SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法测定猴免疫缺陷病毒(SIV)前病毒DNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR方法，测定猴免疫缺陷病毒（SIV）前病毒DNA。方法巢式RT-PCR扩增SIVmac251病毒RNA gag基因上1360-1837之间的长度为477bp的片段，将该片段克隆到pGEMT载体上，构建pGEM-SIV gag477质粒。该质粒经大量扩增纯化后定量，10倍系列稀释后，做出标准曲线，作为SIV前病毒DNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Roche公司FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ Kit，该标准品可精确定量到10copies／μL。结论制备的pGEM-SIV gag477质粒外标准品纯度高，SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR法特异性、敏感性高，稳定性好，可用于定量测定猴免疫缺陷病毒（SIV）前病毒DNA载量。     

Quantitative PCR detection of endoplasmic reticulum stress associated genes

从人外周血白细胞中扩增目的 基因片段,构建标准品质粒,应用SYBR GreenⅠ荧光染料进行实时定量PCR,检测内质网应激相关基因的拷贝数.所建立的实时定量PCR方法在起始模板量106～1013拷贝/μl范围内,荧光信号达到阈值的循环数Ct值与模板浓度线性关系良好(R2=0.991 9),是检测内质网应激相关基因有效的手段.     

实时定量PCR检测内质网应激相关基因方法的建立

从人外周血白细胞中扩增目的基因片段,构建标准品质粒,应用SYBR GreenⅠ荧光染料进行实时定量PCR,检测内质网应激相关基因的拷贝数。所建立的实时定量PCR方法在起始模板量106～1013拷贝/μl范围内,荧光信号达到阈值的循环数Ct值与模板浓度线性关系良好(R2=0.991 9),是检测内质网应激相关基因有效的手段。     

实时荧光定量PCR快速检测肠道病毒EV71

目的建立荧光定量PCR技术用于检测肠道病毒EV71。方法临床诊断或疑似为手足口病病例的咽拭子或肛拭子387份,采用荧光定量PCR技术检测EV71病毒的感染情况。结果 EV71病毒的感染率为50.90%。年龄为2个月～6岁,其中,男性为231例,感染率为51.95%（120/231）;女性为156例,感染率为49.36%（77/156）,最小感染者5个月,最大感染者6岁。结论实时荧光定量PCR技术可用于肠道病毒EV71的检测,有利于感染者的早发现并对患者治疗提供依据。     

三种荧光染料 SYBR GreenⅠ、LCGreen PLUS、EvaGreen在实时定量 PCR应用中的比较

目的：探讨定量PCR中三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen定量效果的差异。方法以三个样品基因组DNA为模板,应用巢氏PCR法先扩增G6PDH大片段,纯化回收产物,定量,并分别以10倍、5倍和2倍倍比稀释,作为定量PCR制作标准曲线的模板。应用real－time PCR仪指定试剂盒检测模板质量,再分别以含有相同Taq酶并分别含有SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen染料的试剂进行小片段定量PCR扩增,每个浓度3复孔。标准曲线拟合,结果分析用仪器自带分析软件完成。结果应用三种荧光染料获得的标准曲线回归系数≥0．98（除1个样品为0．97）,10倍、5倍梯度稀释标准曲线PCR效率为0．8～1．0,2倍稀释标准曲线PCR效率应用SYBR GreenⅠ有2／3样品＞1．2,而后两种染料为0．9～1．2。应用SYBR GreenⅠ较另两种染料的标准曲线误差较大,且样品间分散度也较大。结论在定量PCR中饱和染料LC Green PLUS、EvaGreen的定量效果好于SYBR GreenⅠ。     

病毒性脑炎患者脑脊液肠道病毒和EV71检测与分析

目的 探讨肠道病毒和EV71所致脑炎的发病情况及荧光定量PCR诊断病毒性脑炎的意义.方法 收集银川市118例临床诊断病毒性脑炎、脑膜炎患者脑脊液和血清,用荧光定量PCR检测肠道病毒和EV71阳性率及病毒拷贝数,用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）定性检测血清EV71病毒IgM抗体.结果 荧光定量PCR检测肠道病毒阳性病例42例,检测阳性率为35.6％;EV71阳性病例22例,检测阳性率为18.6％,占EV阳性病例的52.3％;ELISA定性检测EV71病毒IgM抗体,阳性病例30例,检测阳性率25.4％,肠道病毒和EV71病毒性脑炎患者6岁以内幼儿明显多见于其他年龄组.结论 肠道病毒是本地区病毒性脑炎、脑膜炎患者最常见的病原体,EV71可能是本地区肠道病毒性脑炎中最多见的一种,肠道病毒和EV71感染所致脑炎都以6以内幼儿为主;荧光定量PCR对EV71检测特异性高于ELISA.     

EV71入侵人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞机制的初步研究

目的:初步研究肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV71)入侵人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的机制。方法:将临床EV71分离株接种于人横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RD)细胞,扩增和纯化病毒;MTT法检测不同病毒胞吞途径阻断剂对SKN-SH细胞生长抑制作用;用特异性的化学阻断剂预处理靶细胞后,Taq Man real-time PCR验证其对EV71 m RNA表达的影响。结果:RD细胞能够成功扩增出EV71病毒,病毒滴度为1×105 TCID50。随着药物浓度梯度的增加,SK-N-SH细胞的生长增殖受到抑制。Taq Man荧光定量RT-PCR结果显示氯丙嗪(chlorpromazine,CPZ)能够抑制EV71 m RNA的表达(Ρ<0.05),制霉菌素(nystatin,NT)对其影响不大(Ρ>0.05)。结论:初步推测EV71入侵SK-N-SH细胞是通过网格蛋白依赖性的内吞作用入胞。     

EV71及CA16不同检测方法敏感度及特异性比较

目的比较检测肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)及柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)不同检测方法、不同生产厂家(A、B、C、D、E)荧光定量PCR检测试剂的敏感度及特异性。方法对EV71及CA16各10个病毒株进行稀释,取原倍、10-3及10-63个浓度,分别采用实时荧光定量PCR法(分别用不同厂家的检测试剂)、RT-PCR法、ELISA法及细胞培养4种方法进行检测,每种检测连续重复3次,然后将其结果进行比较分析。结果 EV71及CA16经不同方法及试剂检测后结果显示,荧光定量PCR方法敏感度最高,依次为细胞培养法、RT-PCR(VP1)法及ELISA法;细胞培养法、RT-PCR(VP1)法及ELISA法的特异性较荧光定量PCR检测方法的特异性高,但荧光定量PCR检测试剂均出现不同程度非特异的假阳性结果;不同的荧光定量PCR检测试剂中,D厂家试剂检测EV71和C厂家试剂检测CA16的敏感度和特异性最高。结论 RT-PCR(VP1)方法更适于检测EV71及CA16,如条件许可则建议联合采用细胞培养检测方法,提高检测结果的敏感度和特异性。     

EV71病毒反向遗传学系统的建立及拯救病毒的鉴定

目的：建立高效的EV71病毒反向遗传学系统,快速获得拯救病毒并鉴定其活性。方法：首先构建含有人RNA聚合酶Ⅰ启动子（Ppol Ⅰ）、ccdB自杀基因和鼠终止子（mTer）的接收质粒pHM-ccdB,并在ccdB两侧引入AarⅠ酶切位点;为了回避EV71病毒基因组中自身的AarⅠ酶切位点,分两段PCR扩增基因组,在引物中引入必需的AarⅠ酶切位点,通过Golden Gate Clone技术连接到目的载体中获得病毒拯救质粒pHT-EV71,转染至RD细胞后,获得拯救的EV71病毒,并以RT-PCR、病毒滴度、Western blot以及电镜检测等方法鉴定拯救子代病毒。结果：通过引入ccdB致死基因和Golden Gate Clone成功构建了EV71病毒的拯救质粒（pHT-EV71）,并将其转染至RD细胞后,观察到明显的致细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）,将得到的拯救子代病毒,经EV71 VP1的特异性引物进行RT-PCR扩增,观察到长约1 900 bp的特异性条带;Western blot结果显示,该病毒可与EV71 VP1特异抗体结合;透射电子显微镜（transmission electron microscopy,TEM）检测可见20～30 nm球形病毒颗粒;在RD细胞中将子代病毒连续增殖8代后,检测其毒力高于母本株（6.35 lgTCID50/mL）。结论：通过引入ccdB和Golden Gate Clone技术,建立了快速、高效构建EV71病毒的拯救质粒的方法,效率达到100%,为正链RNA病毒反向遗传学系统的构建提供了一种新的策略,为进一步研究EV71病毒的致病机制及疫苗制备等提供了技术平台。