重组人血管内皮细胞生长因子工程菌高密度发酵工艺研究

目的建立人血管内皮细胞生长因子(BL21/pET-24a/hVEGF121)工程菌的高密度发酵工艺.方法采用发酵罐发酵,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如培养基、诱导时间及补料进行优化.结果采用M9复合培养基、活化至对数生长期时诱导4 h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,可使菌体量提高至68 g/L,rhVEGF121的表达量达菌体蛋白总量的23%.结论该发酵工艺提高了工程菌的产量和rhVEGF121的表达水平.     

重组工程菌pET32a-CR1-SCR15-18/BL21(DE3)高密度发酵工艺研究

目的建立重组工程菌pET32a-CR1-SCR15-18/BL21(DE3)的高密度发酵工艺。方法以摇瓶发酵结果为基础,扩大至发酵罐发酵,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如发酵培养基、培养温度、pH值、活化时间、诱导时间及分批补加营养物质等条件进行优化。结果采用改良M9-CA培养基、37℃活化4 h后以0.2 mmol/L IPTG诱导表达4 h,以甘油为碳源,在生长期和诱导期分别以40 ml/h和70 ml/h的速率连续流加补料,全程滴加氨水保持培养基pH值保持在7.5,调节转速控制溶解氧在40%左右。最终菌体产量提高至40 g/L以上,CR1-SCR15-18蛋白表达率达28%以上。结论高密度发酵工艺显著提高了工程菌的产量和CR1-SCR15-18蛋白的表达水平。     

重组人血管内皮细胞生长因子工程菌高密度发酵工艺研究

目的 建立人血管内皮细胞生长因子(BL21/pET-24a/hVEGF₁₂₁)工程菌的高密度发酵工艺。方法 采用发酵罐发酵,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如培养基、诱导时间及补料进行优化。结果 采用M9复合培养基、活化至对数生长期时诱导4 h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,可使菌体量提高至68 g/L,rhVEGF₁₂₁的表达量达菌体蛋白总量的23%。结论 该发酵工艺提高了工程菌的产量和rhVEGF₁₂₁的表达水平。     

重组人黑色素瘤抗原MAGE3/HSP70融合蛋白工程菌的高密度发酵及其免疫学活性

目的:实现重组人黑色素瘤抗原MAGE3/HSP70融合蛋白工程菌的高密度发酵,并测定MAGE3/HSP70融合蛋白在体内的抗肿瘤免疫效应. 方法:利用自控发酵罐发酵,采用溶氧反馈,分批补料的方法对MAGE3/HSP70融合蛋白工程菌进行了高密度发酵,从菌体中纯化MAGE3/HSP70融合蛋白,并用所纯化的MAGE3/HSP70融合蛋白免疫小鼠,运用酶联免疫斑点法(ELISPOT)和细胞毒性杀伤实验(LDH)检测了融合蛋白激活机体细胞免疫反应的状况. 结果:高密度发酵取得成功,发酵菌中MAGE3/HSP70融合蛋白的表达量与摇瓶中的相当,摸索出发酵水平纯化MAGE3/HSP70融合蛋白工艺,ELISPOT和LDH显示MAGE3/HSP70可以激活机体免疫反应,并产生针对MAGE3的CTL,特异性杀伤表达MAGE3的肿瘤细胞. 结论:MAGE3/HSP70融合蛋白工程菌成功实现高密度发酵,MAGE3/HSP70融合蛋白可以有效激活机体免疫反应,产生针对特异性抗原MAGE3的CTL,免疫学活性良好,为新型抗肿瘤疫苗临床前研究奠定了良好基础.     

导向性人干扰素α2a工程菌的高密度发酵

目的:优化大肠杆菌表达导向性人干扰素α2a的中试发酵工艺,以获得工程菌的高密度发酵和目的蛋白的高表达. 方法:采用发酵罐发酵,对影响工程菌生长和目的蛋白表达的条件,如pH值、活化时间、诱导时间、溶氧范围及补料流加方式等进行优化. 结果:根据优化条件,连续三批重复发酵10 L工程菌,最终菌体密度均达A600 nm 25～30,菌体获得量均可达湿重50 g/L以上,目的蛋白表达量均为3.2×109 U/L以上. 结论:此发酵工艺具有周期短、产量高以及重复性稳定性好的特点,为下游纯化和进一步大规模生产奠定基础.     

重组SRH融合蛋白工程菌发酵的工艺研究

目的通过对影响表达SRH融合蛋白工程菌发酵的主要因素的研究,建立适宜SRH融合蛋白工程菌的发酵工艺。方法通过对发酵过程中的pH、溶氧调控、诱导温度、诱导时机及诱导时间进行优化建立SRH蛋白的发酵工艺,利用SDS-PAGE电泳分析表达情况。进一步利用离子交换和凝胶过滤层析对目的蛋白进行纯化,并对纯化后目的蛋白的溶栓活性和抗凝活性进行检测。结果优化后发酵条件为:发酵pH为7.0、溶氧为45%、菌体浓度达到OD600=8时开始诱导,诱导温度为41℃,诱导时间为4.5h。该发酵条件下得菌量为25g/L。SRH蛋白表达量为45%,并且90%以上为可溶性表达,纯化后蛋白纯度达95%以上,纯品SRH蛋白溶栓活性为1.80×104AU/mg,抗凝活性为100AU/mg。结论建立了SRH融合蛋白工程菌稳定的发酵工艺,该条件下SRH工程菌发酵蛋白表达量较高,多为可溶性表达,且杂蛋白较少,发酵产物具有生物学活性。     

HSPC016基因重组工程菌发酵研究

目的研究人毛乳头细胞HSPC016基因重组工程菌的发酵工艺.方法采用德国B.Brau公司C-10型5 L发酵罐批次发酵,通过对能影响工程菌生长和目的蛋白表达的条件如不同培养基、不同葡萄糖浓度、营养物补充、pH及溶氧调节等进行优化,确定合适的培养条件和发酵工艺.结果在优化条件下,菌体单产可达45 g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的18%.结论此发酵工艺可以提高人毛乳头细胞HSPC016/pET-28a( )基因重组工程菌的收获和目的蛋白表达.     

幽门螺杆菌多靶点疫苗工程菌BIB发酵及纯化工艺研究

目的初步建立重组幽门螺杆菌多靶点疫苗工程菌（BIB）的高密度发酵及其蛋白纯化工艺。方法以摇瓶发酵结果为基础,放大工艺至50L发酵罐中,对影响目的蛋白收率的因素如发酵培养基、工作种子接种量、诱导剂浓度、诱导起始时间、诱导持续时间及诱导剂添加方式等进行优化验证;并利用rBIB蛋白高等电点特性（pI=9.05）,在pH 7.0-7.5的磷酸盐缓冲液中目的蛋白带正电荷,采用阳离子交换层析进行纯化,对阳离子交换层析填料及纯化缓冲液的pH进行优化。结果经高密度发酵后BIB菌体产量为70g/L,蛋白表达量为32%;rBIB蛋白经阳离子交换层析纯化后其纯度为91.8%。结论该工艺的初步建立为深入研究rBIB蛋白性质及其规模化生产奠定了基础。     

重组幽门螺杆菌粘附素工程菌高密度发酵条件的研究

目的研究重组幽门螺杆菌粘附素基因工程菌的发酵工艺.方法采用德国B.Brau公司C-10型15 L发酵罐发酵,对影响工程菌生长和目的蛋白的表达条件进行了优化.结果在优化的条件下,15 L发酵罐发酵工程菌,菌体收获量可达48.2g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的31.5%.结论此发酵工艺可以提高工程菌收获和目的蛋白的表达.     

利用恒溶氧-补料分批技术高密度培养大肠杆菌生产重组肿瘤导向多肽LTL-TNF

目的　探讨重组肿瘤导向多肽 L TL - TNF工程菌的大规模培养与表达方法以获取重组 L TL TNF.方法　首先在试管和三角瓶中探讨工程菌的生长和表达规律 ,筛选其最适宿主菌、最佳培养及诱导表达条件 ,然后在 5 L 自控发酵罐中进行分批补料培养 .结果　保持培养过程中 30 %～ 40 %的溶解氧和限制性流加葡萄糖 ,工程菌 DH5 α/ p BV- L TL TNF在5 L 发酵罐中培养至终密度 A6 0 0 nm 40～ 5 0时 ,目的蛋白的表达最高 ,可达菌体总蛋白的 5 0 % ,L TL - TNF的含量达到5 .12 g· L- 1 ,发酵总时间在 12 h左右 .结论　确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺 ,为重组肿瘤导向多肽L TL TNF工程菌的工业化生产奠定了基础 .     

肾及膀胱肿瘤组织中MAGE基因及其产物的表达

目的:观察肿瘤特异性抗原MAGE-1、MAGE-3基因及MAGE-3抗原在肾及膀胱肿瘤组织中的表达状况,以评价这些基因或基因产物作为肾及膀胱肿瘤组织中的免疫学检测和免疫治疗、基因治疗分子标志物的可行性.方法:应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法分别测定39例肾及膀胱肿瘤患者癌组织与10例相应的癌旁组织MAGE-1、MAGE-3基因.应用免疫组织化学方法测定121例肾及膀胱肿瘤患者癌组织与10例相应的癌旁组织MAGE-3抗原表达.结果:39例肾及膀胱肿瘤中有23例MAGE-1 mRNA呈阳性表达(59.0%),有22例MAGE-3mRNA呈阳性表达(56.4%),其中肾细胞癌14例中MAGE-1 mRNA及MAGE-3 mRNA阳性表达均为8例.肾盂与膀胱移行细胞癌25例中MAGE-1 mRNA及MAGE-3 mRNA阳性表达分别为15例及14例.同时表达MAGE-1及MAGE-3的肾及膀胱肿瘤为18例(46.2%),所有10例癌旁组织均不表达MAGE-1及MAGE-3.免疫组织化学检测121例肾及膀胱肿瘤中56例MAGE-3抗原表达阳性(46.3%),包括肾细胞癌13例,MAGE-3抗原表达率为30.8%;肾盂与膀胱移行细胞癌108例,MAGE-3抗原表达率为48.1%.10例相应的癌旁组织MAGE-3抗原均不表达.根据Logistic回归检验分析MAGE-3抗原的表达与患者的临床分期及病理分级无明显关系.结论:MAGE基因有可能作为肾及膀胱恶性肿瘤组织免疫学检测的分子标志物,并且具有作为免疫治疗、基因治疗特异性靶位的潜在价值.     

黑素瘤抗原基因及其肿瘤疫苗研制进展

随着肿瘤发病率及病死率的不断上升,免疫治疗已成为继手术、化疗和放疗后另一种很有前途的治疗手段。其中肿瘤疫苗作为肿瘤的特异性主动免疫治疗,近年来的研究取得较多进展。黑素瘤相关抗原家族中部分抗原或多肽已经在多种类型的肿瘤疫苗进行免疫治疗的临床试验,并取得了较好的临床疗效评价。现主要针对黑素瘤抗原编码的基因的结构表达调控特点、肿瘤疫苗研制在肿瘤免疫治疗的作用以及应用前景进行综述。     

肿瘤特异性抗原MAGE、BAGE、GAGE在子宫内膜癌组织中表达的研究

研究MAGE、BAGE、GAGE基因在子宫内膜癌组织及正常子宫内膜组织中的表达,并探讨其肿瘤特异性抗原作为子宫内膜癌免疫治疗特异性靶位的可能性。方法：采用逆转录－聚合酶联反应（RT PCR）技术,检测35例子宫内膜癌组织和15例正常子宫内膜组织中MAGE 1、MAGE 3、BAGE和GAGE1 2基因的表达情况,以β actin作内参照。结果：35例子宫内膜癌组织中,MAGE 1、MAGE 3、BAGE、GAGE1 2表达阳性率分别为46％（16/35）、49％（17/35）、20％（7/35）和26％（9/35）,有77％的标本至少表达其中一种基因。15例正常子宫内膜组织中MAGE 1、MAGE 3、BAGE、GAGE1 2基因表达均为阴性。结论：肿瘤特异性抗原MAGE、BAGE、GAGE基因在子宫内膜癌中有较高的表达,MAGE 1、MAGE 3、BAGE基因的表达与子宫内膜癌的病理分期及分级无相关性,GAGE1 2与子宫内膜癌的分期无关,与分级有关。其可作为子宫内膜癌患者免疫治疗的特异性靶点。     

人MAGE-12基因的克隆与序列分析

目的克隆人MAGE-12基因并测序。方法从人肺癌组织中提取mRNA,用RT—PCR从中扩增出MAGE-12基因片段,对其进行PvuⅡ酶切鉴定;将扩增片段克隆于pGEM—Teasy载体中,转化JM109菌;进行蓝白筛选后,运用pGEM Teasy质粒的TT／SP6作为引物对重组子鉴定,并进行DNA测序。结果PCR扩增得到944bp的基因片段,经PvuⅡ酶切初步证实为MAGE-12基因;阳性克隆经筛选鉴定连接有目的基因;目的基因测序结果与GenBank比较,结果完全相同,表明靶基因成功插入pGEM—Teasy。结论成功克隆MAGE-12基因,为MAGE-12用于肿瘤的生物治疗做出准备工作。     

MAGE基因mRNA在非小细胞肺癌中的表达

目的：检测MAGE-1、-2、-3、-4基因mRNA在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达情况。方法：采用逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)方法对28例NSCLC患者的肺癌组织进行MAGE-1、2、-3．-4mRNA表达的检测。结果：28例肺癌标本中MAGE-1、-2、-3、-4的阳性表达率分别为35．7％(10／28)、42．9％(12／28)、53．6％(15／28)、35．7％(10／28);4种基因至少有一种表达的几率是89.3％(25／28);两种或两种以上同时表达几率是57．1％(16／28)。非肺癌患者肺组织4种MAGE基因表达均为0％。结论：非小细胞肺癌中MAGE-1、-2、-3、-4基因高表达,非肺癌肺组织无表达．提示MAGE基因可用于肺癌的主动免疫治疗。     

人肝癌细胞中一个MAGE抗原表位的获得及mRNA水平分析

0　引言　寻找和鉴定肿瘤抗原肽是肿瘤免疫研究中的重要任务 .人细胞毒性 T淋巴细胞 (CTL)可通过特异性识别与人类 HL A分子结合的肿瘤抗原决定簇而介导肿瘤抑制 ,用这些肽支撑的疫苗可以预防或治疗肿瘤 [1 ] .寻找和鉴定肝癌细胞表面表达的抗原肽对肝癌治疗有重要意义 .目前这方面报道很少 .本实验用细胞膜温和酸洗、液质联用技术分析了人肝癌细胞系 HHCC细胞膜表面表达的抗原肽 .并用 RT- PCR的方法在 m RNA水平上分析了该抗原肽编码基因的表达1　材料和方法1.1　材料　人肝癌细胞株 HHCC购于上海动物细胞所 .反相 C18柱为 Nobe…     

卵巢癌组织及细胞株中肿瘤特异性抗原MAGE、GAGE、BAGE基因表达的研究

目的：观察卵巢上皮性癌组织及细胞株中肿瘤特异性抗原MAGE、BAGE、GAGE 基因的表达,以探讨基因表达与诊断、治疗及预后的关系,评价基因产物作为卵巢癌标志物以及卵巢癌免疫治疗靶位的可行性。方法：采用 RT PCR分析10例正常卵巢、20例卵巢良性肿瘤、47例卵巢上皮性癌组织及3种卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、COC1中MAGE-1、MAGE-3、GAGE-1/2及BAGE基因mRNA水平的表达。结果：正常卵巢组织中MAGE、GAGE、BAGE基因无表达,良性肿瘤中仅有MAGE-1基因表达,阳性率为15％（3/20）。卵巢癌组织MAGE-1、MAGE-3的表达率较高,分别为51.1％（25/47）、34％（16/47）,GAGE-1/2及BAGE基因在卵巢癌组织中的表达率分别为25.5％（12/47）和14.9％（7/47）。卵巢癌转移灶仅有MAGE-1、BAGE基因表达,阳性表达率分别为28.6％（2/7）、14.3％（1/7）。浆液性囊腺癌MAGE-1、MAGE-3基因阳性表达率明显高于其它类型卵巢恶性肿瘤(P＜0.05)。结论：肿瘤特异性抗原MAGE、GAGE、BAGE基因在卵巢癌中有较高表达,其表达与有无淋巴结转移无关,MAGE-1、MAGE-3基因的阳性表达与肿瘤分化程度及临床分期密切相关,伴有腹水的卵巢癌患者BAGE表达的阳性率较高。卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、COC1的表达谱不尽相同,但至少有一种基因表达,其可作为卵巢癌免疫治疗的特异性靶点。     

RNA干扰介导的MAGE3基因表达沉默对肺癌细胞定植和转移的影响

目的构建针对人MAGE3基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体,观察RNA干扰介导的MAGE3基因表达默寂对肺癌细胞定植和转移的影响.方法设计MAGE3靶向的发夹状siRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSUPERneoGFP载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人肺癌细胞NCI-H446,采用RT-PCR和Western印迹检测MAGE3基因mRNA和蛋白表达水平的变化.用软琼脂克隆形成实验和细胞体外侵袭实验,观察对肿瘤形成能力和侵袭力的影响.结果把针对MAGE3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pSUPERneoGFP载体,经过酶切鉴定与测序,结果正确;RT-PCR和Western印迹检测显示, MAGE3基因的表达水平明显降低;转染siRNA表达载体组的肺癌细胞在软琼脂中形成克隆数和穿透Matrigel的细胞数都显著下降,与未转染和转染空载体组比较差异有显著性（P﹤0.05）.结论成功构建了针对MAGE3基因的siRNA载体, RNA干扰介导的MAGE3基因表达沉寂可有效降低肺癌细胞定植和转移.     

黑色素瘤抗原基因和脆性组氨酸三联体基因在诊断肺癌淋巴结微转移的应用

目的检测FHIT和MAGE-1、-2、-3、-4基因mRNA在非小细胞肺癌(NSCLC)淋巴结中的表达情况。方法采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法检测53例患者的111组淋巴结脆性组氨酸三联体基因(fragilehistidinetriad,FHIT)和MAGE-1、-2、-3、4mRNA的表达。结果应用RTPCR技术检测MAGE和FHIT基因mRNA表达在NSCLC淋巴结微转移阳性率分别为41.4%(46111)和35.1%(39111),差异无显著性(P>0.05)。非肺癌患者淋巴结四种MAGE和FHIT基因表达均为0。应用常规病理检查和应用RTPCR技术检测MAGE和FHIT基因在淋巴结微转移阳性率分别为27.9%(31111)和44.1%(49111),差异有显著性(P<0.05)。结论MAGE基因是应用RTPCR法检测非小细胞肺癌淋巴结微转移的较好的分子标志物,与FHIT基因联合检测可能有助于早期诊断肺癌淋巴结微转移。