大鼠脑微血管内皮细胞的培养

血管内皮细胞在动脉粥样硬化的发病机制中发挥重要作用。本文通过胶原酶消化、密度梯度离心等技术建立一种程序简便、经济、稳定、获得细胞纯度较高的体外分离、长期培养大鼠脑微血管内皮细胞的方法。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的 建立稳定的大鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)体外培养模型,并对其生物学特性进行初步研究.方法 取Sprague-Dawley大鼠脑组织,通过匀浆、酶消化和梯度离心获得纯化的脑微血管段后,接种于涂布明胶的培养瓶进行原代培养;培养的细胞采用相差显微镜形态学观察、Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定;采用跨内皮电阻(transendothelial electrical resistance, TEER)检测单层细胞通透性;Cell Counting Kit-8(CCK-8)方法测定细胞生长曲线.结果 细胞从贴壁的脑微血管段周围长出,呈短梭形和多角形,区域性单层生长,5～7 d细胞融合,经Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学检测证实培养的细胞是血管内皮细胞,原代培养的脑微血管内皮细胞表现出很强的屏障特性,随着传代次数的增加脑微血管内皮细胞的跨内皮阻抗减弱.结论 提示该方法能成功进行纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞原代培养,原代培养的脑微血管内皮细胞是研究脑部微血管和血脑屏障的可靠技术手段.     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的探索一种简便可行的脑微血管内皮细胞(brainmicrovascularendothelialcells,BMECs)的培养方法,为研究BMECs在脑血管疾病中的重要作用提供技术支持.方法分离出生后1～4 d内的Wistar大鼠乳鼠大脑皮质,用植块法培养BMECs;用倒置显微镜观察BMECs的形态以及从皮质块细胞迁出的过程;通过形态学观察及第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光细胞化学法对培养细胞进行鉴定.结果大脑皮质块植块法培养的大鼠BMECs呈单层贴壁生长,细胞形态以长梭形、多角形、三角形、四边形为主,呈典型的"铺路石"样征象,第3代细胞经免疫荧光染色,第Ⅷ因子相关抗原呈阳性,阳性率达95%以上.结论植块法具有经济、简便、要求条件不高,可成功培养高纯度的脑微血管内皮细胞的优点.     

大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定

目的探讨大鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,为血管内皮细胞的研究打下基础。方法用胶原酶消化大鼠脑皮质制成细胞悬液再进行培养,用光镜及免疫组织化学检测进行鉴定。结果分离的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养5～7d左右可长成单层,光镜下为多角形或扁平梭形,呈"铺路石样"排列,第Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学测定阳性。结论该分离细胞培养法可培养出大鼠的脑微血管内皮细胞。     

大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定

目的:探讨大鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,为血管内皮细胞的研究打下基础.方法:用胶原酶消化大鼠脑皮质制成细胞悬液再进行培养;用光镜、电镜及免疫组化检测进行鉴定.结果:分离的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养一周左右可长成单层,光镜下为多角形或扁平梭形,呈"铺路石样"排列,透射电镜可见Weibel-Palade小体.第Ⅷ因子相关抗原免疫组化测定阳性.结论:该分离细胞培养法可培养出大鼠的脑微血管内皮细胞.     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的分离、培养原代脑微血管内皮细胞,建立体外血脑屏障模型。同时探索高纯度、活性好的脑微血管内皮细胞的分离培养方法。方法取3周大鼠大脑,分离皮质,经过匀浆、葡聚糖离心以及消化后,取纯度较高的脑微血管段种植于胶原蛋白包被过的塑料培养瓶中进行培养。显微镜观察及检测Ⅷ因子相关抗原。结果镜下细胞呈长梭形,7d左右细胞可融合,Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测为阳性,且阳性细胞占绝大部分。结论本实验成功分离大鼠脑微血管内皮细胞,并进行原代培养,为脑微血管内皮细胞的进一步研究提供了模型,也为构建更高级的大鼠体外血脑屏障奠定基础。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定

目的探讨大鼠脑微血管内皮细胞培养方法。方法 5～7 d龄SD大鼠脑皮质用胶原酶消化得到脑微血管段后,接种于培养瓶进行原代培养。培养的细胞采用倒置显微镜进行形态学观察,免疫荧光法鉴定Ⅷ因子相关抗原,MTT法测定细胞活力。结果倒置显微镜下细胞呈单层＂铺路石样＂排列的典型特征;Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测得阳性细胞率达95%;MTT法测定结果显示第120 h细胞活力最强。结论该培养方法能成功地分离并培养出纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞,对更深入地研究脑微血管内皮细胞的生物学特性及功能具有重要意义。     

同型半胱氨酸对大鼠脑微血管内皮细胞抑制的实验研究

目的通过培养的大鼠脑微血管内皮细胞(BMVEC),研究不同浓度的同型半胱氨酸(Hcy)对内皮细胞损伤的影响。方法将培养的BMVEC分成两大组,将其与不同浓度的Hcy(50、200μmol/L和1、2 mmol/L)和(或)无CuSO4(4μmol/L)共同培养18 h,分别利用噻唑蓝、细胞苏木精-伊红染色和流式细胞仪技术观察BMVEC细胞的生长及凋亡情况。结果BMVEC在CuSO4的协同下与不同浓度的Hcy培养18 h后,细胞活力A值呈现剂量依赖性的降低,超过1 mmol/L的Hcy对BMVEC已经形成了显著的抑制和毒性效应,滞留于G1期的细胞比例增加。结论高浓度的Hcy具有内皮细胞毒作用,可以抑制细胞的生长。     

HPLC法测定人血清中卡马西平及环氧化卡马西平的浓度

目的建立测定人血清中卡马西平和环氧化卡马西平浓度的高效液相色谱法。方法色谱柱为Dia-mond C18(200 mm×4.6 mm,5μm);流动相为:甲醇-水(65∶35)(0 min)→甲醇-水(55∶45)(10 min)→甲醇-水(55∶45)(12 min)→甲醇-水(65∶35)(18 min),流速1.0 mL.min-1,柱温25℃;检测波长215 nm。以艾司唑仑为内标。结果卡马西平和环氧化卡马西平的线性范围分别为1.08~21.60μg.mL-1(r=0.9958)和0.20~5.00μg.mL-1(r=0.9952);高、中、低浓度卡马西平平均回收率为(98.5±5.1)%,(103.6±4.8)%,(100.0±4.9)%;高、中、低浓度环氧化卡马西平平均回收率为(95.8±3.6)%,(99.7±2.9)%,(93.0±5.7)%;日内及日间精密度均小于10%,最低检测浓度都为0.10μg.mL-1。结论本法简单、快速、准确,是一种有效的检测人血清中卡马西平和环氧化卡马西平的方法。     

洛美利嗪对大鼠脑微血管内皮细胞上P-糖蛋白功能的影响

目的：研究洛美利嗪对大鼠脑微血管内皮细胞上P-糖蛋白功能的影响。方法：使用荧光分光光度计和流式细胞术分析大鼠脑微血管内皮细胞内P-糖蛋白底物-罗丹明123的荧光强度。结果：环孢素A和洛美利嗪与大鼠脑微血管内皮细胞孵育后能明显提高胞内罗丹明123的荧光强度。人脐静脉内皮细胞内荧光强度则不受环孢素A和洛美利嗪的影响。结论：洛美利嗪能显著地抑制大鼠脑微血管内皮细胞上P-糖蛋白的活性,提高P-糖蛋白底物的胞内浓度。     

缺血再灌注诱导大鼠脑毛细血管内皮细胞凋亡

研究了大鼠大脑中动脉短暂闭塞后血脑屏障通透性与凋亡脑毛细血管内皮细胞的关系。结果表明，血脑屏障受损程度与凋亡脑毛细血管内皮细胞数量随缺血时间延长而增加，脑毛细血管内皮细胞凋亡可能参与了血管源性脑水肿的形成机制。     

白藜芦醇对纤维蛋白上调大鼠脑血管内皮细胞基质金属蛋白酶9表达的影响

目的 观察白藜芦醇(resveratrol,Res)对纤维蛋白诱导的体外大鼠脑血管内皮细胞基质金属蛋白酶 9(ma-trix metalloproteinases9,MMP9)高表达的影响.方法 将大鼠脑血管内皮细胞分离后培养,培养液中加入1.0 mg/ml纤维蛋白和不同浓度的白藜芦醇,通过 RT-PCR 检测脑血管内皮细胞中 MMP9 转录水平,应用明胶酶谱法(gelatin zy-mography)定量检测培养液中的 MMP9 水平.结果 加入不同浓度(0、1、5、10、25和50μmol/L)的白藜芦醇 24 h后,25μmol/L和50μtmol/L 白藜芦醇组的培养液中 MMP9 水平显著降低(P<0.01);RT-PCR 结果显示,25μmol/L 和 50/μmol/L 白藜芦醇组的大鼠脑血管内皮细胞中的 MMP9 显著下调(P0.01).结论 白藜芦醇通过降低纤维蛋白导致的大鼠脑血管内皮细胞中 MMP9 的表达,在神经系统炎性病变中发挥抑制性保护作用.     

大鼠原代脑微血管内皮细胞体外分离与培养的实验研究

目的 探讨获取大鼠脑微血管内皮细胞(BMEC)的简单、有效方法,为构建体外血肿瘤屏障(BTB)模型提供材料.方法 采集出生3～5 d的Wistar胎鼠大脑皮质,应用酶消化法及葡聚糖离心法获得脑微血管段后,接种于培养皿中进行原代培养,采用倒置显微镜对所培养的细胞进行形态学观察;以Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色法鉴定细胞;将BMEC与C6脑胶质瘤细胞共培养,构建体外BTB模型,并采用免疫组化法和免疫荧光法检测BMEC间紧密连接相关蛋白occludin的表达.结果 体外培养2h时脑微血管段贴壁,12～48 h见圆形生发中心形成,2～3d单层内皮细胞自生发中心长出,4～5 d见较大单层内皮细胞团,5～7 d可见融合成片的内皮细胞单层,外观呈“铺路石”样;第Ⅷ因子免疫组化结果显示“铺路石”样细胞胞质呈棕黄色染色;紧密连接相关蛋白occludin的免疫组化和荧光结果证明共培养的BMEC间表达BTB的特性.结论 本方法能成功地进行大鼠原代BMEC培养,构建大鼠体外BTB模型,进而应用于BTB的生理、生化及药理学研究.     

大鼠脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型的建立

[目的]建立大鼠脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型。[方法]采用原代培养脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养方法建立血脑屏障体外模型。[结果]星形胶质细胞与脑微血管内皮细胞共培养可提高血脑屏障特异性酶——γ-谷胺酰胺转肽酶、碱性磷酸酶的表达,提高脑微血管内皮细胞跨细胞间电阻。[结论]成功建立脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型,而且较单层内皮细胞模型更接近在体状态。     

LC-MS/MS测定大鼠血浆中1-脱氧野尻霉素及药代动力学研究

目的：建立大鼠血浆中1-脱氧野尻霉素（DNJ）的液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）测定方法,并用于大鼠口服桑叶总生物碱后DNJ的药代动力学研究。方法：血浆样品经甲醇沉淀蛋白后,以乙腈-6.5mmol·L-1甲酸铵水溶液为流动相,采用AgilentEclipsePlusC18柱（2.1mm×150mm,3.5μm）进行分离,梯度洗脱,流速0.4mL·min-1。采用电喷雾离子源,多反应监测（MRM）模式,正离子检测,用于定量的离子反应为m/z164.0→69.0（DNJ）,m/z208.1→146.0（米格列醇,内标）。结果：DNJ在1~500ng·mL-1浓度范围内线性关系良好,日内、日间精密度（RSD）均小于10.9%,准确度在92.4%~112.7%,DNJ和内标的提取回收率均大于84.1%。结论：本方法快速、灵敏、操作简便,可用于1-脱氧野尻霉素的药代动力学研究。     

牛视网膜微血管内皮细胞培养方法的研究

目的 探求一种简单、易行的体外培养牛视网膜微血管内皮细胞的方法。方法 采用胶原酶消化获得细胞，并用低浓度人血浆提纯细胞。加入视网膜提取液促进细胞生长。结果 经过多次探索、观察，比较成功的进行了视网膜血管内皮细胞的培养，并成功的进行了鉴定。结论 此方法适合一般实验室开展视网膜血管内皮细胞培养。