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相似文献
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1.
目的通过慢病毒介导的RNA干扰技术干扰线粒体相关基因TFAM和POLG,为研究线粒体和干细胞提供资料。方法选取线粒体相关因子TFAM和POLG,分别设计三条干扰序列,构建以miRNA为基础的RNA干扰病毒载体。在293FT细胞中包装病毒液,并转染原代成纤维细胞,通过定量PCR和westernblot检测干扰效率。结果两个基因的1号序列都能有效干扰相应基因表达,POLG下调了75%,而TFAM下调了85%。结论慢病毒介导的miRNA为基础的干扰病毒载体成功干扰了TFAM和POLG基因的表达。  相似文献   

2.
目的:构建DPC4基因tLNA干扰慢病毒载体及其基因沉默效应。方法:针对DPC4基因序列,利用网站设计程序按照RNA干扰序列设计原则,设计多个RNA干扰靶点序列,根据设计经验和设计软件进行评估测定,选择最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程;生工生物合成含干扰序列的双链DNA oligo,其两端含酶切位点粘端.直接连入酶切后的IKNA干扰载体上。将连接好的产物转入制备好的细菌感受态细胞,对长出的克隆进行酶切鉴定,挑选出阳性克隆测序,进行测序比对后,鉴定阳性克隆即为构建成功的目的基因1KNA干扰慢病毒载体。结果:经过Western blot方法检测和测序证实,成功构建了DPC4shRNA慢病毒栽体LVshSmad4,并成功制备了DPC4 shRNA慢病毒,3株病毒感染细胞后均具有有效的基因沉默,其中SHI序列最为显著。结论:DPC4基因RNA干扰靶点的成功设计和RNA干扰靶点慢病毒载体制备,而且具有显著的基因沉默效果。  相似文献   

3.
目的:构建肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体,并检测其对人肝癌细胞株HepG2和QGY中ALR基因表达的干扰效率。方法:针对ALR基因RNAi的有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ双酶切线性化的GV118慢病毒载体连接产生LV-ALR-shRNA重组慢病毒载体,经转化感受态细胞后筛选出阳性克隆,并进行测序鉴定。用293T细胞包装产生慢病毒,逐孔稀释法测定病毒滴度。再将包装浓缩后的慢病毒转染人肝癌细胞株HepG2和QGY,应用Real-time PCR和Western blot方法检测HepG2和QGY细胞中ALR基因mRNA和蛋白的表达情况。结果:酶切鉴定证实成功构建了针对人ALR基因的RNAi慢病毒载体,包装并浓缩慢病毒,病毒滴度为 8E+8TU/ml。将病毒感染人肝癌细胞株HepG2和QGY后,2种细胞的干扰组ALR的mRNA表达水平较阴性对照组及空白对照组均明显下降(HepG2细胞,P干扰组vs. 阴性病毒对照组=0.004,P干扰组vs. 空白对照组=0.001;QGY细胞,P干扰组vs. 阴性病毒对照组=0.005,P干扰组vs. 空白对照组=0.001),同样,干扰组ALR在蛋白水平的表达也明显减降低。结论:成功构建ALR基因RNAi慢病毒载体,该载体能有效干扰人肝癌细胞株HepG2和QGY中ALR基因的表达。  相似文献   

4.
目的构建大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒,为进一步探究RNA干扰技术对CaSR在肾脏对钙重吸收调控中的作用提供基础准备。方法(1)CaSR基因慢病毒高表达细胞系构建:PCR克隆CaSR目的基因,双酶切CaSR基因和pcDNA3.1载体,连接酶连接,阳性克隆筛选后测序,将pcDNA3.1-CaSR高表达载体和空载体(对照组)经慢病毒包装后转染NRK-52E细胞,Western blot测定CaSR蛋白表达;(2)CaSR基因的RNA干扰质粒构建:设计3对靶向干扰CaSR基因的RNA引物序列,双酶切干扰引物和pLV[shRNA]-EGFP载体,然后经T4连接酶连接,获得重组干扰质粒pLV[shRNA]-EGFP-CaSR,转化至感受态E.coli DH5,阳性克隆筛选后测序,测定干扰效率。结果(1)测序结果与CaSR基因序列一致;(2)测序结果与设计shRNA引物序列一致;(3)Western blot检测获得慢病毒高表达稳定细胞系的CaSR蛋白;(4)干扰质粒干扰高表达细胞系有效。结论成功构建大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒。  相似文献   

5.
目的构建靶向PIK3CA(P110α)基因的RNA干扰慢病毒载体。方法针对PIK3CA—mRNA(NM_006218)设计4个RNA干扰靶点序列和一个阴性对照靶点,构建慢病毒转移质粒pGCL—GFP。构建成功的RNA干扰质粒与PIK3CA表达质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观测转染效果,Western Blot检测PIK3CA蛋白表达,筛选出干扰效果最好的RNA干扰质粒。将该质粒与两种辅助包装原件载体质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒并检测其滴度。结果4个靶点和阴性对照靶点的RNA干扰质粒均构建成功;通过Westem Blot检测获得最有效干扰靶点,并成功包装成滴度为2×10^8TU/ml的慢病毒。结论成功构建可供感染的PIK3CA基因RNA干扰慢病毒载体,为进一步研究PIK3CA功能和用慢病毒进行卵巢癌基因治疗奠定了基础。  相似文献   

6.
目的 :构建DPC4基因RNA干扰慢病毒载体及其基因沉默效应。方法 :针对DPC4基因序列,利用网站设计程序按照RNA干扰序列设计原则,设计多个RNA干扰靶点序列,根据设计经验和设计软件进行评估测定,选择最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程;生工生物合成含干扰序列的双链DNA oligo,其两端含酶切位点粘端,直接连入酶切后的RNA干扰载体上。将连接好的产物转入制备好的细菌感受态细胞,对长出的克隆进行酶切鉴定,挑选出阳性克隆测序,进行测序比对后,鉴定阳性克隆即为构建成功的目的基因RNA干扰慢病毒载体。结果:经过Western blot方法检测和测序证实,成功构建了DPC4 shRNA慢病毒载体LVshSmad4,并成功制备了DPC4shRNA慢病毒,3株病毒感染细胞后均具有有效的基因沉默,其中SH1序列最为显著。结论 :DPC4基因RNA干扰靶点的成功设计和RNA干扰靶点慢病毒载体制备,而且具有显著的基因沉默效果。  相似文献   

7.
目的 构建靶向犬p53基因慢病毒干扰载体,建立稳定沉默p53基因的WRD/p53-细胞系。方法 设计并构建4条针对犬p53基因的特异性shRNA干扰质粒。将构建的慢病毒表达载体(p GMLV-p53)和包装质粒(packaging mix)组成的包装系统共转染293T细胞,包装病毒,收集病毒原液,超滤浓缩,并测定滴度。包装好的慢病毒感染WRD细胞,Western blot和实时荧光定量PCR方法检测不同靶点RNA干扰载体对p53基因的干扰效果,确定有效靶点。针对有效靶点慢病毒颗粒以最适感染复数(multiplicity of infection,MOI)感染WRD细胞,puromycin抗生素筛选稳定感染细胞系WRD/p53-。结果 结果显示p53 RNAi慢病毒载体构建成功,成功包装四种不同靶点的p53基因RNA干扰慢病毒,病毒滴度均达到1×109TU/ml。四种干扰载体慢病毒均具有较好的干扰效果,选用沉默效果最好的p GMLV-p53A1为最优靶点,成功建立p53 RNAi慢病毒载体稳定感染细胞系WRD/p53-。结论 成功构建p53 RNAi慢病毒载体,并有效干扰WRD细胞中p53 mRNA和蛋白表达,同时成功筛选并建立p53RNAi慢病毒稳定感染WRD/p53-细胞系。  相似文献   

8.
 目的 构建小鼠CD80和CD86基因RNA干扰慢病毒表达载体,并在体外观察其对小鼠骨髓源性树突状细胞(dendritic cell,DC)的作用。方法 针对已经筛选确定的CD80基因RNA干扰有效靶序列,合成靶序列的双链DNA,接入pGCL-GFP载体,再与pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度;同法构建出CD86基因RNA干扰慢病毒载体。慢病毒感染体外培养的DC,通过荧光显微镜检测感染效率,Annexin V/PI双染色法检测感染细胞凋亡和坏死情况,流式细胞仪检测CD80和CD86的表达情况。结果 PCR和测序证实,pGCL-CD80shRNA和pGCL-CD86shRNA慢病毒载体构建正确,病毒滴度均达2×107TU/mL,适合感染DC的MOI值为20,此时慢病毒对DC具有低毒性,感染效率为85.42%。CD80和CD86表达的抑制率分别为82.05% 和77.78%。结论 成功构建出小鼠CD80和CD86基因RNA干扰慢病毒载体,其有明显抑制DC表面CD80和CD86的表达,这为移植物排斥提供了新的治疗手段。  相似文献   

9.
目的 构建有效抑制HIF-2α基因表达的siRNA序列,并找到最佳病毒载体浓度.方法 设计针对HIF-2α mRNA作用的4条siRNA的序列,分别插入慢病毒载体中,获得较高滴度的慢病毒后,运用RT-PCR和Werstern blot方法检测HIF-2α mRNA及蛋白质水平,筛选出对HIF-2α基因沉默作用较强的干扰序列及病毒载体剂量.结果 4条siRNA序列均能干扰HIF-2α基因表达,其中KD2序列对HIF-2α基因的干扰作用最强(P<0.05).两种不同剂量的慢病毒载体比较,高剂量慢病毒载体的干扰效果更明显(P<0.05).结论 KD2序列能有效沉默HIF-2α基因;高剂量的慢病毒载体对HIF-2α基因的沉默效果更强.  相似文献   

10.
目的:应用慢病毒介导的RNA干扰技术,建立Clusterin(CLU)基因稳定干扰的人肾癌细胞系,为CLU基因的功能研究奠定基础.方法:以人CLU mRNA编码序列作为干扰靶点,与pGCSIL-GFP载体连接真核表达载体.另外构建不针对任何已知mRNA的阴性对照shRNA表达质粒.利用包装细胞293T获得重组慢病毒,分别感染人肾癌786-O细胞株及ACHN细胞株.应用Real time-PCR及Western blot检测不同组别CLU表达的变化.结果:成功构建CLU shRNA慢病毒载体CLU-RNAi-LV并获得相应的慢病毒,病毒悬液滴度>4×1011TU/L.Real Time-PCR、Western blot结果显示干扰组CLU mRNA及蛋白表达水平较对照组显著降低.结论:慢病毒介导的CLU基因干扰能稳定有效地表达于肾癌细胞,筛选出能稳定干扰CLU基因表达的siRNA序列和肾癌786-O细胞株.  相似文献   

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