弓形虫微线体蛋白1部分基因原核表达重组质粒pWR450-1-MIC1的构建、鉴定及测序

目的：构建弓形虫ZS2分离株pWR450-1-MIC1原核表达重组质粒，为进一步表达及免疫做准备。方法：用PCGENE软件分析MIC1基因可能的TB抗原表位，自行设计引物，用聚合酶链反应（PCR）技术从弓形虫ZS2分离株的基因组DNA中扩增编码微线体蛋白1（MCC1）的基因片段，经酶切，连接，重组入pWR450-1原核表达载体，再经含氨苄培养基筛选，酶切，PCR鉴定和测序。结果：从ZS2分离株基因组DNA中扩增出特异的MIC1基因片段，克隆成功pWR450-1－MIC1重组质粒，测序表明MIC1这部分基因与RH株相应碱基序列完全一致。高度保守，为下一步表达及免疫奠定基础。     

尤文肉瘤EWS-FLI1基因原核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建尤文肉瘤EWS-FLI1基因原核表达质粒.方法:从人尤文肉瘤A673细胞中提取总RNA,以RT-PCR法扩增EWS-FLI1基因序列,目的基因两侧引入Sac Ⅰ和HindⅢ酶切位点,克隆至pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆作PCR鉴定、酶切鉴定及测序鉴定.再将EWS-FLI1基因亚克隆至原核表达载体pQE30中,构建重组原核表达质粒pQE30-EWS-FLI1,酶切及测序鉴定.所构建的重组质粒转化JM109,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳后转印到NC膜上,进行Western blot鉴定.结果:PCR结果显示扩增片段大小约为1.5 kb,双酶切鉴定目的基因片段大小约为1.5 kb,阳性克隆测序结果显示目的基因序列与预期相同.所构建重组质粒在大肠杆菌中表达出与预期大小相符的54 kD蛋白,经鉴定系EWS-FLI1蛋白.结论:成功构建了pQE30-EWS-FLI1,并进行了原核表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

结核分支杆菌抗原85B真核表达质粒的构建

目的:构建结核分支杆菌分泌性抗原85B的真核重组表达质粒。方法:设计85B的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从含85B基因质粒DNA中扩增85B基因片段,克隆至pMD18-T载体,经测序分析后,亚克隆至真核表达载体pVAX1,PCR和双酶切鉴定阳性菌株。结果:PCR扩增获得85B的基因片段,测序获得的正确片段被亚克隆至真核表达质粒pVAX1构建真核重组表达质粒pVAX1-85B。结论:成功构建了85B的真核重组表达质粒pVAX1-85B。     

靶向克隆法构建NY-ESO-1基因的原核表达载体

目的:利用PCR产物靶向克隆法构建人癌-睾丸抗原NY-ESO-1的原核表达载体。方法:从人新鲜的食管癌组织中提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增NY-ES0-1基因3′端的340bp片段,采用靶向克隆法将目的基因插入到原核表达载体pET-15b中,得到重组表达质粒pET-15b-NY-ESO-1,经过筛选,挑选出阳性克隆进行XhoⅠ和BamHⅠ双酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物核苷酸序列分析等,鉴定所构建的原核表达载体。结果:扩增得到NY-ESO-1基因片段,经测序证实与GenBank公布的序列一致,重组的质粒经过PCR,酶切鉴定获得了一个大小为340bp的特征性片段,证明重组质粒中已成功的插入了目的基因NY-ESO-1。结论:靶向克隆法可快速、高效地构建人NY-ESO-1基因的原核表达载体,为制备pET-15b-NY-ESO-1融合蛋白奠定了基础。     

肝素酶反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建肝素酶（heparanase，Hpa）反义RNA真核表达载体。方法 提取胃癌组织总RNA，按照GenBank中检索出的Hpa基因cDNA序列，设计并合成反义Hpa基因片段的引物，进行RT-PCR，并将扩增产物克隆至DGEMT载体，PCR鉴定及测序证实后，双酶切pGEM-T-antiHpa重组体回收目的片段，再将其反向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3．1中，并对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析。结果 PCR扩增出的反义片段与预期长度相符。构建的Hpa反义RNA表达质粒pcDNA3．1-antiHpa，分别作PCR及双酶切（BamHⅠ和HindⅢ）鉴定，证实其中有目的片段完整插入，插入片段测序结果与反义Hpa序列设计完全一致。结论 成功构建了Hpa反义RNA真核表达载体pcDNA3．1-antiHpa，此结果为进一步研究Hpa蛋白分子的生物学功能和以Hpa为靶点的恶性肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。     

A型流感病毒核蛋白原核表达载体的构建与表达

目的:构建A型流感病毒核蛋白(NP)的原核表达质粒,分析其在大肠杆菌中的表达状况.方法:采用逆转录聚合酶链式反应技术从A型流感病毒基因组中扩增出编码核蛋白的基因片段,克隆至pGEM-T Easy载体,PCR筛选阳性克隆并测序.经酶切后将目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL2(CDE3),PCR和酶切鉴定转化菌落.将阳性菌落经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析目的蛋白的表达.结果:RT-PCR扩增出NP基因序列,将其亚克隆至表达载体pGEX-4T-1构建成重组表达质粒,并在BL2(CDE3)中表达了NP融合蛋白.结论:成功构建A型流感病毒NP的重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达了NP融合蛋白.     

LMP-3功能区真核表达质粒的构建

目的:构建LMP-3功能区真核表达重组质粒.方法:设计合成LMP-3活性区引物,应用PCR方法,扩增其基因片段,亚克隆至真核表达质粒pEGFP-N1,最终构建重组表达质粒pEGFP-N1-LMP-3,同时进行酶切鉴定和测序.结果:PCR扩增LMP-3基因序列正确,构建的重组表达质粒pEGFP-N1-LMP-3经EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切及测序鉴定正确.结论:成功获得真核表达重组质粒pEGFP-N1-LMP-3,为进一步研究其成骨功能奠定基础.     

人类p27kip1基因正、反义真核表达质粒的构建

目的：克隆人类p27^kip1基因，构建其正、反义真核表达质粒。方法：采用逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)技术，从人类伯基特淋巴瘤细胞株Raji中扩增出人类p27^kip1 cDNA全长序列，通过DNA重组技术将该基因重组于pcDNA3．1真核表达载体上，构建p27^kip1正、反义表达质粒。通过酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组表达质粒进行鉴定。结果：通过酶切鉴定及测序分析证实，本实验构建的重组表达质粒目的基因片段为人类p27^kip1 cDNA。结论：本实验成功地克隆了人类p27kipl基因并构建了其正、反义真核表达质粒，为进一步研究p27^kip1在淋巴瘤发生中的意义奠定了基础。     

人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因真核表达载体的构建

目的构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因(sTNFR1)的真核表达载体,为进一步研究打下基础。方法以Hela细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增人sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pCDNA3.1(-)重组质粒亚克隆,并用酶切分析和序列测定进行鉴定。结果经酶切鉴定和测序证实,人sTNFR1基因被正确克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-)。结论真核表达质粒pCDNA3.1(-)-sTNFR1的构建为今后的研究打下了基础。     

大鼠寡霉素敏感相关蛋白的克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)的基因并构建pEGFP-N1真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从大鼠脑组织中扩增出OSCP基因,将其插入到pTA2克隆载体中,测序鉴定后亚克隆至pEGFP-N1真核表达载体并进行酶切、测序鉴定。结果:PCR扩增出约为700 bp的基因片段;重组克隆载体pTA2-OSCP经测序鉴定证明pTA2载体中插入了目的基因片段;重组表达载体pEGFP-N1-OSCP经酶切、测序鉴定证明其构建成功。结论:OSCP基因克隆和真核表达载体构建成功,这为下一步开展该基因的重组蛋白表达及功能研究奠定了基础。     

表达载体sHLA-A2-IgG1-Fc的构建与鉴定

目的构建表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2-IgGl-Fc,为进一步真核表达可溶性HLA-A2-IgG1-Fc蛋白奠定基础。方法从T2细胞中提取总RNA,借助RT-PCR技术扩增包括信号肽的可溶性HLA-A2的cDNA序列并把其插入真核表达载体pcDNA3.0,然后经酶切和测序法鉴定;用PCR的方法从含IgG1-Fc基因的PIG质粒中扩增目的基因IgG1-Fc段,然后经酶切后插入前面构建好的表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2中,最后经酶切和测序法鉴定。结果经酶切鉴定及测序分析,证实已将目的基因HLA-A2和IgG1-Fc片段插入载体pcDNA3.0。结论本研究成功构建表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2-IgG1-Fc。     

弓形虫GRA1基因的克隆与原核表达

目的:克隆并构建PET-28a-GRA1重组表达载体,转化人大肠杆菌E.coli BL21,诱导表达并鉴定,为进一步研究GRA1的生物学特性和免疫保护作用奠定实验基础.方法:根据GenBank中编码GRA1的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术扩增GRA1基因,插入原核表达载体PET-28a中,构建重组表达质...     

甲型流感病毒FM1非结构蛋白(NS1)在大肠杆菌表达及其ELISA检测方法建立

目的:构建流感病毒FM1非结构蛋白NS1全长基因表达载体在大肠杆菌(E.coli)中表达,并将表达蛋白用于病毒感染和疫苗免疫小鼠的血清检测.方法:提取流感病毒鸡胚尿囊液RNA,RT-PCR扩增NS1全长基因,克隆到pET28a,转化E.coliBL21感受态细胞,经酶切鉴定及序列分析,筛选出阳性重组质粒pET28-NS1.异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,表达蛋白在变性条件下经镍柱亲和层析纯化,并用Western blot法检测其抗原活性.以纯化的NS1蛋白为抗原建立了检测NS1抗体的ELISA(NS1-ELISA)方法分别对7、15和30天灭活疫苗免疫和病毒感染小鼠血清进行检测.统计分析各组吸光度(A)差异,并以灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值等指标对NS1-ELISA进行方法学评价.结果:重组质粒经PCR及酶切鉴定为阳性,核酸序列分析正确.SDS-PAGE和Western blot结果显示表达重组蛋白分子质量约为26 ku.NS1-ELISA法在第15～30天,感染组血清吸光度明显高于疫苗免疫组.结论:成功获得了NSl重组基因表达蛋白,建立的NS1-ELISA法可用于病毒感染和疫苗免疫血清的鉴别检测.     

pSIREN/PB1 siRNA重组质粒抗甲型流感病毒研究

目的研究重组质粒pSIREN/PB1在鸡胚尿囊液中干扰甲型流感病毒复制的效果。方法设计1对编码PB1siRNA的寡核苷酸序列,经退火互补形成双链,再克隆至带有U6启动子的RNAi ready pSIREN-shuttle线性化载体,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,双酶切和测序鉴定重组质粒pSIREN/PB1。大量提取重组质粒pSIREN/PB1,用脂质体进行包裹后,按每只鸡胚90μg质粒量接种于10日龄鸡胚尿囊腔,4血凝单位甲型流感病毒液分别于质粒接种后0h、24h、48h接种于鸡胚尿囊腔,流感病毒接种48h后收集无色澄清尿囊液进行血凝实验检测流感病毒效价。结果甲型流感病毒PB1基因的siRNA编码序列成功克隆至pSIREN质粒载体。经酶切和测序分析,重组质粒pSIREN/PB1中的siRNA编码序列均完全正确。将脂质体包裹的pSIREN/PB1质粒和病毒液同时注射入鸡胚尿囊腔后,收获的甲型流感病毒效价最低。结论成功构建了表达甲型流感病毒PB1siRNA的重组质粒pSIREN/PB1,并且它可以抑制鸡胚中流感病毒复制。此研究进一步证实了RNA干扰对流感病毒复制的抑制作用,为开发流感基因防治新方法奠定了基础。     

hISO基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的: 构建原核表达载体pET-28a(+)-hISO,探讨其融合蛋白在大肠杆菌中的稳定表达情况,为后续实验研究奠定基础。 方法: 以Caco-2细胞的总RNA为模版,采用RT-PCR方法扩增出大小为1770bp的人异麦芽糖酶(hISO)基因片段,将其插入到pET-28a(+)中,构建重组载体pET-28a(+)-hISO。经PCR、酶切及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白,利用SDS-PAGE电泳、Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定。 结果: 经PCR、酶切及测序鉴定后,重组质粒pET-28a(+)-hISO构建正确,表达重组蛋白相对分子质量为68860,将融合蛋白进行纯化,经40和60mmol·L^-1咪唑缓冲液洗脱后能够得到浓度和纯度相对较高的蛋白。 结论: 成功地构建了hISO基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得了融合蛋白表达。     

mompS-linker-flaA融合基因原核表达载体的构建及诱导表达

目的在嗜肺军团菌主要外膜蛋白S基因(mompS)和鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)基因间加入一段柔性链接头(Linker),以构建mompS-Linker-flaA融合表达载体,并使其在大肠杆菌中表达。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR分别扩增获得嗜肺军团菌mompS基因和flaA基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a( )定向重组,构建含mompS-Linker-flaA基因的重组质粒pET-LpSLF,经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-MOMPS-Linker-FlaA融合蛋白,用SDS-PAGE及Westernblotting进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了嗜肺军团菌906bp的mompS及1440bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-LpSLF,SDS-PAGE及Westernblot分析显示重组质粒pET-LpSLF在原核系统中得到了表达。结论嗜肺军团菌mompS-Linker-flaA基因在大肠杆菌中得到了表达,为进一步从分子水平研究其免疫原性、免疫保护性及其在临床诊断上的应用价值提供研究基础。     

PstS1-卡介苗重组疫苗的构建

目的：构建结核分支杆菌分泌蛋白磷酸盐特异转运系统1（PstS1）的重组卡介苗。方法:以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板,通过PCR扩增获得PstS1基因序列;将PstS1基因与大肠杆菌-卡介苗穿梭表达质粒PMD31重组,得到S-PMD31重组质粒,对S-PMD31重组质粒进行HindⅢ、BanHⅠ双酶切及测序鉴定,转化大肠杆菌,用IPTG对工程菌株进行诱导表达,并通过电穿孔技术将S-PMD31重组质粒导入卡介苗中构建重组卡介苗。结果：用引物P1、P2对结核分枝杆菌H37R_V基因组进行PCR扩增获得长为1 100 bp的PstS1基因序列,S-PMD31重组质粒的HindⅢ、BanHⅠ双酶切及测序鉴定证实：PstS1基因正确插入载体PMD31中,并能在大肠杆菌中诱导表达。通过质粒提取及PCR扩增表明重组质粒正确导入卡介苗中。结论：成功地构建了PstS1重组卡介苗,预期能提高卡介苗的免疫原性和保护力。     

人分化抑制因子Id-3基因在大肠埃希菌中的高效表达及其多克隆抗体的制备

目的 在大肠杆菌中表达人Id-3与谷胱甘肽-S转移酶(GST)的融合蛋白,并制备抗人ld-3的多克隆抗体.方法 从乳腺癌组织中提取总RNA,用RT-PCR扩增出Id-3的编码序列,克隆至表达载体pGEX-6P-1中,重组质粒经PCR、酶切、测序鉴定后,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-Id-3融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物,Western-Blot检测重组抗原的免疫原性.通过亲和层析法纯化表达的GST-Id-3融合蛋白,并以此为抗原制备多克隆抗体.结果 经PCR、酶切、测序鉴定证明,Id-3基因已正确克隆至pGEX-6P-1中,经IPTG诱导后,表达出相对分子量为39 000 GST-Id-3融合蛋白.ELISA和琼扩试验鉴定所制备的多克隆抗体可以与GST-Id-3融合蛋白发生特异性反应.结论 Id-3基因在大肠杆菌中的成功表达及制备的多克隆抗体,为检测Id-3及其在各种组织中的表达水平提供了一种检测途径,也为分析Id-3分子结构、抗原表住和生物学功能奠定了基础.     

人嗜铬粒蛋白A N-端片段Vasostatin-1(CGA1-76)的原核表达

目的制备编码人Vasostatin-1基因片段,利用大肠杆菌表达重组Vasostatin-1蛋白。方法根据人Vasostatin-1基因序列,设计、合成3对PCR引物,利用PCR合成法制备编码Vasostatin-1的DNA。将Vasostatin-1基因定向插入原核表达载体pGEX-4T-1,行酶切和DNA测序鉴定,并将构建的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。用IPTG诱导BL21(DE3)中导入的Vasostatin-1基因的表达,行SDS-PAGE分析。用GSTrap亲合柱纯化重组Vasostatin-1蛋白。结果用PCR合成法制备了228bp的Vasostatin-1基因片段,并成功构建了重组质粒pGEX-4T-Vasostatin-1,DNA测序显示Vasostatin-1DNA序列和插入位点正确。经IPTG诱导,特异表达出以包涵体形式存在36kDa的重组Vasostatin-1蛋白。结论制备、克隆了人Vasostatin-1基因片段,并在大肠杆菌中表达出重组Vasostatin-1蛋白。