膀胱移性细胞癌p16基因缺失、突变、甲基化及其蛋白表达的研究

目的对25例膀胱移性细胞癌(bladder transitional cell carcinoma,简称膀胱癌)患者的p16基因第一、第二外显子纯合性缺失,第二外显子的点突变,第一外显子区5＇CpG岛的甲基化情况及p16蛋白表达进行检测,探讨p16基因在膀胱癌中失活的方式及p16蛋白表达与膀胱癌之间的关系. 方法取患者膀胱癌组织,用酚/氯仿法提取癌组织基因组DNA,设计p16基因第一、二外显子引物,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、PCR-单链构象多态性 (PCR-single strand conformational polymorphism, PCR-SSCP)、甲基化敏感限制性内切酶-PCR分析方法,对25例膀胱癌患者的癌组织基因组DNA的p16基因第一、二外显子的纯合性缺失、第二外显子点突变及第一外显子区5＇CpG岛的甲基化情况进行分析.应用S-P免疫组织化学方法检测25例膀胱癌和6例正常膀胱黏膜组织中p16基因的表达情况,并分析其意义. 结果在这25例膀胱癌患者中,发现p16基因第二外显子缺失者有4例,第一外显子和第二外显子共同缺失者有1例,第一外显子缺失者1例,p16基因的缺失率为24%(6/25);未发现p16基因第二外显子的点突变; p16基因第一外显子区5＇CpG岛的甲基化率为69.6%(16/23).p16基因表达在膀胱癌组织中阳性率为52%(13/25),6例正常膀胱黏膜组织中均阳性,两者比较差异有显著性(P<0.01).随病理分级、临床分期的上升和预后的不良,p16基因的阳性表达率有下降趋势,但差异无显著性(P＞0.05).结论 p16基因的失活方式主要有三种:纯合性缺失、点突变和5＇CpG岛的甲基化,但外显子2的纯合性缺失在安徽区域发生的膀胱癌中可能不是一个较频繁发生的"事件";通过p16基因第一外显子区5＇CpG岛异常甲基化失活可能是膀胱癌p16基因失活的主要机制.在这25例膀胱癌患者中,未发现p16基因的点突变,但仍不能排除这种失活机制,我们将通过扩大样本,进一步研究p16基因的点突变情况.p16基因表达产物与膀胱癌的发生发展及预后可能有关系,也有待于扩大例数进一步研究.p16基因表达产物可作为诊断膀胱癌的指标之一.     

膀胱癌细胞p16抑癌基因失活的研究

目的 探讨膀胱癌中p16基因失活情况。方法 采用PCR、PCR—SSCP和DNA甲基化分析技术等方法对25例膀胱癌组织中p16基因进行检测。结果 25例膀胱癌标本中有6例存在p16基因纯合性缺失，缺失率为24％；无1例出现点突变；16例出现异常甲基化，检出率为69．6％(16／23)。结论 外显子2的纯合性缺失在安徽区域发生的膀胱癌中可能不是一个较频繁发生的事件；通过CpG岛异常甲基化失活可能是膀胱癌p16基因失活的主要机制。     

食管鳞癌组织中p16基因缺失及甲基化检测

目的:探讨食管癌组织中p16基因表达缺失的机制.方法:采用PCR、DHPLC、MSP及免疫组化的方法,检测45例食管鳞癌组织及其相应的间变组织和正常食管上皮组织中p16基因的缺失、突变、甲基化状态及蛋白表达情况.结果:正常食管上皮组织中p16蛋白均为正常表达(45/45,100%),间变和癌组织中异常表达率分别为84.4%(38/45)和91.1%(41/45),3者间异常表达率差异有统计学意义(x2=20.03,P＜0.001).p16蛋白表达异常的41例癌组织中,纯合型甲基化发生率为80.48%(33/41),杂合缺失发生率58.53%(24/41),不缺失发生率41.46%(17/41),均高于p16蛋白表达正常的癌组织.结论:该地区食管癌组织中p16基因主要通过纯合型甲基化失活.     

急性淋巴细胞白血病p16基因纯合性缺失、点突变及启动子甲基化变异

目的 探讨急性淋巴细胞白血病(ALL)患者p16基因的失活机制。方法 从29例患者外周血提取白细胞基因组DNA,采用PCR、PCR—SSCP、MSP分析方法,对p16基因第二外显子的纯合性缺失、点突变及启动子区CpG岛的甲基化变异进行分析。结果 p16基因第二外显子的缺失率为27．6％(8／29),未见其点突变;p16基因启动子区CpG岛的甲基化率为13．8％(4／29)。结论 p16基因的失活和ALL的发生发展有一定的关系。     

脑星形细胞瘤p16基因缺失及5''''CpG岛甲基化检测

目的探讨p16基因异常与脑星形细胞瘤发生、发展的关系。方法利用PCR及PCR-based甲基化技术检测了56例不同级别的脑星形细胞瘤组织p16基因缺失及5'CpG岛甲基化状况。结果18例高病理级别的脑星形细胞瘤发生了p16基因缺失,而低病理级别的脑星形细胞瘤无一例发生缺失（P<0.05）;6例脑星形细胞瘤发生了p16基因5'CpG岛甲基化。结论p16基因失活可能参与脑星形细胞瘤的病理发生、恶性进展。p16基因纯合缺失是p16基因失活的主要机制。     

甲状腺癌组织端粒酶激活与p16基因失活的关系

目的探讨甲状腺癌细胞增殖、分化与端粒酶激活及抑癌基因p16失活（缺失突变）之间可能存在的关系。方法应用TRAP、多重PCR、免疫组化法检测42例甲状腺癌与16例癌旁组织端粒酶活性、P16基因外显子2缺失、P16蛋白表达。结果甲状腺癌组端粒酶活性90．48％,高于癌旁组织（P〈0．01）;甲状腺癌p16基因外显子2纯合缺失率28．57％,相应癌旁组未检出（P〈0．01）;甲状腺癌P16蛋白表达缺失率40．48％,高于癌旁组（P〈0．05）;甲状腺癌P16蛋白表达缺失率高于p16基因外显子2缺失率。结论端粒酶激活与p16基因失活以及P16蛋白表达下调可能是甲状腺癌变过程中的重要分子事件,甲状腺癌中p16基因失活可能是端粒酶激活的一种途径。     

基因甲基化与急性淋巴细胞白血病的关系

目的：探讨p16基因甲基化在急性淋巴细胞白血病(ALL)发生机制中的作用。 方法：采用限制性内切酶酶切结合多聚酶链反应方法检测82例ALL患者白血病细胞p16基因部分启动子和外显子1 CpG岛甲基化的情况。 结果：31例ALL患者存在p16基因的甲基化，1例p16基因纯合缺失；p16存在甲基化与纯合缺失的患者初次化疗完全缓解率和平均生存时间低于p16基因正常表达者。 结论：p16基因甲基化在ALL发生机制中有一定的作用，可作为评估ALL预后的一个指标。     

多重PCR法检测喉癌组织中P16基因纯合缺失及异常甲基化

目的：采用多重ＰＣＲ法检测喉癌及癌旁组织中Ｐ１６ 基因纯合缺失和异常甲基化。方法：选用二对引物分别扩增Ｐ１６ 基因外显子１ 和２,分析有无纯合缺失,对未检出缺失的样品用甲基化敏感内切酶Ｓｍ ａＩ消化后,再扩增外显子１,分析有无Ｐ１６ 基因异常甲基化。结果：３９ 例喉癌组织标本中９ 例标本有Ｐ１６ 基因纯合缺失,缺失率为２３．０８％ （９／３９）。３０ 例未检测到Ｐ１６ 基因缺失的喉癌组织标本,有４ 例检出异常甲基化,检出率为１３．３３％ （４／３０）。３９ 例癌旁组织标本均未检测到Ｐ１６基因缺失或异常甲基化。结论：采用多重ＰＣＲ法可检测出Ｐ１６ 基因常见的纯合缺失和异常甲基化失活。研究表明,Ｐ１６ 基因失活可能在喉癌的发生发展中起重要作用     

成人急性白血病患者骨髓中p16基因的表达

目的：研究成人急性白血病患者p16基因纯合缺失和甲基化变化与其表达之间的关系，探讨其成人急性白血病发生发展中的生物学意义，方法：分别用多重聚合酶联反应（PCR）技术及甲基化敏感限制性内切酶－PCR技术检测了71例成人急性白血病患者DNA中p16基因纯合缺失及甲基情况；应用原位杂交及免疫技术检测p16基因mRNA及p16基蛋白表达，结果：71例成人急性白血病患者中，2例检测出p16基因纯合缺失，在无p16基因纯合缺失的病例中，5例急性淋巴细胞白血病（5／26）和9例急性髓性白血病（9／43）患者测出p16基因甲基化，p16mRNA及p16蛋白的阳性率分别为70．4％（50／71例）、61．9％（44／71例），结论：在成人急性白血病的发生发展中，p16基因甲基化比p16基因纯合缺失更具有意义；p16基因表达异常与成人急性白血病的发生发展密切相关。     

三种妇科肿瘤同一基因异常

在卵巢癌、子宫颈癌和子宫内膜癌等妇科恶性肿瘤中，均存在p16基因的表达异常，包括纯合缺失、p16蛋白表达降低和缺失及甲基化。     

Relationship between alterations of p16INK4a and p14ARF genes of CDKN2A locus and gastric carcinogenesis

Objective To investigate the relationship between alterations of p16INK4a and p14ARF genes and gastric carcinogenesis. Methods The tumors and neighboring gastric tissues from 48 patients with gastric cancer were studied. The homozygous deletion, mutation, methylation of the CpG islands, and mRNA expression of p16INK4a and p14ARF genes were assessed by PCR, PCR-SSCP, PCR based methylation assay, and RT-PCR. Results ① The homozygous deletion rate of p16INK4a and p14ARF was 35.4% （17/48）, and no homozygous deletion was examined in any gastric tissue neighboring the tumor. ② There was no point mutation of p16INK4a and p14ARF in 31 gastric cancers without homozygous deletion or in the matched gastric tissues adjacent to the tumor. ③ Methylation of the CpG islands of p16INK4a and p14ARF was detected in 47.9% (23/48) of gastric cancers, while methylation was observed only in 2 of 48 gastric tissues neighboring the cancer with a significant difference (P&lt;0.01). ④ The loss rate of p16INK4a mRNA was 47.9% (23/48) in gastric cancer, and the patients of the combined methylation of exons 1α and 2 had a higher loss rate (100%, 6/6) of p16INK4a mRNA than those of the methylation of the other exons (11.8%, 2/17, P&lt;0.01); the loss rate of p14ARF mRNA was 45.8%(22/48) in gastric cancer, and patients with the combined methylation of exons 1β and 2 had a higher loss rate (100%, 3/3) of p14ARF mRNA than those of the methylation of the other exons (15%, 3/20, P&lt;0.05). ⑤ The combined loss of p16INK4a and p14ARF mRNAs was examined in 1 (5.6%) of 18 patients of well and moderately-differentiated carcinomas, and 11 (36.7%) of 30 patients of poorly and not-differentiated carcinomas with a significant difference (P&lt;0.05). Conclusion p16INK4a and p14ARF genes are frequently inactivated by homozygous deletion and methylation of the 5’CpG islands in gastric cancer, which may play an important role in the carcinogenesis of gastric cancer.     

肺癌病人痰细胞中p16基因高甲基化分析

目的　分析肺癌病人痰标本中p16基因启动子区域异常高甲基化的改变情况 ,评价该指标作为肺癌辅助诊断分子标记物的价值。方法　运用半巢式甲基化特异性PCR技术 ,检测 94例原发性肺癌病人痰标本和部分对应肿瘤组织 ,以及 10例慢性炎病例痰标本中p16基因启动子区域的甲基化改变。结果　 74%的肺癌病人痰标本中检测到了p16基因异常高甲基化 ,与传统细胞学相比 ( 4 6.8%) ,痰标本中p16基因异常高甲基化对肿瘤的检出率灵敏度更高 (P <0 .0 1) ;痰细胞中p16甲基化检测和细胞学相结合 ,对肿瘤的检出率可达 86.17%( 81 94)。如果痰标本中p16基因启动子区域发生高甲基化 ,其对应的肿瘤组织中p16基因亦为高甲基化。 10例慢性炎病人痰标本中仅 3例检测出p16基因甲基化。结论　痰标本中p16基因甲基化是临床肺癌辅助诊断的有效分子生物标记物之一。     

急性淋巴细胞白血病中p16基因甲基化及表达

目的：探讨p16基因甲基化在急性淋巴细胞白血病发生机制中的作用。方法：采用限制性内切酶酶切结合多聚酶链反应(PCR)方法检测82例急性淋巴细胞白血病患者白血病细胞p16基因部分启动子和外显子1 CpG岛甲基化的情况，同时应用免疫组织化学染色法检测p16蛋白的表达。结果：31例急性淋巴细胞白血病患者存在p16基因的甲基化；1例p16基因纯合缺失；39名患者p16蛋白表达阴性；p16蛋白阴性表达患者的初次化疗完全缓解率和平均生存时间低于p16蛋白阳性表达者。结论：p16基因甲基化在急性淋巴细胞白血病的发生机制中有一定的作用，p16蛋白可能是评估急性淋巴细胞白血病预后的一个指标。     

原发性肝癌患者血清p16基因甲基化与AFP、CEA的分析

[目的]分析原发性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者血清中p16启动子区域甲基化的改变状况及其AFP、CEA临床意义的比较。[方法]运用甲基化特异性PCR技术，检测64例HCC患者血清D16基因启动子区域甲基化的改变情况，并分析与AFP、CEA敏感性、特异性的关系。[结果]HCC患者血清D16基因甲基化检出率为76．6％（49／64），而正常对照组和良性肝部疾病组血清未检出D16基因甲基化，AFP阳性检出率81．3％（52／64），CEA阳性检出率21．9％（14／64）。[结论]D16基因检出启动子区域异常甲基化是HCC辅助诊断的分子标志物之一。三者联合检测对肝癌诊断有实用价值。     

Molecular and immunohistochemical study of the inactivati on of the p16 gene in primary hepatocellular carcinoma

Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｏｆｐ16ｇｅｎｅａｒｅｋｎｏｗｎｔｏｏｃｃｕｒｉｎｍａｎｙｐｒｉｍａｒｙｔｕｍｏｒｓ ,ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｍｅｌａｎｏｍａ ,ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒｓ ,ｅｓｏｐｈａｇｅａｌｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ ,ｂｒａｉｎｔｕｍｏｒｓａｎｄｔｈｅｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ 1 5　Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｐ16ｇｅｎｅｏｃｃｕｒｓｖｉａｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ,ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｄｅｌｅｔｉｏｎ,ｐｏｉｎｔ…     

纤维支气管镜联合p16基因甲基化检测对肺癌的诊断价值

对42例肺癌患者和25例肺部良性病变患者行纤维支气管镜检查,并利用甲基化特异性PCR方法检测外周血血浆、痰液、支气管肺泡灌洗液中p16基因甲基化状态。42例确诊肺癌患者p16基因异常,甲基化阳性数在血浆、痰液和支气管肺泡灌洗液中分别为22例（52．4％）、20例（47．6％）和25例（59．5％）,各标本的阳性率差异无统计学意义（P〉0．05）;25例良性病变者中除1例在血液中检测到异常甲基化外,均未检测到p16基因的异常甲基化。经纤维支气管镜确诊25例,敏感度、特异性和准确性分别为59．5％、100．0％和74．6％;纤维支气管镜联合p16基因甲基化检测后敏感度、特异性和准确性分别为92．9％、96．2％和94．0％。