乳鼠软骨细胞体外培养及生物学特性研究

目的:研究体外培养乳鼠胸骨剑突软骨细胞的原代培养方法,探讨该方法应用的可行性和应用价值.方法:采用胶原酶消化法分离培养乳鼠胸骨剑突软骨细胞,以含20%胎牛血清的高糖DMEM培养液进行培养,并进行细胞接种与传代,用倒置显微镜、电镜及组织学方法观察细胞形态、超微结构.细胞采用ABC法进行Ⅱ型胶原免疫组化染色以及细胞形态观察鉴定软骨细胞起源.结果:(1)原代培养软骨细胞48 h后,大量细胞贴壁生长,呈圆形、长梭形或有2～3个突起,胞质透亮、饱满,7 d后细胞铺满整个培养皿底面.(2)原代软骨细胞呈圆形或多角形,第4代有一半变成梭形,第5代绝大部分变为长梭形;原代软骨细胞胞浆内粗面内质网和线粒体丰富,第3代软骨细胞生长增殖能力强于原代,第5代增殖能力明显减弱.结论:体外培养的乳鼠剑突软骨细胞保持了其体内的基本特征,采用胶原酶消化法分离培养软骨细胞是一种可靠、简便、快速的细胞原代分离培养方法.第3代软骨细胞适合用于软骨组织工程及学术研究.     

新生大鼠心肌细胞分离与原代培养

目的 应用酶消化法消化心肌组织、培养心肌细胞.方法 0.1%的胰蛋白酶重复消化乳鼠心肌组织多次,收集的细胞用含15%胎牛血清的MEM培养基混悬后过滤,纯化心肌细胞后置CO2培养箱孵育.结果 培养的心肌细胞4～6 h后开始贴壁生长,12～24 h明显增殖,3～4 d后细胞汇合成片.在倒置显微镜下心肌细胞呈圆形、梭形、多角形,伸出伪足,出现自发性节律性搏动.结论 应用酶消化法可简便、快速地获得大量活力高的心肌细胞.     

东方田鼠皮肤成纤维细胞的分离培养及生物学特性

目的 探索和建立东方田鼠皮肤成纤维细胞体外分离、培养的技术方法并观察其生物学特性。方法采用含10%小牛血清的Dulbecco 改良Eagle培养液(DMEM)和1640两种培养体系,运用组织块贴壁法和胰酶消化法,分别对出生后1 、3 d和5 d的东方田鼠乳鼠皮肤成纤维细胞进行原代分离、培养。苏木素-伊红染色及倒置相差显微镜下观察成纤维细胞形态和生长特性。结果0.25%胰酶消化分离出生后1 d和3 d东方田鼠乳鼠皮肤较出生后5 d组织可获得较多数量细胞,成纤维细胞在体外快速贴壁生长,一般6 ～7 d长满培养瓶,细胞纯度高,HE染色细胞呈长梭形,胞核明显；DMEM和1640两种培养液均可用于东方田鼠皮肤成纤维细胞的培养,但细胞传代后生长趋缓,只可传代2～3次。本实验运用组织块贴壁法未能培养出皮肤成纤维细胞。结论确定了有效分离东方田鼠皮肤成纤维细胞的日龄和方法,为进一步深入研究提供了技术方法和操作依据。     

组织块法培养大鼠颌下腺细胞的实验研究

目的 探讨组织块法培养大鼠颌下腺细胞(RSGC)的方法与细胞生长的特点.方法 采用组织块法培养RSGC,使用酶消化法和差速贴壁法进行细胞纯化,免疫组织化学SABC方法进行细胞角蛋白-8免疫组化染色,进行细胞来源鉴定.倒置显微镜下进行形态学观察,取第2代RSGC,FDA-PI双色荧光法检测细胞活力,MTT法绘制生长曲线.结果 细胞角蛋白-8染色阳性.倒置显微镜下,细胞主要呈3种形态,为圆形亮细胞、多角形暗细胞、梭形暗细胞.细胞活力＞95%,生长曲线表示细胞5 d开始进入对数生长期.结论 此方法简便,易操作,获得了大量的RSGC,为颌下腺细胞作为种子细胞的颌下腺组织工程研究提供了实验基础和理论依据.     

乳鼠成骨细胞的原代培养与鉴定

目的：验证及改良成骨细胞原代培养常用方法，探讨该方法的可行性和应用价值。方法：取材于出生2～3d小鼠颅骨，以含20％胎牛血清的DMEM培养液进行培养，采用胶原酶消化法分离成骨细胞，并进行细胞接种与传代。细胞采用Gomori钙钴法染色并进行细胞形态观察，鉴定成骨细胞起源，根据细胞的生长曲线以及贴壁率观察细胞的生长情况。结果：原代培养48h后，大量细胞贴壁生长，呈长梭形或有2～3个突起，胞质透亮、饱满，7d后细胞铺满整个平皿底面。所得细胞经Gomori钙钴法鉴定，证实为成骨细胞。细胞接种后第1个24h为细胞潜伏适应期，第2～7个24h生长曲线基本为线性曲线，是细胞的对数生长期。细胞贴壁主要发生在接种10h之内。结论：采用胶原酶消化法分离培养成骨细胞是一种可靠、简便、快速的细胞原代分离培养方法。     

脐血贴壁细胞体外培养与生长特性观察

目的 观察脐血贴壁细胞生长特性及提高体外培养脐血贴壁细胞成功率，为造血干细胞培养提供基质环境。方法 采用密度梯度离心法分离脐血单个核细胞，在含20ng／ml bFGF，10％胎牛血清的低糖DMEM培养基中培养，于倒置显微镜下观察细胞生长情况、并描绘其生长曲线、流式细胞仪检测细胞周期。结果 脐血贴壁细胞呈长梭形、针形或三角形，增殖周期G0／G1为85．12％，倍增时间为48h。结论 体外培养的脐血细胞能够贴壁生长并形成单层细胞层。     

大鼠关节软骨细胞的培养

目的探讨大鼠关节软骨细胞培养方法。方法采用胶原酶NB4消化法从1周龄SD大鼠的关节软骨中分离出软骨细胞并进行原代和传代培养,每日在倒置显微镜下观察细胞形态及其生长情况,并用HE、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色进行鉴定。结果软骨细胞形成单层的时间在原代培养1周左右,5d左右即可传代。第5代后部分变为梭形,第7代后绝大部分变为长梭形,增殖能力减弱。结论采用此法可在短时间内获得大量纯化的大鼠软骨细胞。     

乳鼠成骨细胞体外培养

目的建立乳鼠成骨细胞体外培养方法,探讨该方法的可行性和应用价值。方法用出生1~3 d乳鼠颅骨,采用多次胶原酶消化法进行细胞体外培养。倒置显微镜观察细胞形态,对其碱性磷酸酶(ALP)活性及矿化能力进行鉴定,并测定细胞生长曲线。结果原代培养24 h后,大量细胞贴壁生长,细胞呈圆形,48 h后,贴壁细胞呈长梭形、三角形或不规则多边形,并且贴壁细胞伸出2~3个突起,胞质透亮、饱满,7 d后细胞铺满整个平皿底面。经鉴定,培养细胞具有体内成骨细胞的生物学特性。细胞接种后第1与第2个24 h为细胞的潜伏适应期,第3与第7个24 h生长曲线基本为线性曲线,是细胞的对数生长期。结论采用胶原酶消化法分离培养成骨细胞的方法切实可行。     

大鼠鼠胚海马神经细胞原代培养及神经元鉴定

目的建立大鼠鼠胚海马神经元原代培养的方法。方法取孕龄17-18天的Wistar大鼠腹中胎鼠,血清培养法进行海马神经元的原代培养,然后用倒置显微镜进行形态学观察和神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学方法进行神经元的鉴定。结果培养8天后的海马神经元经形态学和组织化学方法观察证实神经细胞发育成熟。结论大鼠鼠胚海马神经元原代培养是一种新型的培养方法,具有明显的优势。     

小鼠主动脉血管平滑肌细胞分离培养及鉴定

目的建立体外分离培养小鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的技术方法并观察其生长特征。方法比较组织贴块法及酶联合消化法原代分离小鼠主动脉来源的VSMC,利用倒置显微镜观察细胞生长情况;苏木精-伊红(HE)染色观察细胞形态及免疫荧光染色法鉴定细胞;台盼蓝法、绘制生长曲线法、3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法分别测定主动脉VSMC传代细胞的成活率、生长、增殖特征;观察不同血清含量对主动脉VSMC生长的影响。结果组织贴块法培养的细胞6 d后,细胞从组织块边缘长出,14 d后生长迅速可传代;酶联合消化法分离培养的细胞3 d后,细胞呈梭形生长,7～8 d后生长迅速可传代;第2代细胞在显微镜下观察可见呈典型"峰-谷"状生长;2种方法获得的细胞行免疫荧光染色显示胞浆内α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,细胞成活率均为96%;细胞生长曲线近似"S"形,MTT法显示细胞生长第3～5天光密度值变化较明显;用含体积分数20%血清的杜尔伯科改良伊格尔培养基高糖培养液培养的细胞出现明显对数期。结论本研究建立了高效分离和培养主动脉VSMC的2种方法,细胞均稳定地表达α-平滑肌肌动蛋白,为血管疾病的研究提供了理想的细胞模型。