人肺癌细胞NHE-1基因片段的克隆及其反义表达载体的构建

构建人肺癌细胞Ｎａ＾＋／Ｈ＾＋交换泵－１（Ｎａ＾＋／Ｈ＾＋ｅｃｘｈａｎｇｅｒ－１，ＮＨＥ－１）基因的反义表达载体，为将来能在体内应用抑制ＮＨＥ－１基因表达的肿瘤治疗奠定基础。方法采用ＰＣＲ技术从人肺癌Ａ５４９细胞基因组中克隆出长为４５４ｂｐ的ＮＨＥ－１基因外显子部分序列，在上、下游引物５’－端带上ＢａｎＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ酶切位点。然后将该片段反向插入逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮ的多克隆位点。最后对产生的     

单羧酸转运泵基因反义真核表达载体的构建

目的 构建单羧酸转运泵基因反义逆转录病毒真核表达载体。方法 应用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增带有双酶切位点的单羧酸转运泵目的基因片段,与带有相同酶切位点的ｐＬＸＳＮ逆转录病毒真核表达载体粘末端进行反向基因插入连接,构建具有反义表达的逆转录病毒载体。结果 构建载体进行双酶切电泳分析及插入片段基因序列分析。证明反义载体构建成功。结论 应用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增插入ＤＮＡ片段,简单、灵活、快捷。双酶切定向连接构建     

反义人PCNA基因真核表达载体pDR－PCNA的构建及鉴定

反义人ＰＣＮＡ基因真核表达载体ｐＤＲ－ＰＣＮＡ的构建及鉴定戴林，张学庸，惠宏襄，赵永同，王成济（西安西京医院消化内科西安７１００３３西安生物化学教研室）关键词ＰＣＮＡ基因；反义核酸；真核细胞；表达载体中图号Ｑ５２７．５增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）是ＤＮ...     

人反义SOD2基因真核表达载体的构建与鉴定

人反义ＳＯＤ２基因真核表达载体的构建与鉴定李福洋１惠宏襄１莫简２王成济１（第四军医大学：１生物化学与分子生物学教研室，２化学教研室西安７１００３３）关键词自由基超氧化物岐酶反义核酸表达载体中图号Ｑ２６自由基与机体的许多生理，病理过程关系密切．近年来分...     

HGFK1基因真核表达载体的构建及鉴定研究

目的构建携带人HGFK1基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）-HGFK1。方法通过PCR方法从已经构建好的病毒穿梭载体中扩增出HGFK1基因,构建pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表达载体,经PCR、酶切、测序、蛋白表达等方法进行鉴定。结果PCR、酶切、测序以及蛋白表达证实pcDNA3.1（-）-HGFK1载体序列正确。结论本研究成功构建了pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表达载体,可为后续进行肝癌细胞的生物学研究提供帮助。     

人全长PLCr 1基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人全长PLCr1基因真核表达载体，以便进一步研究PLCr1的作用及其机制。方法自行设计一对带有日砌Ⅲ和Not Ⅰ酶切位点的引物，采用RT-PCR技术从MG63细胞中扩增人全长PLCr1 cDNA(3878bp)，纯化后，经HindⅢ-NotⅠ酶切，插入真核表达载体pLNCX2中，构建重组质粒pLNCX2／PLCr1。通过PCR，限制性酶切分析及DNA直接测序对所构建的重组质粒进行鉴定。同时经瞬时转染后，利用RT-PCR及Western blotting转染后LoVo细胞中PLCr1的表达。结果RT-PCR产物经琼脂糖电泳分析所得片段大小与预期相符(3878bp)。重组质粒经日HindⅢ-NotⅠ酶切后，得到3878bp(PLCr1基因)及6100bp(载体pLNCX2)两个片段，同时重组质粒经HindⅢ-BglⅡ酶切后．得到约1300bp及约8500bp两个片段，与预期一致。DNA测序也证实了重组质粒的正确。经RT-PCR和Westem blot分析证实转染pLNCX2／PLCr1的LoVo细胞中PLCr1的表达均高于转染空质粒pLNCX2的LoVo细胞及未转染的LoVo细胞。结论成功构建了人全长PLCr1基因真核表达载体pLNCX2／PLCr1，为进一步研究PLCr1的作用奠定了基础。     

肝素酶反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建肝素酶（heparanase，Hpa）反义RNA真核表达载体。方法 提取胃癌组织总RNA，按照GenBank中检索出的Hpa基因cDNA序列，设计并合成反义Hpa基因片段的引物，进行RT-PCR，并将扩增产物克隆至DGEMT载体，PCR鉴定及测序证实后，双酶切pGEM-T-antiHpa重组体回收目的片段，再将其反向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3．1中，并对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析。结果 PCR扩增出的反义片段与预期长度相符。构建的Hpa反义RNA表达质粒pcDNA3．1-antiHpa，分别作PCR及双酶切（BamHⅠ和HindⅢ）鉴定，证实其中有目的片段完整插入，插入片段测序结果与反义Hpa序列设计完全一致。结论 成功构建了Hpa反义RNA真核表达载体pcDNA3．1-antiHpa，此结果为进一步研究Hpa蛋白分子的生物学功能和以Hpa为靶点的恶性肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。     

RON基因反义核酸真核表达载体的构建策略

目的 构建RON基因跨膜区段(RONm)的反义核酸真核表达载体。方法 用RT-PCR技术，从人肺癌细胞提取的总RNA克隆RONm eDNA序列。然后酶切鉴定与测序分析得到RONm的T载体，再将RONm反向插入peDNA3．1 中，酶切鉴定得到RONm反义真核表达载体。结果 用RT-PCR亚克隆RONm，测序结果与GenBank的RONm相应序列(X70040)一致，阅读框无改变。构建出正确的RONm反义真核表达载体。结论 成功构建RONm反义核酸真核表达载体，为进一步将RON基因反义核酸作为一种肺癌基因治疗方法的研究打下了分子生物学基础。     

分步克隆法构建人拓扑异构酶Ⅲalph真核反义表达载体及鉴定

目的 应用分步克隆法构建人拓扑异构酶Ⅲ alpha(hTOP 3 alpha)真核反义表达载体，为进一步阐明其与控制细胞周期的相关基因ATM之间的相互作用，研究ATM的生物学功能奠定基础。方法 采用分步克隆法首先用Hind Ⅲ和EcoRI双酶切构建插入2．6kb的片段，再用EcoRI酶切插入另一1kb的片段，最终获得人拓扑异构酶Ⅲ真核反义表达的重组载体。结果 经酶切、测序鉴定，人拓扑异构酶Ⅲ真核反义表达载体构建成功。结论 为研究ATM基因与人拓扑异构酶Ⅲ的相互作用，阐明其生物学功能奠定了基础，同时为大片段的基因的表达载体构建探索了新的方法和途径。     

mrp反义mRNA真核表达载体pcDNA-Amrp的构建

0 引言 肿瘤多药耐药(MDR)是目前临床化疗的主要障碍和失败的根本原因,是亟待解决的问题之一[1]. MDR相关蛋白(MRP)是1992年Cole等[2]在耐阿霉素的小细胞肺癌细胞系H69AR中发现的一种新的肿瘤耐药相关分子,经研究证实,这种蛋白参与体内多种肿瘤耐药的发生,在某些肿瘤组织如胃癌,食管癌和乳腺癌等中呈强阳性表达. 为进一步探讨mrp在人类肿瘤MDR中发生的意义及反义mrp逆转耐药的可能性,我们构建了反义mrp真核表达载体,以了解用其转染耐药细胞后降低细胞MRP的表达对MDR功能的影响.     

Cloning of NHE-1 gene fragment from human lung can.cer cells and construction of its antisense expression vector

Objective: To clone the partial sequence of Na^ /H^ exchanger- 1 (NHE- 1) gene of human lung cancer cells and insert it reversely into the multiclone site of pLXSN in order to construct an antisense expression vector for tumor gene therapy it~ vivo. Methods: With use of the upstream and downstream primers containing Barn H I and EcoR I in their 5‘ ends respectively, a partial sequence of the first exon of NHE-1 gene was cloned in a length of 454 bp from genomic DNA of human lung cancer cell A549 with PCR method. The product was then direetionally and reversely insert into the multiclone site of pLXSN. Finally, the constructed recombinant was identified with agarose gel electrophoresis and DNA sequencing. Results: The cloned fragment was 461 bp in length and successfully ligated to pLXSN with the identification by agarose gel etectrophoresis. DNA sequencing confirmed that the fragment cloned and inserted into the vector was identical with the targeted one. Conclusion: The targeted fragment is successfully cloned and reversely inserted into pLXSN in our experiment. The antisense expression vector of NHE-1, pNHE-1, was constructed successfully.     

NHE1蛋白在胃癌和胃癌前病变中的表达及临床意义

目的检测NHE1蛋白在胃癌和胃癌前病变中的表达情况,初步探讨NHE1蛋白在胃粘膜癌变过程中的变化规律及其临床意义.方法采用免疫组织化学方法检测NHE1蛋白在胃癌和胃癌前病变中的表达,其中正常胃粘膜15例,慢性萎缩性胃炎15例,肠上皮化生15例,异型增生8例,胃癌40例.结果 15例正常胃粘膜无表达,15例慢性萎缩性胃炎中有2例表达,阳性率为13.33%,15例肠上皮化生中有3例表达,阳性率为20.00%,8例异型增生中有2例表达,阳性率为25.00%,40例胃癌中有33例表达,阳性率为82.50%,胃癌与正常胃粘膜和各型胃癌前病变相比,具有显著性差异(P<0.01).结论 NHE1蛋白在胃癌的表达显著高于正常胃粘膜和胃癌前病变,可能与胃癌的发生、生长、转移有着密切的关系.     

正反义人Tankyrase基因真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人Tankyrase正义和反义真核表达载体．方法：用EcoRⅠ从TT20质粒上切下约3．44kb的Tankyrase cDNA片段，然后连入pcDNA3．1／Zeo的EcoR Ⅰ酶切位点上，经BamH Ⅰ酶切鉴定出正义和反义表达载体．结果：经BamH Ⅰ酶切后，正义质粒形成5．0 3．4kb两条带，而反义重组质粒为8．2 0．2kb两条带，与理论计算值完全一致．结论：成功构建了人Tankyrase的正、反义真核表达载体。     

NHE1蛋白在胃癌中的表达及与肿瘤侵袭转移的关系

目的 探讨NHE1蛋白在胃癌组织中的表达及其与肿瘤侵袭转移的关系.方法 采用SP免疫组织化学方法检测NHE1蛋白在40例胃癌中的表达.结果 NHE1蛋白在40例胃癌原发灶阳性表达率为82.50%.NHE1蛋白表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移关系密切,而与肿瘤分化程度无关.结论 NHE1蛋白在胃癌侵袭转移中起重要作用,对判断预后具有重要意义.     

MGMT反义RNA真核表达载体的构建与鉴定

目的：探讨反义ＲＮＡ逆转胶质瘤细胞耐药的可能性，构建ＭＧＭＴ反义ＲＮＡ的真核表达载体。方法：以ＸｈｏⅠ和ＰｖｕⅡ双酶切质粒ｐＨＭ１４，回收１７８ｂｐ的片段，定向插入以ＨｐａⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切ｐＬＸＳＮ所获得的线性化载体，构建针对ＭＧＭＴｍＲＮＡ５＇端的反义表达载体ｐＬａＭＴ５ＳＮ；以ＥｃｏＲⅠ单酶切ｐＨＭ１４，回收７７９ｂｐ的片段，插入以ＥｃｏＲⅠ单酶切ｐＬＸＳＮ并经ＣＩＡＰ去磷酸化的线性载体，构建针对ＭＧＭＴｍＲＮＡ全长序列的反义表达载体ｐＬａＭＴＳＮ。结果：ｐＬａＭＴ５ＳＮ经ＨｉｎｄⅢ酶切可见３７０ｂｐ的片段；ｐＬａＭＴＳＮ经ＰＣＲ扩增证明目的片段反向插入ｐＬＸＳＮ，鉴定结果表明构建成功。结论：成功构建了两个ＭＧＭＴ反义ＲＮＡ的真核表达载体，为研究ＭＧＭＴ反义ＲＮＡ逆转胶质瘤耐药细胞的耐药表型提供了良好的实验材料。     

mTOR反义RNA真核表达载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的：构建哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的反义RNA真核表达载体，观察其对血管平滑肌细胞（VSNC）功能的影响。方法：提取人VSMC总RNA，反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增mTOR基因cDNA序列，经pGEM-T载体克隆后双酶切，将cDNA序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGP-C1，构建mTOR基因反义RNA真核表达载体。转染VSMC，采用Western blot法检验反义表达载体对mTOR蛋白表达的影响，流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果：经RT-PCR获得664bp产物，T载体克隆后，经DNA测序，确定该片段为mTOR基因cDNA，进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-mTOR，测序证明序列正确后转染VSMC，证实其能够显著抑制mTOR蛋白产物表达，VSMC的分裂、增殖过程受阻。结论：已经成功构建mTOR基因的反义RNA真核表达载体。     

人NHE1反义基因转染对SGC-7901胃癌细胞形态学的影响

目的探讨反义NHE1基因转染对SGC-7901胃癌细胞形态学的影响及其在肿瘤基因治疗中的价值.方法构建人NHE1基因反义真核表达载体,采用脂质体法将其转染至SGC-7901胃癌细胞中, 从光镜、电镜水平比较观察转染与未转染细胞形态学的变化.结果与亲本细胞相比,光镜下反义NHE1基因转染的SGC-7901细胞胞体增大,胞浆丰富,核大小相对一致,核浆比减少,核分裂相减少,异型性减小.透射电镜下细胞线粒体数量增多、体积增大,并可见髓鞘样变,粗面内质网、Golgi较发达,内质网扩张,核偏向一侧,极性增强.结论反义NHE1基因转染能使SGC-7901细胞发生形态学及超微结构的变化,有促进SGC-7901细胞分化的作用.     

大鼠谷氨酰胺酶反义真核表达载体的构建及鉴定

目的 :构建大鼠谷氨酰胺酶 (GA)反义真核表达载体。　方法 :采用分子克隆技术将rGAcDNA反向克隆到真核表达载体pcDNA 3.0中。　结果 :EcoRⅠ和HinDⅢ双酶切后 ,反义重组基因为 0 .2 8kb和 5 .4kb两条带 ,与理论计算相符。　结论 :成功构建了大鼠GA反义真核表达载体 ,为肿瘤细胞的GA反义基因治疗研究创造条件     

真核表达质粒pBK—IL—1ra的构建及表达

目的 构建可在真核细胞内高效表达白细胞介素－１受体拮抗剂（ＩＬ－１ｒａ）的真核表达质粒ｐＢＫ－ＩＬ－１ｒａ,以便用于ＩＬ－１ｒａ基因治疗研究。方法 采用分子生物学技术将ＩＬ－１ｒａ ｃＤＮＡ插入真核表达载体ｐＢＫ－ＣＭＶ中,构建成真核表达质粒ｐＢＫ－ＩＬ－１ｒａ。通过竞争性ＥＬＩＳＡ、原位杂交和免疫组检测其在体外和体内转染真核细胞后ＩＬ－１ｒａ基因和蛋白的表达。结果 （１）酶切、ＰＣＲ和ＤＮＡ测序