活性维生素D缺乏促进小鼠皮肤衰老

目的:探讨1,25二羟基维生素D3[1,25(OH)2D3]在抗皮肤衰老中的作用及机制。方法:使用组织学、免疫组织化学、免疫印迹和生化指标检测的方法比较同窝10周龄25-羟化维生素D1α-羟化酶基因敲除纯合子[1α(OH)ase-/-]小鼠和野生型小鼠皮肤表型的差异。结果:1α(OH)ase-/-小鼠皮肤衰老相关β-半乳糖苷酶染色增强,出现皮肤变薄、表真皮交界平坦、皮下脂肪和毛囊数目减少等衰老表型;通过细胞增殖性核抗原(PCNA)免疫组织化学染色和TUNEL检测,发现1α(OH)ase-/-小鼠皮肤中PCNA阳性细胞明显减少而TUNEL阳性细胞则显著增多;免疫印迹结果显示p16、p27、p53、NF-κB、活化型Caspase-3在1α(OH)ase-/-小鼠皮肤组织中表达明显升高;生化检测显示1α(OH)ase-/-小鼠皮肤活性氧(ROS)水平明显升高、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)水平降低、丙二醛(MDA)含量增高。结论:1,25(OH)2D3能够通过促进皮肤细胞增殖、抑制皮肤细胞凋亡和抗氧化应激作用发挥抗皮肤衰老的作用。     

吡咯喹啉醌对Bmi-1基因缺失引起小鼠皮肤早衰的保护作用

目的：研究吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone,PQQ）是否通过抑制氧化应激发挥对Bmi-1缺失小鼠引起皮肤早衰的治疗作用。方法：将同窝的Bmi-1杂合子（Bmi-1+/-）雌雄小鼠进行配对,取7周龄正常饮食野生型（wild type,WT）小鼠10只,正常饮食Bmi-1基因敲除（Bmi-1 knock out,BKO）小鼠10只,以及正常饮食添加PQQ 的BKO小鼠（PQQ+BKO）10只,利用HE染色、组织化学、免疫组织化学及流式细胞仪检测等方法进行相关实验。结果：与BKO组小鼠比较,PQQ+BKO组小鼠整体表型部分纠正,毛色光滑,体重增加,生存期明显延长;PQQ+BKO组小鼠皮肤厚度［（142.65±0.25）μm］与BKO组小鼠［（78.45±0.35）μm］相比,差异有统计学意义（P＜0.01）;PQQ+BKO组小鼠皮肤总胶原阳性面积百分比［（25.64±0.28）%］与BKO组小鼠［（14.87±0.47）%］相比,差异有统计学意义（P＜0.01）;PQQ+BKO组小鼠皮肤PCNA阳性细胞百分比［（18.54±0.37）%］与BKO组小鼠［（5.85±0.64）%］相比,差异有统计学意义（P＜0.01）;PQQ+BKO组小鼠皮肤纤维化阳性面积百分比［（48.64±0.28）%］与BKO组小鼠［（87.64±0.46）%］相比,差异有统计学意义（P＜0.01）; PQQ+BKO组小鼠皮肤的ROS水平（298.17±0.25）较BKO组小鼠（427.80±0.63）显著下降（P<0.01）。结论：PQQ通过增加皮肤胶原蛋白、促进皮肤细胞增殖、减少皮肤组织纤维化、清除氧自由基ROS水平等对Bmi-1缺失所致皮肤早衰发挥保护作用。     

Chk2敲除可通过增强抗氧化能力改善由Bmi⁃1缺失所致的小鼠脑衰老表型

目的：探索细胞周期检测点激酶2（cell?cycle checkpoint kinase 2,Chk2）敲除是否能改善由B淋巴瘤Mo?MLV插入区1（B cell?specific MLV integration site?1,Bmi?1）缺失所致的小鼠脑衰老表型。方法：取2月龄Bmi?1基因敲除（Bmi?1-/-）小鼠、Chk2基因敲除（Chk2-/-）小鼠、Bmi?1和Chk2双敲（Bmi?1-/-Chk2-/-）小鼠以及同窝野生型（wild type,WT）小鼠脑组织,通过免疫组织化学染色检测不同组小鼠脑组织皮层、海马、下丘脑中NeuN、GFAP、Iba1、p16等指标的变化,通过Western blot检测不同组小鼠脑皮质中p16、SOD1、SOD2蛋白表达量的差异。结果：与同窝WT小鼠相比,Bmi?1?/?小鼠在上述脑区中NeuN、Iba1阳性细胞百分率明显减少,GFAP与p16的阳性细胞百分率明显增加,SOD1、SOD2蛋白表达量明显降低,p16蛋白表达量明显上升,而在Chk2-/-小鼠中NeuN、Iba1阳性细胞百分率则增加,GFAP与p16的阳性细胞百分率明显减少,SOD1、SOD2蛋白表达量明显上调,p16蛋白表达量明显下降;与Bmi?1-/-小鼠相比,Bmi?1-/-Chk2-/-小鼠在上述脑区中NeuN、Iba1阳性细胞百分率明显增加,GFAP与p16的阳性细胞百分率明显减少,SOD1和SOD2蛋白表达量明显上升,p16蛋白表达量明显下降。结论：Chk2敲除可通过增强抗氧化能力,从而改善由Bmi?1缺失所致的小鼠脑衰老表型。     

Bmi⁃1通过下调NF⁃κB信号通路防治小鼠萎缩性胃炎

目的：明确Bmi?1是否有防治萎缩性胃炎的作用及其机制。方法：针对7周龄Bmi?1基因缺失（Bmi?1 knock out,BKO）纯合子小鼠和同窝野生型（wild type,WT）小鼠,利用组织学切片、免疫组织化学和 Western blot比较分析胃的表型差异。结果：与WT小鼠相比,BKO小鼠表现为胃壁变薄、腺体萎缩和炎症浸润的萎缩性胃炎表型。免疫组化结果显示白细胞介素6（interleukin 6,IL?6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α,TNF?α）阳性细胞面积和核因子?κB?p65（nuclear factor?κB?p65,NF?κB?p65）阳性细胞数明显增加;Western blot 结果显示IL?6、TNF?α和NF?κB?p65蛋白表达水平明显升高。结论：在小鼠中,Bmi?1可通过下调NF?κB信号通路防治萎缩性胃炎。     

p21结构功能与研究新进展

细胞周期是由周期依赖激酶(CDK)和细胞周期蛋白共同作用而完成。尤其是G1期过渡到S期受细胞周期负调节因子家族周期蛋白依赖激酶抑制因子(CDKI)的调节,p21可以和p53共同构成细胞周期G1检查站,因DNA损伤后不经过修复则无法通过,减少受损DNA的复制和积累,从而发挥抑癌作用。当p21、Cyclin、CDK,PCNA四聚体的功能受到抑制,则使增殖信号大量活化,导致细胞异化和恶变。p21作为一种负性调节因子,在依赖野生型p53的表达通路上与肿瘤的表达、表达含量、表达位置,以及预后都密切相关。     

PTH缺乏经细胞外钙介导卵巢血管生成障碍而致生殖能力降低

目的:探讨甲状旁腺素(PTH)缺乏引起生殖功能降低的机制.方法:使用组织学,免疫组织化学和Western blot的方法比较分析了同窝4个月PTH基因敲除纯合子小鼠和野生型小鼠分别给予正常钙(1%)、低钙(0.01%)及高钙饮食(2%)后生殖能力、卵巢成熟卵泡数量、黄体形成及血管生成的差异.结果:与同窝野生型雌性小鼠(PTH+/+)相比,正常饮食PTH基因敲除纯合子小鼠(PTH-/-)生殖能力下降,成熟卵泡数量及黄体生成减少,卵巢血管发生减少;低钙饮食PTH-/-表现为完全不孕,成熟卵泡数量进一步减少和黄体缺失,卵巢血管发生减少更为明显;而高钙饮食PTH-/-生殖能力、成熟卵泡数量、黄体形成及血管发生均恢复正常.结论:PTH缺乏经细胞外钙介导卵巢血管生成障碍而致生殖能力降低.     

甲状旁腺素在胸腺的表达及血钙对其表达的调节

目的:为了证实PTH基因在胸腺的表达,明确PTH蛋白在胸腺组织的定位以及胸腺来源的PTH是否受到血钙水平改变的调节.方法:使用RT-PCR、real-time PCR和免疫组织化学的方法比较分析同窝2周龄PTH基因敲除纯合子(PTH-/-)和野生型(WT)小鼠以及1-α羟化酶基因敲除纯合子[1α(OH)ase-/-]和野生型(WT)小鼠的甲状旁腺和胸腺的PTH表达差异.结果:PTH-/-小鼠的甲状旁腺和胸腺无PTH表达:同窝WT小鼠甲状旁腺和胸腺均有PTH表达,但胸腺表达水平较甲状旁腺低.PTH在胸腺上皮细胞表达,而不在胸腺淋巴细胞表达.1α(OH)ase-/-小鼠表现为低钙血症.与正常血钙的WT小鼠相比,PTH基因和蛋白的表达水平在1α(OH)ase-/-小鼠胸腺组织中均明显升高.结论:胸腺组织不仅是产生PTH的辅助器官,而且其PTH表达也受到血钙水平的调节.     

p21基因与肿瘤的研究进展

p21基因是C1P家族中的一员,它是位于p53基因下游的细胞周期素依赖性激酶抑制因子。p21可以和p53共同构成细胞周期G1检查站,因DNA损伤后不经过修复则无法通过,减少了受损DNA的复制和积累,从而发挥抑癌作用。     

西立伐他汀对动脉平滑肌细胞周期调控因子和增殖反应的干预作用

目的 :探讨西立伐他汀对大鼠动脉球囊损伤后平滑肌细胞周期调控因子 p2 7、CDK2、PCNA表达和增殖反应的干预作用。方法 2 4只大鼠随机分为假手术组、手术组、西立伐他汀组 ,8只 /组。后两组行球囊内皮剥脱术 ,西立伐他汀组于术前 3d开始灌胃法给予西立伐他汀 ,0 .1mg/kg·d-1,假手术组和手术组同期给予等量生理盐水灌胃。术后 14d处死所有动物 ,取胸主动脉进行HE染色及p2 7、CDK2、PCNA免疫组织化学染色 ,并进行血管形态学检测。结果假手术组无新生内膜形成 ,手术组内膜增生显著 ,他汀组内膜增生减轻 (I/M :41.5 0± 9.5 4vs14.6 7± 7.36 ,P <0 .0 1)。免疫组织化学染色显示假手术组 p2 7高表达 ,CDK2、PCNA未见表达 ;手术组新生内膜处 p2 7低表达 ,CDK2、PCNA高表达 ;他汀组新生内膜p2 7表达强烈 ,而CDK2、PCNA表达被抑制。结论在活体内 ,他汀可通过影响细胞周期调控因子的表达而抑制动脉损伤后的内膜增殖反应。     

p53-p21通路在动脉血管平滑肌细胞衰老中的作用研究

[摘要]　目的　研究p53-p21通路在血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）衰老中的作用。　方法　用血管紧张素II（angiotensin II,Ang II）持续作用引起VSMC衰老,检测衰老相关蛋白分子的表达。利用β半乳糖苷酶（senescence associated beta galactosidase,SA-β-gal）染色确定VSMC衰老,检测经Ang II诱导的p53敲除小鼠及其同窝野生型小鼠VSMC的衰老情况,通过感染腺病毒p21及其对照GFP的方法使VSMC中p21过表达,用3H标记脱氧胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法检测p21过表达VSMC增殖,用流式细胞仪测定细胞周期。　结果　Ang II处理引起VSMC的p53、p21、p16表达增加,Ang II 处理后使p53基因敲除的VSMC衰老细胞数明显少于其对照p53野生型鼠的VSMC（P<0.01）,过表达p21显著抑制VSMC的3H-TdR掺入（P<0.01）,并且引起细胞周期G1期阻滞;过表达p21能引起VSMC衰老。　结论　p53-p21通路在Ang II引起的VSMC衰老发生过程中发挥重要作用。     

Bmi-1基因在多种肿瘤中表达的研究进展

B细胞特异的莫洛尼白血病毒插入位点1基因(Bmi-1)是属于转录抑制因子多疏基基因家族中的成员之一,Bmi-1在调节干细胞自我更新、细胞增殖和衰老中发挥重要作用。近年来研究发现,Bmi-1在多种肿瘤中表达异常,在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。体外实验证明,干扰Bmi-1表达可显著抑制肿瘤细胞增殖。     

DNA甲基转移酶1在小鼠皮肤衰老中的作用

目的：探讨DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)在小鼠皮肤衰老中的作用。方法：获取表 皮条件性K14-Cre介导的DNMT1基因敲除鼠(Mut组,n=4)及等月龄同窝正常小鼠(WT组,n=4),观察皮肤表型的变 化;HE染色检测皮肤组织学变化;Gomori醛复红染色检测两组小鼠真皮弹力纤维数目及形态变化;免疫组织化学染 色法检测5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,Brdu)标记的表皮短暂扩充细胞(transit amplifying cells,TAC)含 量;免疫组织荧光染色法检测氯去氧尿苷(chlorodeoxyuridine,CldU)标记的表皮中标记滞留细胞(label-retaining cells, LRC)的含量。结果：与等月龄的同窝WT组相比,Mut组皮肤出现过早衰老的症状;HE染色显示表皮增厚、真皮胶 原纤维减少等老化现象;真皮内弹力纤维断裂变形增多;表皮中TAC的数量明显增多(P<0.05);LRC的数量明显减少 (P<0.05)。结论：与WT组相比,Mut组出现了皮肤早衰的表型,其机制可能是由于DNMT1敲除后表皮干细胞耗竭所致。     

RNA干扰PCGF4/Bmi-1抑制白血病K562细胞系增殖

目的:利用RNAi方法针对PCGF4/Bmi-1基因,抑制其在慢性髓性白血病K562细胞中的过表达,观察K562细胞的增殖性改变。方法:RT-PCR检测PCGF4/Bmi-1基因在K562中的表达情况。利用Invitrogen公司RNAi慢病毒表达载体系统,构建针对PCGF4/Bmi-1基因慢病毒RNAi表达载体。转染K562细胞,瞬时干扰PCGF4/Bmi-1基因的表达,实时定量PCR检测干扰前后基因表达变化。利用生长曲线测定干扰载体转染前后细胞生长速度变化。结果:PCGF4/Bmi-1慢病毒RNAi表达载体成功地构建,并建立瞬时干扰PCGF4/Bmi-1基因的K562细胞系。实时定量PCR检测,PCGF4/Bmi-1基因在K562细胞系中过表达被显著抑制。生长曲线测定,PCGF4/Bmi-1基因干扰后细胞增殖明显变慢。结论:干扰PCGF4/Bmi-1基因,降低该基因表达后能明显减低细胞的生长速度。     

ERβ基因敲除小鼠的繁殖、鉴定及检测

目的繁殖和鉴定出足够数量的ERβ基因敲除雌性小鼠,建立ERβ基因敲除雌性小鼠骨质疏松性骨折实验动物模型基础。方法将引进的3对ERβ基因敲除小鼠饲养于屏障环境中,按遗传学规则进行繁殖3月后,引进2月龄遗传背景为野生型C57BL/6J种系雌鼠14只与纯合子雄性小鼠按2:1配对合笼扩增雌性杂合子小鼠再行分组繁殖,1月后获得较多数量的小鼠后,提取小鼠尾部组织DNA进行聚合酶链式反应(PCR)检测种系基因型,选取10只4月龄ERβ基因敲除纯合子雌性小鼠(βERKO)和10只野生型雌性小鼠(Sham)用MicroCT检测并比较胫骨近端骨小梁结构参数值,进行统计学分析。结果至分组开始繁殖第2个月,计有340只小鼠育出,经鉴定,ERβ+/+小鼠占23.5%、ERβ+/-小鼠占48.2%,ERβ-/-小鼠占28.3%、其中雌性54只,符合研究需要的动物数量较前5月增加近4倍,经过microCT检测4月龄的子代ERβ基因敲除雌性小鼠(βERKO)比较野生型雌性小鼠(Sham)骨小梁矿物质含量的差异具有统计学意义(P<0.05)。结论本研究引进遗传背景为野生型C57BL/6J种系雌鼠与纯合子雄性小鼠配对,是在短期内成功地大量繁育足...     

NLRP3基因敲除小鼠的繁殖与基因型鉴定

目的 繁殖及鉴定NLRP3基因敲除（NLRP3^-/-）小鼠。方法 将引进的NLRP3基因敲除杂合子小鼠,单独进行饲养及配种繁殖,繁殖后其子代出现3种基因型：野生型、杂合子型及纯合子型,提取每只小鼠的基因组DNA,用PCR和T7E1酶切方法进行鉴定,将获得的纯合子小鼠与异性杂合子交配,以获得更多的基因敲除纯合子小鼠。结果 NLRP3杂合子小鼠的饲养及繁殖均获得成功,获得了NLRP3基因敲除纯合子和杂合子小鼠。结论 正确的饲养、繁殖及鉴定方法是从NLRP3基因敲除杂合子小鼠中获得纯合子小鼠的有效途径。     

RNA干扰沉默Bmi-1基因观察胶质瘤细胞凋亡状况的初步研究

目的:初步探讨Bmi-1基因对胶质瘤细胞凋亡状况的影响?方法:采用siRNA技术干扰沉默U251胶质瘤细胞中Bmi-1基因,RT-PCR法检测干扰效果,流式细胞仪检测U251细胞的凋亡状况, one way ANOVA 和t检验进行统计学分析?结果:RT-PCR显示U251细胞RNA干扰组Bmi-1 mRNA凝胶电泳条带呈弱阳性, 阴性对照组和未处理组Bmi-1 mRNA条带呈强阳性,灰度比统计分析,差异具有统计学意义,siRNA可以明显降低U251细胞中Bmi-1基因的表达;流式细胞仪显示干扰组U251细胞的凋亡率为(32.53±6.33)%,高于阴性对照组的凋亡率(21.91±5.63)%,统计分析其差异具有统计学意义?结论:Bmi-1基因可以抑制胶质瘤细胞的凋亡,有可能促进了胶质细胞瘤的发生?发展?     

逆转录病毒载体介导的RNAi抑制Bmi-1基因表达对MCF-7细胞的影响

目的:研究RNA干扰(RNAi)抑制Bmi-1基因表达后对乳腺癌细胞株MCF-7凋亡和增殖的影响.方法:将表达Bmi-1短发夹RNA(shRNA)的重组逆转录病毒载体pSuper-retro/Bmi-1si瞬时转染MCF-7乳腺癌细胞株,携带针对绿色荧光蛋白干扰序列的载体pSuper-retro/GFPsi作为阴性对照.用RT-PCR和Western Blot分别从mRNA,蛋白水平检测Bmi-1的表达;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测MCF-7细胞周期和凋亡的变化.结果:pSuper-retro/Bmi-1si明显抑制MCF-7细胞Bmi-1 mRNA及蛋白表达.与空白对照组及阴性对照组相比较凋亡细胞数无明显增加;抑制Bmi-1基因表达使MCF-7细胞G1/S周期转换及细胞增殖速率受抑制.结论:表达shRNA的重组逆转录病毒载体pSuper-retro/Bmi-1si能显著抑制乳腺癌细胞株MCF-7中Bmi-1基因表达,从而有效抑制MCF-7细胞增殖,为乳腺癌的基因治疗提供了实验依据.     

体外鉴定甲状旁腺激素相关蛋白与Bmi-1的相互作用

目的: 探索并鉴定甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroid hormone related protein,PTHrP)与Bmi-1的结合作用,为进一步研究PTHrP相关信号转导通路提供线索?方法:应用RT-PCR方法体外扩增鼠源性PTHrP基因,经测序后重组人原核表达载体pGEX-2TK,将构建正确的pGEX-2TK/mPTHrP原核表达载体转化E.coli BL21,IPTG诱导表达?表达产物经活性鉴定,通过体外GST pull-down技术和免疫印迹实验,检测PTHrP与Bmi-1蛋白的相互作用?结果:成功构建和表达了重组载体pGEX-2TK/mPTHrP;通过体外蛋白质结合实验证实了PTHrP与Bmi-1蛋白可以相互作用?结论:PTHrP与Bmi-1蛋白之间存在相互作用,此结果为研究PTHrP介导的下游信号转导通路的机制奠定了基础?