人肺腺癌细胞A549对蜱媒脑炎病毒的易感性分析

目的 研究蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)在易感细胞中的培养特性,为抗病毒药物的筛选研究提供合适的细胞模型。方法 qRT-PCR检测TBEV在Vero细胞内RNA复制,蛋白质印迹检测病毒蛋白表达。显微镜下观察TBEV感染A549细胞的病变。免疫荧光检测TBEV感染A549、Vero细胞内病毒包膜蛋白的表达。空斑实验检测TBEV在A549和Vero细胞内的滴度。结果 同TBEV孵育48 h相比,孵育72 h的Vero细胞内TBEV RNA水平升高,并检测到TBEV包膜蛋白的表达。Vero细胞培养的TBEV滴度为2×106 PFU/mL。TBEV感染A549细胞引起明显的细胞病变效应。包膜蛋白的表达水平在TBEV感染的A549细胞远高于Vero细胞。同Vero细胞相比,TBEV感染A549细胞上清内的病毒滴度升高(P<0.05)。结论 Vero细胞可用于培养TBEV,A549细胞对TBEV更易感。     

2株不同基因型树鼩呼肠孤病毒的分离和鉴定

目的 从腹泻树鼩的粪便样本中分离和鉴定病毒。方法 树鼩腹泻粪便样本分别接种Vero、LLC-MK2和KMB17细胞,经连续传代,观察记录细胞病变,并对培养上清进行透射电镜检查、病毒RNA-PAGE胶电泳分析、轮状病毒鉴别筛查、S1全长基因片段扩增和生物信息学分析。结果 树鼩腹泻粪便样品在KMB17、Vero 和LLC-MK2细胞上经连续3代次传代后,均能产生细胞病变。进一步经电镜检查、病毒RNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和轮状病毒鉴别筛查,推测其为呼肠孤病毒。病毒基因组全长S1基因扩增、序列测定和分析结果表明,KMB17培养上清中获得的病毒与I型原型株T1L同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和90%,因此该病毒定义为呼肠孤病毒I型。而LLC-MK2和Vero细胞上清中的病毒S1基因与III型原型株T3D核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和92 %,因此为III型病毒。S1基因的遗传进化分析表明,本研究的分离株已经进化适应了树鼩。结论 本研究首次通过3种基质细胞和S1基因片段特异性引物从同一粪便样品中分离和鉴定了2个不同基因型呼肠孤病毒,对今后树鼩和其它宿主呼肠孤病毒的分离鉴定有一定的指导意义。     

流行性出血热病毒在细胞培养中的传代适应

作者以非疫区黑线姬鼠为实验动物,自疫区黑线姬鼠肺组织分离出三株流行性出血热(EHF)病毒,并使之在绿猴肾传代细胞(Vero,E6纯化系)及人肺癌细胞(A549) 中进行传代,均于第2～3代开始查见对EHF恢复期患者血清的免疫荧光反应,至第5代基本稳定适应。实验结果表明,E6细胞及 A549细胞对 EHF病毒的传代适应均比较敏感。E6适应株的病毒滴度均在10~5(TCID_(50)/ml)以上。用感染E6细胞及A549细胞病毒抗原检查EHF     

重组戊型肝炎病毒抗原免疫恒河猴及其对病毒攻击的保护

目的：了解重组抗原免疫恒河猴的抗体应答情况及其对病毒攻击的保护作用。方法：利用大肠杆菌表达的戊型肝炎（HEV）病毒3个不同的片段,分别为Agl(ORF2 C端431aa)、Ag2(ORF2 C端128aa片段）、Ag3[ORF3 122aa与ORF2 6287－6404碱基编码的39aa片段以及C端128aa依次以（Gly)n短臂连接的嵌合抗原]免疫恒河猴,用ELISA方法检测IgG抗体水平,3周后达到较高水平应答时,用HEV阳性粪便样静脉注射进行攻击,经肝脏病理切片观察、血清IgG、丙氨酸转氨酶（ALT）水平测定及粪便排毒的RT－nPCR检测来评价抗原对病毒攻击的保护作用。结果：对照组3只猴中两只发现肝脏组织产生明显的病理性改变,而免疫了抗原的试验组12只猴正常;对照组均在攻毒后3－4周发生ALT异常,为正常值的10－20倍,而试验组有部分猴不同程度轻微的ALT异常,其余正常;试验组免疫抗原后IgG水平迅速上升,滴度可达1：12800;对照组粪便中病毒RNA的检出在攻毒后7－50d左右,而试验组7－21d内以低水平存在。结论：重组的抗原片段诱发机体产生针对HEV的抗体应签,能够抑制HEV感染引起的肝炎症状的产生。     

二株不同基因型树鼩呼肠孤病毒的分离和鉴定

目的 从腹泻树鼩的粪便样本中分离和鉴定病毒。方法 树鼩腹泻粪便样本分别接种Vero、LLC-MK2和KMB17细胞,经连续传代,观察记录细胞病变,并对培养上清进行透射电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析、轮状病毒鉴别筛查、S1全长基因片段扩增和生物信息学分析。结果 树鼩腹泻粪便样品在KMB17、Vero 和LLC-MK2细胞上经连续3代次传代后,均能产生细胞病变。经电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析和轮状病毒鉴别筛查,推测其为呼肠孤病毒。病毒基因组全长S1基因扩增、序列测定和分析结果表明,KMB17培养上清中获得的病毒与I型原型株T1L同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和90%,因此该病毒定义为呼肠孤病毒I型。而LLC-MK2和Vero细胞上清中的病毒S1基因与III型原型株T3D核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和92%,因此为呼肠孤病毒III型。结论 对今后树鼩和其他宿主呼肠孤病毒的分离鉴定有一定的指导意义。     

戊型肝炎病毒ORF3基因在杆状病毒系统中的表达与免疫学性质

目的 利用杆状病毒系统表达戊型肝炎病毒（HEV）ORF3,为进一步研究免疫学性质与功能提供基础。方法 通过RT－PCR方法获得HEV ORF3基因的目的基础片段,插入中间转染载体质粒pVL1393,构建重组质粒,再与杆状病毒线性DNA（BaculoGold^TM）共转染Sf9昆虫细胞,通过同源重组得到重组杆状病毒,以此重组杆状病毒感染昆虫细胞后,对表达的重组蛋白进行免疫学检测并免疫小鼠。结果 表达的重组蛋白约占昆虫细胞总蛋白的2％,可被戊型肝炎患者与实验猴阳性抗血清有效识别,并能诱导小鼠产生对HEV特异性免疫应答。结论 重组杆状病毒可高效表达HEV ORF3基因片段,表达产物具有HEV特异的免疫原性。     

广州地区散发性戊型肝炎患者粪便中93G株病毒的分离培养和鉴定

为探讨戊型肝炎病毒（HEV）的体外组织培养问题，我们用人肺癌细胞从广州地区散发性戊型肝炎患者早期粪便中分离培养了93G株病毒，现将结果报告如下。1材料与方法1．1粪便标本：从1993年在我院就诊的急黄肝患者中筛选了8份粪便标本。筛选条件为：①急黄肝发病一周内；②患者血清中HEV-IgG和HEV-IgM于发病后阳转（Genelabs和B＆LEIA试剂检测）；③血清学上排除了甲、乙、丙型肝炎。1．2主要试验用品：①人肺癌细胞（A549细胞）、新疆HEV免疫兔血清、HEV418he生物素探针（含HEV4458－4gy6M序列），由北京军事医科院五所提供。②…     

核糖体蛋白L39-L在肺癌A549细胞耐药机制中的作用

目的探讨核糖体蛋白L39-L在肺癌A549细胞对阿霉素类药物耐药机制中的作用。方法以体外培养的阿霉素耐药和敏感人肺癌A549细胞株,Trizol法提取总RNA,Light Cycler RNA扩增法进行荧光定量RT-PCR,检测阿霉素耐药A549细胞株、敏感细胞株之间的RPL39-L基因表达差异。经对人肺癌A549敏感细胞株体外培养、稳定转染RPL39-L基因后,3H-Td R掺入法进行生存率检测分析核糖体蛋白L39-L转染A549细胞、载体转染A549细胞和空细胞株对阿霉素的耐药性差异。结果荧光定量RT-PCR结果显示,耐药性人肺癌A549细胞株比敏感的A549细胞核糖体蛋白L39-L转录水平高7.3倍。3H-Td R掺入测定生存率显示,与质粒载体转染细胞或空细胞相比,转染核糖体蛋白L39-L的细胞表现出增强的阿霉素耐药性。结论核糖体蛋白L39-L基因可能在肺癌A549细胞的耐药机制形成机制中有作用。     

RNA干扰介导ABCE1基因沉默对人肺腺癌A549细胞增殖的影响

目的ABCE1在人肺腺癌A549细胞增殖中的作用进行初步探讨。方法以人肺腺癌A549细胞系为研究对象,针对其ABCE1基因序列设计小干扰RNA片段,重组其短发夹状RNA（shRNA）表达载体,转染入细胞。用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫印迹（Western blot）方法分别检测转染后ABCE1的mRNA和蛋白的表达水平,MTT法检测增殖能力。结果RT-PCR和Western blot显示shRNA对ABCE1基因和蛋白水平均有显著的下调作用。人肺腺癌A549细胞的生长速度减慢。结论下调ABCE1基因后,A549细胞的增殖能力得到了明显的抑制,有可能成为临床治疗A549的靶点之一。     

江苏省某地区人源与猪源戊型肝炎病毒的检测和部分序列分析

目的:调查了解江苏省某农村地区人源与猪源戊型肝炎病毒(HEV)的相关性?方法:应用逆转录-巢式聚合酶链法(RT-PCR)对同一地区内一般人群中HEV IgM阳性者?急性戊型肝炎患者血标本和生猪胆囊标本进行HEV RNA检测,并对HEV RNA 阳性标本进行克隆测序和序列分析?结果: 一般人群中检出的HEV基因1?4型比例相近,临床散发性戊肝病例绝大部分为HEV-4型病毒感染所致(95.24%);生猪胆汁标本PCR阳性率为12.11%,猪源HEV基因分型均为HEV-4型;分离于人和生猪的HEV-4型病毒高度同源,同源性81%~97%?结论:该地区人群HEV基因分型以HEV-4型为优势毒株;猪源HEV均为基因4型;人源和猪源的HEV-4型病毒高度同源,猪是当地HEV主要宿主动物之一?     

BGM细胞,Hela细胞,HEL细胞与A549细胞对HSV-1敏感性的比较

用单纯疱疹病毒－１型（ＨＳＶ－１）感染ＢＧＭ细胞、Ｈｅｌａ细胞、ＨＥＬ细胞及Ａ５４９细胞，利用空斑试验，比较四种细胞对ＨＳＶ－１的敏感性。结果示，ＨＳＶ－１在ＢＧＭ细胞培养中空斑形成单位（ＰＦＵ）数最多，出现细胞病变的时间早。提示ＢＧＭ细胞可为ＨＳＶ－１的分离培养提供一种新的、敏感细胞。     

靶向survivin的siRNA表达载体的构建和表达及对HeLa细胞的影响

目的应用RNA干扰技术(RNAi)针对凋亡抑制因子survivin存活素的siRNA抑制Hela细胞株内源survivin基因的表达以及可促进Hela细胞凋亡。方法构建重组质粒pshRNA-survivin-1和pshRNA-survivin-2并分别转染Hela细胞株,通过免疫荧光和半定量RT-PCR检测survivin蛋白表达及mRNA转录水平的变化,并通过流式细胞仪使用PI-AnnexinV双染法检测Hela细胞株的凋亡。结果构建的2种重组质粒pshRNA-survivin-1和pshRNA-survivin-2均能明显抑制survivin基因的表达;应用免疫荧光检测survivin基因的表达,转染重组质粒pshRNA-survivin-1和pshRNA-survivin-2的实验组survivin荧光强度明显低于转染空载体pGE-1和pshRNA阴性非特异对照质粒;通过半定量RT-PCR检测到survivin基因mRNA转录明显减少;通过PI-AnnexinV双染法检测Hela细胞的凋亡分别达(36.02±2.12)%(P<0.01)和(35.29±2.02)%(P<0.01)。结论重组质粒pshRNA-survivin-1和pshRNA-survivin-2均可明显抑制Hela细胞内源survivin的表达和mRNA的转录均可并明显促进Hela细胞的凋亡,为survivin介导的肿瘤基因沉寂疗法提供良好的实验基础。     

Preliminary study on Herpes simplex virus type 1 infection of human oral epithelial cell in vitro

Objective： To explore the functions and mechanisms of herpes simplex virus type I（HSV-1） while infecting human oral epithelial cells in vitro（being similar to the infection in vivo）. Methods：An abundance of HSV-1 strains amplified in Vero cells were used to infect human oral epithelial cells. The culture supernatant was collected to infect Vero cells again. Morphology of HSV-1 was identified by inverted microscope and transmission electron microscope. Nucleic acid of the virus was detected by PCR. Results：The infected human oral epithelial cells didn＇ t display an obvious cytopathic effect（CPE） under inverted microscope（while Vero cells which were infected by the culture supernatant showed typical（CPE）. The virus particles were not observed in the cytoplasm nor in nucleus of human oral epithelial cells, however under transmission electron microscope in the cytoplasm of Vero cells, the nucleic acid of HSV-1 could be detected in infected human oral epithelial cells, by PCR. Conclusion-HSV-1 can successfully infect human oral epithelial cells. This model may provide a useful approach for studying the pathogenesis of herpes virus-associated periodontal disease.     

HRSV在人二倍体细胞上的生长动力学研究

目的研究人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus,HRSV）在人二倍体KMB17细胞上的增殖动力学,为病毒的体外细胞大量繁殖创造条件．方法将HRSVA2株接种到人二倍体KMB17细胞,采用微量细胞病变法在不同时间检测病毒的感染性滴度,绘制一步生长曲线;同时,以不同剂量的病毒感染复数（MOI）感染细胞,分析细胞开始出现病变及所有接种孔全部病变的时间,并检测收获物的感染性滴度,确定最佳MOI．结果HRSV在KMB17细胞上的感染增殖一步生长曲线分析提示,该病毒在培养到2～4d后开始病变,第5～10天呈对数增长,其增殖高峰为10～11d,10d后增殖趋于平缓;接种MOI越大,开始出现病变时间及完全病变的时间都越早．接种100、10及1个MOI时,接种后2—3d均出现病变,第6天时三组细胞病变率均为100％,感染性滴度为7．37～7．50lgCCID50／mL,三组之间无明显的差异;接种在0．1、0．01及0．001个MOI时,接种后第4天有30％的细胞出现病变,第8—9天时细胞病变率也均达到100％,感染性滴度在6．50～7．0lgCCID50／mL之间;当接种在0．0001个MOI以下时,接种后第5—6天才出现病变,至第14天时细胞仍未能完全产生病变,发生病变的细胞收获物其感染性滴度仅为6．00～6．12lgCCID50／mL．结论HRSV A2株病毒在KMB17细胞内能良好增殖,其增殖高峰为10～11d,收获物感染性滴度最高可达7.50lgCCID50／mL,接种最佳MOI约为0．1～1．0．     

Survivin siRNA对肝癌细胞BEL-7402的增殖与对Survivin基因及蛋白表达的作用

目的:探讨小干扰RNA(siRNA)对BEL-7402细胞的生长抑制与生存素(Survivin)基因及蛋白表达的影响。方法:合成Survivin siRNA,以不同浓度转染BEL-7402细胞,MTT法测定细胞生长抑制率,RT-PCR、Western-Blot检测BEL-7402细胞Survivin mRNA及蛋白的表达差异。结果:BEL-7402细胞转染FAM荧光标记的siRNA后,细胞内有绿色荧光表达。分别以10、30、50nmol/LSurvivin siRNA转染细胞后,MTT测得的细胞生长抑制率分别为(38.80±1.71)%,(54.50±1.16)%,(66.79±1.10)%,RT-PCR测得的Survivin mRNA表达分别为0.42±0.02,0.28±0.01,0.12±0.01,Western-Blot测得Survivin蛋白表达分别为0.55±0.04,0.32±0.02,0.21±0.02,三项指标与空白对照组、阴性对照组、脂质体对照组比较有极显著性差异(P<0.01)。随着Survivin siRNA浓度的增加,细胞抑制率呈上升趋势,Survivin mRNA及Survivin蛋白的表达逐渐降低,呈浓度-效应关系。结论:Survivin siRNA能抑制BEL-7402细胞的增殖与Survivin基因和蛋白表达。     

BGM细胞,Hela细胞,HEL细胞与A549细胞对HSV—1敏感性的比较

用单纯疱疹病毒－１型（ＨＳＶ－１）感染ＢＧＭ细胞、Ｈｅｌａ细胞、ＨＥＬ细胞及Ａ５４９细胞，利用空斑试验，比较四种细胞对ＨＳＶ－１的敏感性。结果示，ＨＳＶ－１在ＢＧＭ细胞培养中空斑形成单位（ＰＦＵ）数最多，出现细胞病变的时间早。提示ＢＧＭ细胞可为ＨＳＶ－１的分离培养提供一种新的、敏感细胞。     

临床诊断的SARS患者鼻咽拭子采集、SARS冠状病毒分离及鉴定

目的 从临床诊断的严重急性呼吸综合征(severe aeute respiratory syndrome,SARS)患者鼻咽拭子标本分离并鉴定SARS冠状病毒。方法 SARS患者鼻咽拭子标本接种于含Veto及MRC-5单层细胞的24孔培养板中。分离物使用血清学方法、电镜及基因测序进行鉴定。结果 2003年4月-5月北京协和医院共采集79例临床诊断SARS患者的158份鼻咽拭子标本。3例接种Veto细胞孔的鼻拭子标本发现细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)。用分离物感染细胞做为抗原,免疫荧光血清学发现SARS患者急性期和恢复期血清标本存在SARS冠状病毒抗体(IgG和IgM)阳转和／或4倍及以上升高。分离物上清液负染电镜观察到冠状病毒。基因测序证实3株分离物是SARS冠状病毒。结论3株自79例SARS患者鼻咽拭子标本的病毒分离物是SARS冠状病毒。