蓖麻毒素A链与底物作用的结构基础及其解毒剂的研究进展

蓖麻毒素是从植物蓖麻籽中分离得到的一种Ⅱ型核糖体失活蛋白，其A链（RTA）为效应链，具有N-糖苷酶活性，通过催化28S rRNA在S/R结构域第4 324位脱去一个保守的腺嘌呤，使核糖体60S亚基失活，从而阻断蛋白质合成途径，引起细胞死亡。RTA因其高细胞毒性，常常用于制备免疫毒素药物，尤其在恶性肿瘤的生物治疗上具有诱人的应用前景；或可能被用作恐怖袭击的生物战剂。本文对RTA与底物相互作用的结构信息及其解毒剂进行综述。     

蓖麻毒素在细胞内的运输和转运途径研究进展

蓖麻毒素是一种典型的天然毒蛋白，其A链(RTA)可催化失活核糖体大亚基，故能抑制细胞的蛋白质合成，而导致细胞死亡。近年来，蓖麻毒素已被用来合成肿瘤导向药物——免疫毒素，但有关毒蛋白进入细胞的途径仍不甚清楚。研究RTA在细胞内的转运机理可以揭示毒蛋白运输的普遍规律。对蓖麻毒素的结构和细胞内的转运途径及其临床应用作一综述。     

蓖麻毒素及其解毒剂研究进展

蓖麻毒素(ricin)是一种从蓖麻籽中提取的剧毒植物蛋白,是核糖体失活蛋白(RIP)的一种,可以使核糖体失去蛋白质合成能力并最终导致细胞死亡,毒素在体内通过独特的"逆向转运"途径进入胞浆并与核糖体结合发挥毒性作用,目前对蓖麻毒素尚无有效的抗毒剂.本文对蓖麻毒素的结构,转运过程,作用机制以及抗毒剂的研究进展进行综述.     

蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白基因的融合表达和活性测定

目的:表达蓖麻毒素A链(RTA)与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白 (GFP-RTA),用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运机理研究.方法:采用PCR法从重组质粒pKK233.2-RTA中扩增出蓖麻毒素A链基因,然而将其插入真核表达质粒pEGFPC1,构成GFP-RTA融合基因;GFP-RTA经PCR扩增,与T载体连接,用内切酶从T-GFP-RTA中切下GFP-RTA片段,插入原核表达质粒pET-28a( );在BL21(DE3)中表达GFP-RTA融合蛋白,通过金属螯合和层析纯化,MTT法检测融合蛋白的细胞毒性.结果:测序发现插入的融合基因全长序列完全正确,SDS-PAGE鉴定表达产物分子量正确;经诱导表达后,菌体产生绿色荧光,MTT法表明该融合蛋白呈现与RTA相似的细胞毒性.结论:从大肠杆菌表达的蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白的融合蛋白,具有蓖麻毒素A链和绿色荧光蛋白的生物学活性,可用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运途径研究.     

南瓜蛋白对B16细胞的诱导分化作用(简报)

植物核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIP)通常按分子结构不同分为两型；Ⅰ型RIP为单链蛋白，如天花粉蛋白Ⅱ型RIP是通过二硫键连接的双链蛋白，如蓖麻毒素．Ⅰ型RIP与Ⅱ型RIP的A链一样，是一类RNA N-糖苷酶或多核苷酸；腺苷糖苷酶，具有抗生育、抗病毒和抗肿瘤等多种生物学活性．南瓜蛋白(cucurmosin)是本课题组     

半乳糖结合位点封闭式免疫毒素的制备及其特性

近年来发现蓖麻毒素中B链除具有细胞结合作用外,还有促进A链杀伤效应的功能。作者用完整蓖麻毒素制备B链半乳糖基结合位点封闭的胃癌McAb免疫毒素,发现这种免疫毒素对胃癌细胞具有高度选择性杀伤作用;由于这种免疫毒素的作用较A链免毒疫素增强,故认为免疫毒素中B链的存在有助于增强A链的细胞杀伤作用。     

抗宫颈癌细胞株免疫毒素的研究

兔抗Hela细胞IgG通过异型双功能交联剂SPDP分别与蓖麻毒素及其A链偶联成功制备免疫毒素,台盼蓝染色法和同位素掺入抑制试验均证明免疫毒素对Hela细胞有特异性杀伤作用,0.1mol/L半乳糖不能消除此种特异性毒性。本研究为免疫毒素抗宫颈癌动物实验及临床应用提供了依据。     

半乳糖结合位点封闭免疫毒素的研制及其杀伤活性

作者报道B链半乳糖结合位点封闭的蓖麻毒素-胃癌单克隆抗体MGb_2结合物的制备及其细胞毒特征。首先将引入碘乙酰基团的毒素与引入巯基的抗体反应,得到的结合物通过琼脂糖亲和层析柱除去仍保留半乳糖结合能力的部分。细胞毒性试验结果表明,结合物对肿瘤靶细胞具有较强的选择性杀伤作用,在1.0×10~(-11)mol/L水平,对人胃癌细胞KATOⅢ的杀伤率为46％,优于MGb_2-蓖麻毒素A链结台物(12％),而对非靶细胞作用很弱,在1.0×10~(-9)mol/L水平对正常人胚肺细胞SL_7杀伤率仅为42％,无需半乳糖拮抗。     

蓖麻毒素被修饰前后的毒性及抗肝癌性比较研究

蓖麻毒素被修饰前后的毒性及抗肝癌性比较研究董巨莹，王文学（毒理学教研室西安７１００３３）关键词蓖麻毒素；修饰；毒性；抗肝癌性中图号Ｒ７３０．１蓖麻毒素（ｒｉｃｉｎｔｏｘｉｎ，ＲＴ）是从蓖麻籽中提取的一种植物糖蛋白，它能使真核生物细胞内的核糖体６０Ｓ亚...     

蓖麻毒素及其A、B链的提取分离纯化的研究

本文研究蓖麻毒素及其A、B链的提取、分离、纯化,根据B链能与Sepharose-6 B上的半乳糖结合,而A链不具有这一性质,用β-巯基乙醇使蓖麻毒素直接在Sepharose-6B柱上断链,然后分别用Tris-HCl和Tris-HCl-半乳糖溶液洗脱,首次把蓖麻毒素的制备、纯化以及A、B链的断链、分离结合起来,大大简化了工艺。     

溶酶体参与蓖麻毒素A链降解途径的研究

目的:研究溶酶体在蓖麻毒素A链(RTA)细胞内转运过程中的作用.方法:用DNA重组技术,将溶酶体的靶向信号肽KFERQ连接在RTA的羧基端;将构建好的重组质粒pKK223.3-RTA和pKK223.3-RTA-KFERQ转化感受态大肠杆菌JM109,经IPTG诱导表达RTA和RTA-KFERQ蛋白;重组蛋白质用Blue-Sepharose6B亲和柱纯化,以MTT法分别测定纯化后的RTA与RTA-KFERQ蛋白对体外培养的HEPG2(人肝癌细胞)、Hela(人宫颈癌细胞)、A549(人肺癌细胞)3种细胞的毒性作用.结果:在大肠杆菌中成功表达了RTA和RTA-KFERQ.与RTA相比较,纯化的重组蛋白在体外有相似的蛋白质合成抑制活性,RTA-KFERQ对HEPG2、Hela和A549细胞的毒性分别减少了约49.87%、54.18%、88.68%.结论:RTA不能完全被溶酶体灭活,RTA可能存在溶酶体外的降解途径.     

蓖麻毒素细胞毒性及其中毒小鼠组织病理改变

目的：探讨蓖麻毒素对不同细胞的细胞毒性及小鼠各主要组织脏器毒性的基本病理改变。方法应用MTT法检测不同浓度（1 ng/ml，10 ng/ml，100 ng/ml，1μg/ml）蓖麻毒素给药24 h对不同细胞株（Caco-2，MDCK，MDCK-MDR1，HepG2， H1299）的细胞活性的影响；经灌胃方式使小鼠中毒，中毒24 h观察蓖麻毒素对小鼠脏器的基本病理变化，测定相关生化指标，分析蓖麻毒素对小鼠肝肾损伤。结果不同浓度的蓖麻毒素对Caco-2，MDCK，MDCK-MDR1，HepG2和H1299细胞均有一定的毒性，随着毒素浓度的升高，细胞毒性亦呈上升趋势，有明显量效关系，其中MDCK细胞对蓖麻毒素最为敏感。病理学检测显示蓖麻毒素可致小鼠肾小球出血及部分肾血管内皮细胞缺如，肝细胞水肿、近端肠绒毛损伤、轻度坏死性肺炎并有炎性细胞浸润。血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBIL）、甘油三酯（TG）、肌酐（CREA）均升高，表明小鼠中毒3 h内肝功能和肾功能已出现一定程度的损伤。结论蓖麻毒素通过抑制蛋白质合成而导致细胞坏死。不同细胞对蓖麻毒素具有不同的敏感性，表现为蓖麻毒素中毒早期，动物即可出现严重的肝、肾损伤。     

蓖麻毒素的提取及其抗肿瘤作用研究

目的:研究蓖麻毒素的提取方法和对肿瘤细胞的杀伤作用.方法:根据Nicolson和Blaustein的方法稍加改良,通过PBS提取、硫酸铵分段盐析、Sephrose 4B亲和层析和Sephadex G100凝胶过滤等步骤,从去壳蓖麻籽中提取天然蓖麻毒素;采用细胞培养,以MTT法分析不同浓度蓖麻毒素对肿瘤细胞的杀伤作用.结果:用亲和层析和凝胶过滤等步骤提纯的蓖麻毒素,分子量为63 kD,由2个亚基组成.细胞毒性分析:蓖麻毒素在高浓度下(5×10-8mol/L～5×10-10mol/L)对正常细胞和结肠癌细胞的杀伤效率无差异(P>0.05),而在低浓度下(5×10-11mol/L～5×10-13mol/L)两者有显著性差异(P<0.01);各种浓度蓖麻毒素对白血病细胞K562和大肠癌细胞SW480的杀伤作用无统计学上的差别(P>0.05).结论:蓖麻毒素在低浓度下对肿瘤细胞的杀伤有选择性,对白血病细胞K562和大肠癌细胞SW480的杀伤作用在各种浓度下无选择性.     

Targeted anti-tumor agents and their cytotoxicity on gastric cancer cells in vitro.

Several chemotherapeutic drugs including methotrexate, daunomycin, mitomycin C and toxin such as ricin, A chain of ricin were chosen to conjugate with murine monoclonal antibodies MGb2 and MG11. The drugs were linked to antibody directly or through human serum albumin as intermediary. The ELISA results showed that the antibody retained well the antigen-binding capacity during conjugation. These conjugates showed highly selective cytotoxic effect on target cells. In chronic cytotoxicity tests, the cytotoxic effect of these conjugates on human gastric cancer cells KATOIII was quite similar to that of free drugs or ricin, but greater than that of irrelevant conjugates, while they had a little effect on non-target cells, suggesting that the selective cytotoxicity on target cells of the conjugates be mediated by antibodies.

     

RTA—RA3是B220特异性的有潜力的抗自身免疫的免疫毒素

将抗B220单克隆抗体分泌克隆RA3注射至SCID小鼠腹腔以获取腹水，抗体经proteinA亲和层析柱提纯，再经SPDP双功能交联剂修饰后，与还原的去糖基蓖麻毒蛋白A链反应生成免疫毒素RTA-RA3．SephadexG150柱层析分离纯化此免疫毒素，在还原状态下可见到免疫球蛋白重链、轻链及另一条带RTA．免疫毒素体内注射，研究MRL/＋和MRL/lpr小鼠脾细胞的淋巴细胞标志．实验表明：RTA－RA3对脾B220＋细胞有显著抑制作用．提示这一免疫毒素可用于治疗自身免疫性疾病。     

SOKT_1-RTA免疫毒素的制备及其对人T淋巴细胞的特异性细胞毒作用

抗人外周血T淋巴细胞单克隆抗体(McAb)SOKT_1通过SPDP与蓖麻蛋白A链(RTA)交联制成免毒素SOKT_1-RTA,在20mmol/L氯化铵存在条件下,能够杀伤82%人外周血T细胞,并使其~3H-亮氨酸掺入下降为对照的6.2%。SOKT_1-RTA的作用能够被未结合RTA的SOKT_1部分阻滞,而另一无关McAb末显示阻滞作用。表明:SOKT_1-RTA结合物具有SOKT_1的抗原结合特异性和RTA的细胞毒性,有可能成为清除人骨髓中T细胞的有效制剂。     

Hypoxic cells in tumors as a target for cancer therapy

Hypoxic cells that are found in solid tumors are resistant to anticancer drugs and radiation therapy. Thus, for effective anticancer chemotherapy, it is important to identify drugs with selective toxicity towards hypoxic cells. The recent development of new drugs that are toxic only when activated in the hypoxic cell opens a new era of cancer treatment. Recently, we evaluated the hypoxia-selective toxicity of four differently substituted quinoxaline 1,4-dioxides (QdNOs) in human cancer cells. These compounds were synthesized by the Beirut Reaction. The various QdNOs were found to exert potent hypoxic cytotoxic activities against human colon cancer cells (T-84) and to possess a 50-100 fold greater cytotoxicity under hypoxia compared to oxia. Interestingly, the hypoxia cytotoxicity ratio (HCR: ratio between drug concentration in air and in hypoxia to give 10% cell survival) of these compounds was found to depend on the nature of the substituents on the quinoxaline 1,4-dioxide heterocycle. Because of their differential hypoxic cytotoxicity, these drugs could provide useful therapeutic agents against solid tumors. Presently we are investigating the selective cytotoxicity of QdNOs for hypoxic cells in tumors in vivo and their ability to potentiate radiation-induced tumor cell killing. We will also study their in vitro anti-angiogenic activity and their mechanism of action at the molecular level. The deciphering of the mechanism of action of QdNOs may allow us to ultimately recommend their use as therapeutic agents against human tumors.     

蓖麻毒素修饰物的制备和细胞毒作用

为了降低蓖麻毒素的毒性，保留其抗肿瘤活性。采用３－Ｎ－羟基丙酸琥珀酰亚胺酯修饰ＲＴ，实验观察修饰前后ＲＴ的急性及体外对三株肿瘤细胞杀伤作用的。ＲＴ－ＰＤＰ小鼠腹腔ＬＤ５０为６８．２μｇ／ｋｇ，比ＲＴ大２．４５倍，并且对人子宫颈癌细胞胃癌及小鼠乳腺癌细胞的均有较强杀伤性。     

Preparation of SOKT1-RTA immunotoxin and its specific cytotoxic effect on human T lymphocytes]

An immunotoxin, SOKT1-RTA, was prepared successfully by conjugating a murine anti-human T lymphocyte monoclonal antibody (McAb) SOKT1 and the ricin toxin A chain (RTA) with the heterobifunctional linker SPDP. At the presence of 20 mmol/L NH4Cl, the SOKT1-RTA conjugate killed 82% of the human peripheral blood T cells (PBT), and decreased their 3H-Leu incorporation to 6.2% of the untreated controls. The toxic effect of the immunotoxin can be partially blocked by unconjugated SOKT1, but not by an irrelevant McAb D51. These results indicated that the SOKT1-RTA conjugate still retains both functions of its component parts:binding to human PBT specifically, and inhibiting protein synthesis. It may be an effective reagent for in vitro depletion of immunocompetent T cells from human bone marrows.