表达基因，为进一步阐明PR蛋白可能的分子生物学机制提供依据。     

人IFN-β基因脂质体转染胶质瘤细胞对凋亡的诱导作用

目的:观察β-干扰素(IFN-β)基因脂质体pSV2IFN-β转染人胶质瘤细胞系SHG44及其转染后对SHG44细胞的凋亡诱导作用. 方法:应用MTT比色法检测脂质体pSV2IFN-β转染后转染组与对照组SHG44细胞增殖的差异;细胞免疫荧光染色检测脂质体pSV2IFN-β转染后,SHG44细胞IFN-β的表达情况. 应用流式细胞仪Annexin法检测脂质体pSV2IFN-β转染后SHG44细胞的凋亡情况,采用透射电镜观察肿瘤细胞凋亡的形态学改变. 结果:IFN-β基因脂质体pSV2IFN-β转染SHG44胶质瘤细胞系后4 d和6 d时,对肿瘤细胞具有明显的增殖抑制作用,抑制率分别为16.7%和32.7%. 细胞免疫荧光法检测表明转染后胶质瘤细胞具有显著的IFN-β表达,流式细胞仪Annexin法检测表明转染组与对照组的凋亡率分别为66.8%与19.8%,两组相比具有显著差异(P＜0.01);透射电镜观察,发现有凋亡细胞存在,表现为细胞皱缩,染色质边集. 结论:IFN-β基因脂质体pSV2IFN-β可转染SHG44胶质瘤细胞系,并对胶质瘤细胞的凋亡具有明显的诱导作用.     

基因表达谱芯片在肿瘤研究中的应用

20世纪人类最宏伟的基因组 (ｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅｐｒｏｊｅｃｔ,ＨＧＰ)计划已基本完成。目前已逐步进入了功能基因组时代[1] 。人类面临的更艰巨的任务是研究基因组功能 ,今后相当长一段时间的主要工作将集中在揭示所有基因转录表达层次上的信息。基因芯片 (ｇｅｎｅｃｈｉｐ)又称ＤＮＡ芯片 ,ＤＮＡ微阵列 (ＤＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａｙ)、ｃＤＮＡ微阵列、寡核苷酸微阵列(ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｍｉｃｒｏａｒｒａｙ) ,是近几年发展起来的一项前沿生物技术[2 ] 。基因芯片技术的出现使全面、综合分析某些生命现象成为可能…     

基因表达谱芯片筛查子宫内膜癌相关基因的研究

目的 应用基因芯片技术研究子宫内膜癌的基因表达谱,探讨子宫内膜癌的发生、发展与肿瘤相关的基因群及其功能.方法 应用TRIZOL一步法抽提11例子宫内膜癌患者的子宫内膜和3例子宫肌瘤患者的正常增殖期子宫内膜组织的总RNA,并纯化mRNA,将等量的子宫内膜的mRNA反转录合成以Cy5和Cy3标记的cDNA链做探针,混合后在含有8 064条双点人类全长基因的芯片上进行杂交,再经芯片扫描、图像分析处理后,分析子宫内膜癌组织及其与正常增殖期子宫内膜基因表达谱的差异.结果 11例子宫内膜癌组织和3例正常增殖期子宫内膜组织比较,含8 064个基因的基因芯片中共筛选出差异基因274条,其中上调92条,下调182条.结论 子宫内膜癌的子宫内膜组织和正常增殖期子宫内膜组织的基因表达谱存在差异,这些差异基因涉及细胞外基质调节基因、细胞因子、促癌基因/抑癌基因、细胞周期、细胞凋亡等,提示这些基因与子宫内膜癌的发生和发展有关.     

腺病毒介导mIFN-β基因转染的小鼠黑色素瘤细胞的体外生物学特性

目的研究腺病毒(Ad)介导mIFN-β基因转染的B16小鼠黑色素瘤细胞的体外生物学特性.方法用Ad为载体将mIFN-β基因导入B16细胞,观察mIFN-β基因转染的B16细胞的体外增殖能力及免疫原性的改变.结果当MOI为50～100,即可获得较高的转染效率,达90%±1%,转染细胞能表达分泌mIFN-β并具有生物学活性;AdmIFN-β感染对B16细胞的增殖能力无影响,但能显著提高细胞表面MHC-Ⅰ类抗原的表达.结论 Ad载体具有较高的转移效率,并能使其携带的mIFN-β基因有效表达;AdmIFN-β转染的B16细胞的免疫原性显著增强.提示利用Ad载体携带有效的目的基因来治疗肿瘤甚至开发瘤苗是可行的.     

EBVaGC肿瘤差异表达的基因表达谱芯片筛选

目的应用全基因组表达谱芯片技术,分析EB病毒(EBV)阳性胃癌细胞系与EBV阴性胃癌细胞系基因表达谱差异,筛选EBV相关胃癌(EBVaGC)相关基因。方法采用TRIzol一步法提取3种EBV阳性胃癌细胞系(GT38、PT、SNU-719)和3种EBV阴性胃癌细胞系(SGC7901、HGC-27、MKN-45)总RNA并纯化,逆转录合成cDNA,利用荧光染料(Cy3)标记aaUTP,转录合成标记的cRNA,与Agilent人类全基因组表达谱芯片杂交,扫描荧光信号图像,对芯片原始数据扣除本底和归一化处理,利用倍数差异和t检验计算筛选差异表达的基因,采用上海博豪生物在线分析系统进行基因的功能注释和关联分析,明确差异基因的生物学功能。将处理前后差异表达倍数>2.0或<0.5,且在不同样本间的具有统计学差异的基因判断为差异表达基因。选取特定的差异表达基因,应用实时荧光PCR技术验证芯片结果的可靠性。结果聚类热图及矩阵图分析显示,EBV阳性胃癌细胞系与阴性胃癌细胞系之间表达谱存在明显差异。EBV阳性胃癌细胞系与阴性胃癌细胞系之间有322条基因的表达有明显差异,其中与肿瘤相关的基因涉及转录翻译、信号转导、黏附、细胞增殖和凋亡以及免疫应答等多种生物学过程。选取6条差异基因进行验证,结果有3条基因表达上调,3条基因表达下调,表达趋势与芯片结果一致。结论 EBV阳性胃癌细胞系与阴性胃癌细胞系基因表达存在明显差异,提示EBV感染可影响胃癌细胞相关基因的表达,分析这些差异表达基因有助于阐明EBV感染在EBVaGC发生发展中的作用机制,为进一步筛选EBVaGC特异性肿瘤标记物以及进行生物治疗提供理论依据。     

转染TGF-β1基因的树突状细胞对重症肌无力大鼠T细胞IFN-γ和NO分泌的调节

目的：探讨TGF—β1基因转染的树突状细胞（TGF—β1-DC）对实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）大鼠T细胞IFN-γ和NO分泌的调节作用．方法：近交系、8～10wk龄、雌性Lewis大鼠25只,随机分为5组：正常组、EAMG组、DC对照组、TGF—β1-DC治疗组、生理盐水治疗对照组．除正常组外,其余各组均采用丁氏双鳍电鳐的电器官乙酰胆碱受体蛋白二次免疫的方法复制EAMG大鼠模型．初次免疫后第5日分别皮下注射2×10^6的DC,TGF—β1-DC及等体积的生理盐水,EAMG组不接受任何治疗．初次免疫后7wk,分离脾脏T细胞体外培养48h后分别应用ELISA和化学方法检测T细胞IFN-γ和NO的分泌水平．结果：正常大鼠T细胞体外培养48h后,其上清液中IFN-γ的含量很少,而EAMG组大鼠T细胞培养上清液中IFN-γ的含量显著增加（P〈0．01）．TGF—β1-DC治疗组、DC对照组、生理盐水对照组IFN-γ的含量与EAMG组比较均无统计学差异;正常大鼠T细胞体外培养的上清液中NO的含量很少,EAMG组大鼠T细胞培养上清液中NO的含量明显增加（P〈0．01）．TGF—β1-DC治疗组NO的含量较EAMG组明显增加（P〈0．05）,DC对照组、生理盐水对照组与EAMG组比较无统计学差异．结论：调节EAMG大鼠体内IFN-γ和NO的分泌可能是TGF—β1-DC的治疗机制之一．     

重组人β-防御素基因在COS-7 细胞的转染表达

为探索建立持续稳定表达hBD-2的哺乳类动物型工程细胞的可能性,作者研究构建真核重组表达载体pCMV.tag2B/hBD-2 以进行COS-7细胞转染表达实验.将本室克隆获得的hBD-2全长cDNA片段插入带有报告基因的真核表达质粒pCMV.tag2B构建出hBD-2的重组表达载体pCMV.tag2B/hBD-2,并经DNA测序证明hBD-2cDNA片段的插入方向和其全长cDNA的碱基组成顺序均准确无误.通过脂质体转染法将pCMV.tag2B/hBD-2导入COS-7细胞.RT-PCR 法和免疫印迹法分别从mRNA 水平和蛋白质水平检测到被转染的COS-7细胞系能有效表达hBD-2.     

人β-防御素4基因在COS-7细胞中的转染表达

目的探讨人β-防御素4（HBD4）基因在真核细胞COS-7中表达的可能性。方法用脂质体转染法将实验室已构建的重组真核表达载体pcDNA3.1＋/HBD4导入COS-7细胞,采用RT-PCR、Western-blot法检测HBD4的mRNA和蛋白表达水平,并对表达的HBD4进行抗菌活性的初步研究。结果 pcDNA3.1＋/HBD4转染的COS-7细胞中检测到HBD4mRNA表达。Western blot分析显示,在pcDNA3.1＋/HBD4转染的COS-7细胞及细胞培养液中检测到了HBD4蛋白的表达。Kirby-Bauer纸片扩散法证实表达的HBD4蛋白对大肠杆菌ATCC25922具有较强的杀伤作用。结论在COS-7细胞中成功表达具有抗菌活性的HBD4多肽。     

Smad7基因转染拮抗TGF-β1对培养肾小管细胞的影响

目的 探讨Smad7基因转染对TGF-β1诱导的小管细胞生长阻滞，细胞凋亡和FN分泌的影响。方法 采用Tfx-50脂质体将小鼠Smad7转染入原代培养的。肾小管细胞，用MTT法观测小管细胞的增殖、流式细胞仪观测其细胞周期的变化；ELISA法测定小管细胞FN的分泌。结果 培养基添加TGF-β1(10ng/ml)48h后，小管细胞增殖能力明显下降，停滞于G1期的细胞数增多，细胞分泌的FN量也明显增高，相反，Smad7基因转染后可明显拮抗TGF-β1对小管细胞的上述作用。结论 Smad7基因转染可明显拮抗TGF-β1对小管细胞的影响，此结果为今后体内Smad7基因治疗研究奠定了基础。     

人β防御素-2基因在SPC细胞中的转染表达

目的合成人β防御素-2(hum anβ-defensin-2,hBD-2)基因并构建其真核表达载体,转染SPC细胞,检测其表达,明确hBD-2重组载体的表达活性,为hBD-2基因转染和表达的研究奠定基础。方法根据Genebank中的hBD-2结构基因序列设计合成三条引物,用PCR延伸扩增的方法合成hBD-2基因,克隆入真核表达载体pLXSN;通过脂质体转染法将pLXSN-hBD-2导入SPC细胞,采用W estern-b lot法检测hBD-2的表达。结果经凝胶电泳及测序分析,证实合成的基因与原序列一致,并成功克隆到真核表达载体pLXSN上,所构建的真核表达重组载体pLX-SN-hBD-2转染SPC细胞后呈现有效表达。结论成功构建了PCR合成的hBD-2基因真核表达重组载体pLXSN-hBD-2,通过基因转染的方法导入SPC细胞并获得表达hBD-2,为进一步的动物转基因抗感染实验研究提供了依据。     

阳离子脂质体介导β干扰素基因转染对人胶质瘤细胞的抑制作用

目的:建立阳离子脂质体载体,介导β干扰素(IFN-β)基因转染人胶质瘤细胞系,观察其生长抑制作用.方法:以反相蒸发法制备含IFN-β的阳离子脂质体载体,转染SK-MG-1胶质瘤细胞系.MTT法观察其生长抑制情况,流式细胞技术检测肿瘤细胞的凋亡.结果:阳离子脂质体介导IFN-β基因转染可抑制SK-MG-1细胞的生长,抑制作用强于IFN-β蛋白.IFN-β蛋白和基因转染可以诱发SK-MG-1细胞的凋亡.结论:阳离子脂质体可作为一种有效的载体应用于胶质瘤的基因治疗中.IFN-β可抑制胶质瘤细胞系SK-MG-1的生长,诱发凋亡.     

人β-防御素4基因在HEK293细胞中的转染表达

目的人β-防御素4(humanβ-defensin 4,HBD 4)对多种病原菌有杀伤作用。HBD4的自然表达水平极低,体外获得难度较大且价格昂贵。利用基因工程技术生产重组的HBD4成为研究的焦点。文中旨在构建HBD4真核表达载体,探讨真核细胞表达HBD4的可行性。方法用PCR法从已构建的重组克隆载体pMD18-T/HBD4中扩增出HBD4全长编码基因,克隆入真核表达载体pEGFP-N2,构建pEGFP-N2/HBD4重组真核表达载体;通过脂质体转染法将pEGFP-N2/HBD4导入HEK293细胞,采用RT-PCR、荧光显微镜、Western blot检测HBD4的mRNA和蛋白表达情况,并对表达的HBD4进行抗菌活性的初步研究。结果构建的重组真核表达载体pEGFP-N2/HBD4,经酶切鉴定、测序,证实插入的序列与Genebank中的HBD4基因序列完全相同。将pEGFP-N2/HBD4转染HEK293细胞,在转染细胞检测到HBD4mRNA表达。荧光显微镜下可在细胞膜及细胞质中观察到绿色荧光。Western blot分析显示:在pEGFP-N2/HBD4转染的HEK293细胞及细胞培养液中检测到了HBD4蛋白的表达。Kirby—Bauer纸片扩散法证实表达的HBD4蛋白对铜绿假单胞菌具有较强的杀伤作用。结论成功构建了HBD4基因的真核表达载体,并在HEK293细胞中表达出具有抗菌活性的HBD4多肽。     

转染TGF—β1基因对大鼠树突状细胞成熟分化的影响

目的：建立大鼠骨髓DC的分离和体外扩增方法，构建TGF－β1重组质粒并转染DC，检测TGF－β1基因对DC分化成熟的影响。方法：分离大鼠骨髓造血前体细胞，在GM－CSF作用下经手法筛选，纯化、培养并扩增DC。构建TGF－β1－pcDNA3质粒，并以脂质体介导转染DC。以Dil荧光法和免疫细胞化学染色检测转染DC的TGF－β1和RT1B的表达。结果：TGF－β1-pcDNA3质粒可转染未成熟DC并有效抑制DC表面RT1B的表达，并能抑制DC对LPS的反应。结论：TGF－β1基因能有效抑制DC成熟，并诱导机体免疫耐受。     

表达谱芯片对EB病毒诱导甲基化沉默基因的筛选

目的筛选EB病毒(EBV)相关胃癌中大量EBV诱导的甲基化沉默基因,为EBV相关肿瘤的研究提供理论依据。方法采用Agilent人类全基因组表达谱(4×44K)芯片,检测去甲基化药物Aza作用前后的EBV阳性和阴性胃癌细胞株,筛选出EBV相关胃癌特有的甲基化沉默基因。应用实时荧光定量PCR和亚硫酸盐测序(BGS)方法对结果进行验证。结果去甲基化药物作用前后的EBV阳性细胞系差异基因与EBV阳性与阴性胃癌细胞系差异基因的共同基因共68条,此为EBV相关胃癌甲基化沉默特异性基因。在差异倍数为1.5和2.0时,分别检测到19和3条基因。实时荧光定量PCR和BGS验证结果显示,筛选基因在EBV阳性胃癌细胞系中处于低表达、高甲基化状态。结论筛选和鉴定EBV阳性细胞株甲基化沉默的抑癌基因,对明确EBV相关肿瘤的发病机制具有重要作用。     

大鼠γ-干扰素基因转染大鼠肺泡巨噬细胞和气道上皮细胞的实验研究

目的：构建重组大鼠γ－干扰素真核表达载体，探讨其转染大鼠肺泡巨噬细胞（AM）和气道上皮细胞的可行性及表达水平。方法：采用RT－PCR技术克隆了大鼠γ－干扰素，并将其定向克隆到逆转录病毒载体pLXSN上，构成真核表达重组载体，将重组载体转染培养的AM和气道上皮细胞，用PCR法鉴定重组载体整合在细胞基因组DNA中，并检测细胞培养上清中γ－干扰素浓度和活性。结果：DNA测序证明，构建的重组载体中γ－干扰素的基因方向正确，DNA序列与Gene Bank中大鼠的γ－干扰素cDNA序列相同，转染后AM和气道上皮细胞基因组DNA的PCR产物电泳可见转染的重组载体DNA片段条带，pLXSN-IFN载体组的AM和气道上皮细胞培养上清中大鼠γ－干扰素学和活性显著高于pLXSN空载体组（P＜0．01）结论：本研究构建的大鼠γ－干扰素重组表达载体可成功地转染大鼠AM和气道上皮细胞，整合入基因组DNA，并分泌有活性的γ－干扰素，为进一步的体内基因转染研究奠定基础。     

大鼠肾脏系膜细胞转染人TGF-β1基因可增强MMP-2表达

目的　研究转化生长因子β１（ＴＧＦβ１）对培养的大鼠肾小球系膜细胞（ＭｓＣ）基质金属蛋白酶２（ＭＭＰ２）表达的影响。方法　采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ将人ＴＧＦβ１基因转染培养的大鼠ＭｓＣ,经Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ鉴定其转染成功否;又分别应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．酶谱分析法检测阳性表达人ＴＧＦβ１的ＭｓＣＭＭＰ２ｍＲＮＡ、蛋白及酶活性变化。结果　成功获得稳定过表达人ＴＧＦβ１的大鼠ＭｓＣ克隆（ＭＴＧ１）,该细胞克隆的ＭＭＰ２ｍＲＮＡ．蛋白表达及其酶活性均获增强。结论　ＴＧＦβ１可增强ＭｓＣＭＭＰ２ｍＲＮＡ、蛋白表达,并提高其酶活性,这为进一步阐明ＴＧＦβ１在肾小球硬化发生机制中的作用提供了重要的实验手段和依据。     

一种快速筛选基因转染阳性细胞的标志基因-GFP

目的：寻求基因转移中快速检测转染阳性细胞的方法。方法：采用逆转录病毒介导的基因方法，将Ｉ型单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶ－ＴＫ）基因、绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因及抗新霉素（ＮｅｏＲ）基因插入人外周血单个核细胞（ＰＢＭＮＣ），利用ＧＦＰ在细胞内的表达所产生的绿色荧光，经流式细胞仪测定基因转移效率。结果：被转染结胞以Ｔ淋巴细胞为主，占１１．３９％，而且被转化的Ｔ细胞中ＣＤ４阳性细胞转化率较高，占７．６１％，ＣＤ８，ＣＤ１９和ＣＤ３３阳性细胞转化率分别为２．９％，２．１％和４．７２％，ＰＣＲ鉴定表明转染的人外周血单个核细胞中含量有ＮｅｏＲ基因。结论：在基因转移中ＧＦＰ可作为一种标记基因，快速检测转染阳性细胞。     

干扰素-α作用于HepG2细胞后上调表达基因的筛选

干扰素（IFN）-α是具有多种生物学作用的细胞因子,在机体抗病毒感染、肿瘤抑制、调节免疫反应等方面发挥重要作用,并用于临床多种肿瘤以及病毒性肝炎的治疗,但其确切作用机制并不完全明了.目前认为,IFN-α可以激活与其相关的信号转导通路,通过活化多种目的基因的表达而发挥作用.     

重组人β—防御素基因在COS—7细胞的转染表达

为探索建立持续稳定表达ｈＢＤ－２的哺乳类动物工程细胞的可能性,作者研究构建真核重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＣ－２以进行ＣＯＳ－７细胞转染表达实验。将本室克隆获得的ｈＢＤ－２全长ｃＤＮＡ片段插入带有报告基因的真核表达质粒ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ构建出ｈＢＤ－２的重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２,并经ＤＮＡ测序证明ｈＢＤ－２ｃＤＮＡ片段的插入方向和其全长ｃＤＮＡ的碱基组成顺序均准确无误。通过脂质体转染法将ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２导入ＣＯＳ－７细胞。ＲＴ－ＰＣＲ法和免疫印迹法分别从ｍＲＮＡ水平和蛋白质水平检测到被转染的ＣＯＳ－７细胞系能有效表达ｈＢＤ－２。