血清双向电泳样品制备技术的优化及应用

1 材料和方法 取2.5 μL血清(约200 μg)与含SDS和DTT的缓冲液混合,在95℃下加热5 min,待冷却后用上样缓冲液(含7 mol/L 尿素,2 mol/L 硫脲,40 mol/L CHAPS,65 mmol/L DTT和5 mol/L IPG buffer)稀释至350 μL;取2.5 μL血清直接与347.5 μL的上样缓冲液混合.     

人结肠腺癌Lovo细胞系蛋白质双向凝胶电泳技术的建立及其优化

目的优化人结肠癌Lovo细胞系的蛋白质样品制备方法,建立人结肠癌Lovo细胞系的双向凝胶电泳(2-DE)图谱.方法分别用磷酸盐缓冲液和等渗蔗糖溶液冲洗细胞,胰酶酶解后裂解和皿上直接裂解的方法提取所培养Lovo细胞的总蛋白质,利用固相pH梯度双向凝胶电泳技术进行分离,凝胶经银染显色后,用Melanie 4软件分析2-DE图谱.结果以等渗蔗糖缓冲液冲洗细胞并经皿上直接裂解的方法所提取Lovo细胞总蛋白质进行双向电泳,可获得分辨率高、重复性好的人结肠癌Lovo细胞系2-DE图谱.结论以等渗蔗糖溶液冲洗细胞结合皿上直接裂解是一种较好的细胞蛋白质双向电泳样品制备方法,初步建立了分辨率较高且重复性好的人结肠癌Lovo细胞系蛋白质双向凝胶电泳图谱.     

血清蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立

目的：建立血清蛋白质组双向凝胶电泳（2-DE）技术。方法：对血清蛋白质2-DE的各种条件进行调整、优化。结果：建立了稳定的2-DE技术。结论：已建立的血清蛋白质2-DE技术，将为进一步开展疾病的血清蛋白质组学研究奠定基础。     

血清蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立

目的建立血清蛋白质组双向凝胶电泳(2-DE)技术.方法对血清蛋白质2-DE的各种条件进行调整、优化.结果建立了稳定的2-DE技术.结论已建立的血清蛋白质2-DE技术,将为进一步开展疾病的血清蛋白质组学研究奠定基础.     

结核病患者和正常人血清蛋白质双向凝胶电泳差异比较

目的 初步探讨结核病患者与正常人之间血清蛋白质的差异,以期筛选出新的结核病实验诊断标志物。 方法 对10例菌阳肺结核（+组）、10例菌阴肺结核（－组）、10例肺外结核（肺外组）及10例正常人（正常组）分组混合血清应用17cm pH4-7 IPG胶条进行双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）,每组平行电泳3块胶条。电泳结束后对2-DE胶条进行考马斯亮蓝染色,染色后用Umax powerlook2000扫描仪以投射方式、300dpi分辨率扫描获取2-DE图谱,然后用2-DE分析软件ImageMaster 2D Platium5.0进行分析。 结果 在正常组、＋组、-组、肺外组中,分别平均可以检测到310±64、307±33、296±54、267±23个清晰可见的蛋白质点。正常组与＋组、-组、肺外组的匹配率分别为(74±2)%、(76±2)%和(68±5)%。通过对4组2-DE图谱比较,＋组与正常组间有21个差异蛋白质点（其中9个上调）,-组与正常组间有18个差异蛋白质点（其中8个上调）,肺外组与正常组间有24个差异蛋白质点（其中7个上调）。将＋组、-组、肺外组合并为结核组与正常组比较有3个差异蛋白质点（其中2个上调）。 结论 结核病患者和正常人血清蛋白质存在差异,有望从血清中筛选出新的结核病实验诊断标志物。本研究建立了两者间血清蛋白质组差异蛋白质的初步模型,但有待进一步验证并进行差异蛋白质鉴定。     

聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质快速染色

聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳 ,这种凝胶由丙烯酰胺 ( acrylamide,Acr)和交联剂 N,N-叉基 (亚甲基 )双丙烯胺 ( N,N- methy/ ene- bis- acrylamide,Bis)聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗等特性。在盘状电泳过程中有 3种物理效应 :1样品的浓缩效应 ;2凝胶的分子筛效应 ;3一般电泳分离的电荷效应。由于这 3种物理效应 ,使样品分离效果好 ,分辨率高。如人血清用醋酸纤维膜电泳 ( p H8.6)可分成 5～ 7个成分 ,而用…     

结直肠癌患者与正常人血清蛋白质双向凝胶电泳差异分析

目的 利用血清蛋白质组学技术分析结直肠癌患者与正常人血清蛋白质表达谱的差异,寻找结直肠癌相关血清标志物.方法 分别采用pH3～10和pH4～7的IPG干胶条,在优化的实验条件基础之上,利用双向凝胶电泳(2-DE)分离结直肠癌患者和正常人血清蛋白质,硝酸银染色,获取图像后PDQuest软件分析差异表达的血清蛋白质点.结果 采用pH值3～10的胶条分离血清蛋白共有17个,结直肠癌组表达量上调的蛋白质点7个,表达量下调的蛋白质点7个.采用pH值4～7的胶条分离血清蛋白共有13个,结直肠癌组表达量上调的蛋白质点8个,表达量下调的蛋白质点5个.结论 所筛选的差异蛋白质点为进一步结直肠癌相关血清蛋白质的鉴定和其他肿瘤血清蛋白质学研究奠定了良好的基础.     

食管鳞癌转移淋巴结蛋白质双向凝胶电泳图谱差异分析

目的 分析食管鳞癌转移淋巴结与正常淋巴结组织蛋白质表达差异.方法 采用双向凝胶电泳(2-DE)技术和计算机辅助的图像分析方法,对食管鳞癌转移淋巴结与正常淋巴结组织蛋白质进行分离和比较分析.结果 获得了背景清晰、分辨率和重复性较好的双向凝胶电泳图谱,比较分析显示23个蛋白点的表达量存在明显差异,其中新增蛋白点4个,缺失1个,14个蛋白点表达发生明显上调,4个蛋白点表达发生明显下调.结论 食管鳞癌转移淋巴结与正常淋巴结蛋白质表达存在明显差异,可能与食管鳞癌淋巴结转移机制有关.     

人尿液蛋白质的超滤离心制备及其双向凝胶电泳分析

目的：优化尿液蛋白质制备方法以获得蛋白点数多且分辨率高的尿液双向凝胶电泳（two dimensional gel electrophore－sis,２-DE）图谱,为尿液蛋白质组学研究提供技术支撑。方法：首先,使用6种不同方法制备尿液蛋白质后比较蛋白质得率,并分析这些方法的２-DE谱蛋白点数及３次重复匹配率,进行统计分析计算P值;最后利用2种固相pH梯度（immobilized pH gra－dient,IPG）胶条和不同的聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）胶浓度进行2-DE分析,比较所得蛋白图谱的蛋白点数及分辨率。结果：与其他方法相比,超滤离心法制备尿液蛋白能获得更多的蛋白总量[（791±17） μg,P＝0.00０],得到的电泳图谱蛋白点数也更多[（724±29）个,P＝0.00０];利用pH 3~10 IPG胶条和12.5% PAGE分离有利于尿液蛋白质的整体分析,特别是酸性和碱性蛋白质点信息,而pH 4~7 IPG胶条能使等电点为4~7蛋白质的2-DE谱分辨率更高（P<0.05）。结论：建立了与2-DE兼容的尿液蛋白质制备方法,获得了更为全面的尿液蛋白点信息,为临床生理和疾病的尿液蛋白质组学研究奠定了基础。     

鼻咽癌低分化细胞系CNE-2双向凝胶电泳图谱的建立

目的：建立人鼻咽癌低分化细胞系CNE-2双向凝胶电泳图谱,初步分析其蛋白质表达情况。方法：采用双向凝胶电泳（2-DE）分离人鼻咽癌低分化细胞系CNE-2总蛋白,银染显色,Image Master图象分析系统分析,从胶中选取分离较好的蛋白质点,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析获取肽质量指纹图谱（PMF）,Mascot软件搜索MSDB和SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质。结果：获得重复性和分辨率较好的CNE-2双向凝胶电泳图谱;质谱分析了78个蛋白质点,获取77张肽质量指纹图谱,通过查询数据库鉴定了48个蛋白质。结论：建立了人鼻咽癌低分化细胞系CNE-2双向凝胶电泳图谱,并应用质谱技术鉴定了部分蛋白质点,为人鼻咽癌蛋白质组数据库的建立提供了有意义的数据。     

腹水前期处理满足双向凝胶电泳技术的探索

目的用双向凝胶电泳方法分析不同腹水中的蛋白质谱。方法用防止腹水蛋白质降解、去细胞成分、浓缩、去脂、脱盐及去干扰大的白蛋白等腹水的前期处理以满足双向凝胶电泳的条件。结果经2次离心可基本去除腹水细胞成分;用分子量5000的膜包超滤浓缩腹水,可消减腹水蛋白质的浓度差异;去白蛋白前,0.3mg上样量双向电泳图中可检出(421±20)个蛋白质点,去白蛋白后可检出(483±24)个蛋白质点。经上述腹水前期处理后得到较为清晰的双向凝胶电泳图谱。结论腹水前期处理能满足双向凝胶电泳技术的要求,已建立的腹水蛋白双向凝胶电泳技术将为进一步的腹水蛋白质成分研究奠定基础。     

血清双向凝胶电泳技术的建立和优化

目的建立起较好及较稳定的的血清双向凝胶电泳技术。方法对血清双向凝胶电泳中血清标本的收集、保存,血清高丰度蛋白的去除,电泳条件,上样量,IPG干胶条的选择及缓冲液的配制等多种条件和技术方法进行调整和优化。结果建立了较稳定和较好重复性的血清双向凝胶电泳技术,分辨率得到一定的提高,有效分离的蛋白质点明显增多,许多低丰度蛋白被分离出来。结论通过不断的摸索和验证,可以建立起较好的血清双向凝胶电泳技术,为进一步的分析、鉴定和寻找与疾病相关的血清蛋白质奠定一定基础。     

DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳银染方法的选择

目的 比较4种聚丙烯酰胺凝胶银染方法,为初次使用者选择方法时提供参考。方法 用24 mer的引物作为上样样本,分别采用氨水法、低浓度硝酸银法、0.1%及0.2%硝酸银法染色。后2种配合不同的显色剂显色。结果 前2种未显色,0.1%及0.2%硝酸银可显色。结论 0.2%的硝酸银与氢氧化钠显色剂相结合具有最高的灵敏度;0.2%的硝酸银与碳酸钠显色剂相结合具有最佳的显像效果。     

肺癌组织蛋白质组双向凝胶电泳方法的建立和优化

目的建立和优化肺癌组织蛋白质组双向凝胶电泳(2-DE)技术,获取高分辨率、重复性好的蛋白质2-DE图谱。方法提取肺癌组织蛋白,以固相pH梯度胶条做第一向等电聚焦电泳,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)为第二向,在上述过程中分别对蛋白提取、等电聚焦电泳和凝胶染色进行控制和优化,利用ImageMaster 2Dplatinum 6.0分析软件获得二维凝胶图像。结果实验重复3次,共获15幅二维凝胶图像,平均蛋白质点数为1 137±57;随机选取1例标本的2幅图像,利用软件对2幅图像中蛋白点进行匹配,匹配率为90.4%。结论优化肺癌组织蛋白质组2-DE技术可获得高分辨率、重复性好的蛋白质2-DE图谱,为开展肺癌组织蛋白质组学研究打下基础。     

双向电泳中人血清蛋白样品不同处理方法的比较

目的针对人血清双向电泳流程中样品制备的不同方法,本研究进行了系统的比较和分析。方法采用丙酮沉淀法,三氯醋酸沉淀法,三氯醋酸/丙酮沉淀法,蛋白纯化试剂盒,去白蛋白及免疫球蛋白试剂盒预处理血清样品;双向电泳分离;硝酸银染色;软件分析所得蛋白质斑点。结果对丙酮沉淀法,三氯醋酸沉淀法,三氯醋酸/丙酮沉淀法,蛋白纯化试剂盒处理血清所得到的2 DE图谱统计分析,得到平均蛋白质点数分别为1?802±12,1?648±10,1?727±13,1?670±14;对去除白蛋白及免疫球蛋白血清所得到的双向电泳（2 DE）图谱与丙酮沉淀血清所得到的图谱进行统计,得到平均蛋白质点数分别为1?212±16,1?258±12,并对其中差异蛋白进行了质谱鉴定。结论结果表明不同血清沉淀方法对血清的双向电泳各有优劣;血清去除白蛋白及免疫球蛋白之后,可以提高一些低丰度蛋白的检出,但会导致部分蛋白的丢失。     

利用双向凝胶电泳和质谱技术进行前列腺癌差异蛋白质组学研究

目的 分离前列腺癌雄激素依赖型和非依赖型细胞系差异表达蛋白质,为进一步研究前列腺癌的蛋白组学打下基础. 方法 培养前列腺癌雄激素依赖型(LNCaP)和非依赖型(DU145)细胞系,分别提取两种细胞系的总蛋白,进行等电点聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,对所得胶图利用ImageMaster4.01软件进行分析,选取差异点进行质谱分析,对分析结果进行数据库检索. 结果 得到了分辨率和重复性均好的前列腺癌雄激素依赖型和非依赖型细胞系的双向凝胶电泳图谱,每块凝胶上平均蛋白质点数为816±15,通过分析得到3倍差异点41个,完全差异点10个.对完全差异点进行质谱分析和数据库检索得到与差异点相对应的3个蛋白质,其中第83号和175号为未命名蛋白质,第632号蛋白质是KIAA1283蛋白质,具有载脂蛋白功能. 结论 在前列腺癌激素依赖型和激素非依赖型细胞系中存在差异表达蛋白质,并可以利用双向凝胶电泳技术进行分离,为进一步研究前列腺癌的蛋白质组学和发病机制提供了线索.     

大鼠成骨细胞分泌组双向电泳样品制备方法的建立

目的:建立适用于体外培养大鼠成骨细胞分泌组的双向电泳样品制备方法,为进一步开展成骨细胞分泌组研究奠定基础.方法:分别采用透析法、透析-三氯乙酸(trichloractetic acid,TCA)-丙酮沉淀法和透析-丙酮沉淀法富集无血清培养液中的细胞分泌蛋白质,通过比较双向电泳的结果优选最佳的样品制备方法.结果:透析-丙酮沉淀法较为理想,蛋白丢失少、溶解性佳,所得双向电泳图谱清晰,分辨率高.结论:透析-丙酮沉淀法更适用于制备体外培养的大鼠成骨细胞分泌组的双向电泳样品,可以满足进一步研究的需要.