幽门螺杆菌Tipα重组蛋白的表达?纯化及鉴定

目的:克隆幽门螺杆菌(H.polyri,HP)的Tipα基因,构建含有Tipα的重组载体,在大肠杆菌表达并纯化以获得Tipα蛋白。方法:从HP的26695菌株扩增位于HP0596的Tipα基因,将Tipα基因与pET28a载体(His标签)同时经BamHI和XhoI酶切、纯化及连接后,构建含有Tipα的重组载体pET28a-Tipα,重组载体转化至大肠杆菌并表达,表达产物以Ni-NTA亲和层析纯化,Western blot进一步鉴定。结果:克隆Tipα基因,经测序证实与Genbank对比,二者同源性为100%。大肠杆菌表达产物,纯化后SDS-PAGE显示相对分子量为23 ku。Western blot证实纯化产物与抗Tipα抗体特异性结合。结论:成功克隆并表达出HP的Tipα蛋白,为进一步研究Tipα的功能奠定基础。     

重组生长激素释放激素GHRH的纯化及活性测定

目的用基因工程的方法在大肠杆菌中诱导表达重组生长激素释放激素(GHRH),检测其生物学活性。方法将重组表达质粒pET-28a /L-ansB-GHRH,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导融合蛋白表达。经裂解细胞、洗涤、乙醇沉淀、酸水解、SP-Sephadex C-25和Sephadex G25柱层析等方法纯化GHRH。用人生长激素放免试剂盒检测GHRH多肽的活性。结果SDS-PAGE分析显示重组表达质粒在大肠杆菌中成功地表达了融合蛋白,它以不溶性的包涵体形式存在,占菌体总蛋白的30%左右。经抽提、酸水解、层析等方法表明纯化倍数达147倍,多肽收率为0.68%。通过电喷雾质谱测得多肽的相对分子质量为5235.25,与理论计算值相吻合。多肽的纯度经SDS-PAGE测定为单一峰。GHRH三组刺激实验组与空白对照组相比之间差异显著(P<0.01),且随着剂量增加,差异明显增加。结论体外重组GHRH多肽具有较高的生物学活性。     

蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2基因的克隆、表达及活性鉴定

【目的】获取人蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2（PTP4A2）基因并高效表达纯化,对于产物的体外活性进行测定。【方法】用RT-PCR技术,从肝癌细胞系HepG2的总RNA中,获得编码PTP4A2基因功能片段的DNA。测序后,通过酶切亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建重组表达载体,并导入大肠杆菌E.coliBL21中,IPTG诱导表达重组的GST融合蛋白。对重组融合蛋白过谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化,western印记进行鉴定,质谱检测蛋白分子量。通过其对底物磷酸多肽的去磷酸化反应,鉴定其活性。【结果】获得编码肝癌细胞PTP4A2（全长氨基酸）的基因序列,测序结果与已发表的基因序列相一致。重组GST融合蛋白经western分析,在相对分子质量Mr=45000处,有特异的蛋白条带。重组蛋白经谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白,质谱检测其分子量为45470.6。底物多肽去磷酸化反应表明纯化产物具有较强活性。【结论】成功克隆人PTP4A2基因,并在E.coliBL21中高效表达,亲和层析后获得高纯度GST融合蛋白,质谱检测分子量与预期结果一致,纯化产物具有蛋白磷酸酯酶活性。     

甲基化CpG结合域重组蛋白的表达与鉴定

目的:在大肠杆菌中表达甲基化CpG结合域(methyl-CpG-binding domain,MBD)重组蛋白?方法:对人甲基化CpG结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2,Mecp2)的MBD区行密码子优化,将人工合成的DNA克隆至原核表达载体pGS21a,在大肠杆菌E. coli Rosetta(DE3)中诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达;镍亲和层析柱纯化重组蛋白?表面等离子共振分析重组MBD蛋白与甲基化DNA的结合能力?结果:酶切和核酸测序证实,成功构建了含密码子优化的MBD基因的原核表达载体?SDS-PAGE和Western blot结果显示,MBD重组蛋白在大肠杆菌中得到表达?亲和层析法纯化后获得了相对分子量为38 000的MBD重组蛋白?SPR分析显示MBD重组蛋白能特异结合甲基化DNA?结论:成功构建含密码子优化的MBD基因的原核表达载体,MBD重组蛋白能在大肠杆菌中表达?     

人可溶性CD83基因的克隆、原核表达和纯化

目的:构建人可溶性CD83基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达和纯化.方法:利用反转录PCR方法从正常人外周血单个核细胞中获得可溶性CD83基因,克隆到表达载体pET-32a载体,构成重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达6×His融合蛋白,并经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定.表达产物包涵体经Ni-NTA亲和层析纯化.结果:经酶切鉴定及测序证实可溶性CD83蛋白基因的原核表达载体构建正确.经SDS-PAGE及Western blot显示在M,约32 000处出现融合表达条带.融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的45%.重组蛋白经Ni-NTA亲和层析进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白.结论:成功克隆人外周血单个核细胞来源的可溶性CD83基因片段,并在大肠杆菌B121(DE3)中高效表达,亲和层析纯化后获得高纯度融合蛋白.     

巢蛋白样结构域蛋白的表达?纯化与鉴定

目的:重组构建原核表达载体以正确表达巢蛋白样结构域(nidogen domains,NIDO)蛋白,并进一步纯化与鉴定?方法:PCR法拼接NIDO基因,经T-A连接亚克隆至pMD19-T载体,测序鉴定?采用质粒抽提?纯化?酶切?连接?感受态细胞制备和转化等技术,构建并鉴定原核表达载体pGEX-4T-1-NIDO?药物诱导方式诱导NIDO-GST融合蛋白的表达?对表达产物进行分离,用SDS-PAGE检测上清与包涵体沉淀中目的蛋白的表达量?对包涵体进行变性和透析复性后,进行GST亲和层析纯化?采用SDS-PAGE和质谱分析,鉴定纯化的目的蛋白?结果:测序证实了NIDO基因的正确合成和pMD19-T-NIDO克隆载体的构建?原核表达系统pGEX-4T-1-NIDO构建成功,在大肠杆菌BL21中被诱导,获得高表达量的N-末端带有GST标签序列的重组融合表达蛋白(30%)?超声裂菌法分离的结果显示,目的蛋白在菌体沉淀中以包涵体形式居多?将包涵体变性?复性后用GST亲和层析纯化,纯化蛋白> 80%并经质谱鉴定证实?结论:成功构建原核表达载体pGEX-4T-1-NIDO,能正确表达NIDO-GST融合蛋白,GST亲和层析对于NIDO-GST融合蛋白有较好的纯化效果?     

蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2基因的克隆、表达及活性鉴定

 【目的】获取人蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2（PTP4A2）基因并高效表达纯化,对于产物的体外活性进行测定。【方法】用RT-PCR技术,从肝癌细胞系HepG2的总RNA中,获得编码PTP4A2基因功能片段的DNA。测序后,通过酶切亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建重组表达载体,并导入大肠杆菌E.coliBL21中,IPTG诱导表达重组的GST融合蛋白。对重组融合蛋白过谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化,western印记进行鉴定,质谱检测蛋白分子量。通过其对底物磷酸多肽的去磷酸化反应,鉴定其活性。【结果】获得编码肝癌细胞PTP4A2（全长氨基酸）的基因序列,测序结果与已发表的基因序列相一致。重组GST融合蛋白经western分析,在相对分子质量Mr=45000处,有特异的蛋白条带。重组蛋白经谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白,质谱检测其分子量为45470.6。底物多肽去磷酸化反应表明纯化产物具有较强活性。【结论】成功克隆人PTP4A2基因,并在E.coliBL21中高效表达,亲和层析后获得高纯度GST融合蛋白,质谱检测分子量与预期结果一致,纯化产物具有蛋白磷酸酯酶活性。     

丙型肝炎病毒F蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

目的:构建丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)F蛋白的原核表达载体,表达pET32a(+)-HCVF融合蛋白.方法:根据丙型肝炎病毒F基因的全序列设计引物,以HCV1a型cDNA质粒H/FL为模板,通过PCR方法扩增得到F基因的编码区序列,将其定向克隆于含有6×His tag的原核表达载体pET32a(+),转化大肠杆菌JM109,经菌落PCR筛选,双酶切和测序鉴定阳性克隆后,转化大肠杆菌BL21,采用IVTG诱导表达融合蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测鉴定,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化.结果:F基因以正确的方式插入到pET32a(+)载体中,重组质粒转化大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达,出现了与预期分子量相符的蛋白条带,该蛋白通过Western blot检测具有6×His tag蛋白的免疫学活性.结论:成功构建了丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达载体pET32a(+)-HCVF并表达和纯化出重组融合蛋白,为进一步研究F蛋白的生物学功能奠定了基础.     

PTD-SH2融合蛋白的原核表达和纯化

目的:构建含SH2与蛋白转导结构域(PTD)融合基因片段的重组表达载体,在大肠杆菌中进行表达并纯化蛋白. 方法: 通过PCR方法扩增出SH2基因,克隆入pMD-18T载体,进行测序分析,将该基因亚克隆入原核表达载体pET-16b中PTD 的下游构建重组质粒pET-16b-PTD-SH2,转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析,将已表达的蛋白质通过Ni-NTA亲和色谱柱进行纯化. 结果:构建了重组融合表达质粒pET-16b-PTD-SH2, 表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,在约Mr为15×103处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的16%, 可溶性分析发现融合蛋白主要以包涵体形式存在,纯化后得到了目的蛋白. 结论: 成功构建了PTD-SH2的重组表达载体,使融合蛋白在E. coli DE3中高效表达,亲和层析后获得了纯化目的蛋白,为后续的SH2结构域的功能研究奠定了基础.     

人源胸腺素α原和白介素2融合蛋白的基因克隆与原核表达

目的克隆人胸腺素α原/白介素2融合基因,构建其原核表达载体并在大肠杆菌系统中有效表达。方法采用RT-PCR方法,从人白血病细胞和人T淋巴细胞中分别扩增得到胸腺素α原/白介素2基因,利用基因重组技术将融合基因片段重组于pET42a原核表达载体上,构建成pET42a-PI。经酶切、测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,IPTG诱导蛋白表达。表达产物经离子交换和分子筛纯化后进行Western blot分析,通过人外周血单核细胞玫瑰花结实验对融合蛋白进行了初步的活性测定。结果凝胶电泳显示PCR产物的长度约750 bp,测序结果表明,扩增片段与预期序列一致。重组菌在IPTG诱导下表达相对分子质量为28 kDa的蛋白,纯化后的融合蛋白能提高人外周血单核细胞玫瑰花结形成率,表明具有一定活性。结论成功克隆和构建了人胸腺素α原/白介素2融合基因的原核表达载体,并在原核表达系统中得到有效表达。     

PEP-1-EGFP融合蛋白的表达和纯化及其转导入人脐静脉内皮细胞

目的 表达并纯化融合蛋白PEP—1-EGFP以对其穿透细胞膜的能力进行研究。方法 用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b—pep—1—EGFP，在大肠杆菌Ecoli BL21（DE3）中表达融合蛋白PEP—1—EGFP并进行Ni^2＋-树脂柱亲和层析纯化以进行融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的实验。结果 经测序证实成功构建了表达型载体pET15b—pep—1—EGFP,PEP—1—EGFP融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达，纯化后的蛋白浓度为6．18mg／ml，蛋白产量为14．15mg／100ml菌液，SDS—PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为融合蛋白PEP—1—EGFP，细胞膜穿透实验证实PEP—1—EGFP融合蛋白能进入人脐静脉内皮细胞。结论 PEP—1—EGFP融合蛋白的表达和纯化及其穿膜能力的研究为PEP-1携带有生物活性的大分子物质进行蛋白治疗奠定了基础。     

TAT-EGFP融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coli BL21中高效表达并纯化.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白.结果及结论:成功地构建了TAT-EGFP融合蛋白的原核表达载体,在诱导后获得了高效表达并纯化,为进一步研究TAT的蛋白转导作用奠定了基础.     

人晚期糖基化终产物受体胞质内段融合蛋白表达载体的构建与表达

目的 构建人晚期糖基化终产物受体胞质内段(hRAGE-C)GST融合蛋白的重组原核基因表达载体并进行表达与纯化，研究其功能并鉴定与其相互作用的蛋白。方法 采用PCR方法扩增hRAGE基因编码区的胞质内段。并将其重组于pGEX-KG载体中。重组质粒经PCR、酶切、序列鉴定分析后，转化大肠杆菌BL21，以异丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导产生hRAGE胞质内段的GST融合蛋白。结果 PCR、酶切和测序结果表明所克隆的GST／hRAGE-C原核表达载体完全正确，继而表达、纯化获得了相对分子质量约35000的融合蛋白(符合预期大小)。结论 将hRAGE胞质内段构建于含有GST标记的载体上并获得融合蛋白的高效表达。     

TAT-SOD融合蛋白表达载体的构建

目的:构建pET28a-TAT-SOD原核表达载体,纯化并测定其活性。方法:PCR法扩增TAT-SOD片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT-SOD重组表达子,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导TAT-SOD融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE电泳鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白,利用SOD活性测定试剂盒测定其活性。结果:构建了高表达重组子pET28a-TAT-SOD,获得了相对分子质量约为25000的具有活性的融合蛋白TAT-SOD,纯度达90%。纯化的蛋白浓度为700mg/L,活性为197.54U/L。结论:成功构建了具有活性TAT-SOD融合蛋白的表达载体。     

Purification and immunity analysis of recombinant 6His-HPT protein expressed in E. coli

Objective To obtain HPT protein (Hygromycin B Phosphotmnsferase), a kind of plant selective maker gene product expressed from E.coli and to prepare the polyclonal antibody (pAbs) against it. Methods HPT cDNA fragment was obtained by PCR and was inserted into the prokaryotic expressing vector pBV222. Then the constructed recombinant plasmid pBV222-HPT was transfered into E.coli DH5α for HPT expression. The recombinant expressing system was confirmed by restriction endonuclease digestion, DNA sequencing and protein expression. E.coli cells were lysed by sonication and detergent dissolution. After cell membrane was extracted, the inclusion bodies were denatured by 8 mol/L Urea and purified with metal chelate affinity chromatography on Ni-NTA agarose under denaturing condition. The purified 6His-HPT was characterized by SDS-PAGE, and used to immunize rabbit. The titer and specificity of antisera were detected by ELISA and Western blot respecitively. Results Analysis of DNA sequence and restricted enzymes showed that the sequence of PBV222-HPT plasmid was correct. The amount of recombinant HPT expressed in E.coli accounted for 30% of total cellular proteins. From 1 liter of fermentative bacteria about 22 milligrams of pure recombinant HPT was isolated with purity above 95%. The recombinant HPT protein could produce high titer antiserum in rabbits and show good immunity activity. Western blot showed specific binding reaction between the antiserum to the purified 6His-HPT protein and their expressed products (plants protein and bacterial protein). Conclusion HPT protein can be expressed and purified from E.coli by a relatively simple method, which has high immunity activity.     

鸡Tie-2受体胞外片段的原核表达及目的蛋白免疫原性的研究

目的研究鸡Tie-2受体胞外片段(配体结合域)的原核表达以及目的蛋白对小鼠的抗原性。方法用PCR方法从既往构建的包含鸡Tie-2受体胞外段基因的表达质粒扩增目的片段，进而构建PQE原核表达载体并诱导其目的蛋白的表达，将目的蛋白进一步纯化、复性并免疫小鼠，获得抗血清，用ELISA和Western blotting检测抗血清中抗体的存在。结果经酶切分析及测序鉴定表明获得了鸡Tie-2受体胞外目的片段的PQE原核表达载体，能高效表达目的蛋白，将其免疫小鼠可产生抗重组蛋白的抗体。结论用原核表达的方式可成功的获得鸡Tie-2受体胞外目的片段的蛋白，并对小鼠产生免疫原性。     

人L-ficolin基因重组蛋白的表达及功能研究

目的:构建人L-ficolin基因的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。方法:用PCR方法从质粒pCDNA3-L-ficolin中扩增L-ficolin cDNA片断,并将该片断插入pGEX-KG原核表达载体中,以进行插入基因的融合表达,表达后再用Thrombin切除GST以得到单纯的L-ficolin蛋白,SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定,并以细菌侵袭试验检测所得蛋白的生物学活性。结果:酶切结果证实,成功地构建了pGEX-KG-L-ficolin原核表达载体,并使之在大肠杆菌中获得稳定的表达,表达产物的分子质量(Mr)与预期值相一致。原核表达的L-ficolin蛋白具有调理吞噬作用,促进吞噬细胞吞噬细菌的能力,L-ficolin调理吞噬能力呈剂量依赖关系,并显著高于对照蛋白。结论:成功地构建了重组表达载体pGEX-KG-L-ficolin,经过Thrombin作用后得到的L-ficolin蛋白具有生物学活性,为进一步研究人L-ficolin的功能奠定了基础。     

A型流感病毒核蛋白原核表达载体的构建与表达

目的:构建A型流感病毒核蛋白(NP)的原核表达质粒,分析其在大肠杆菌中的表达状况.方法:采用逆转录聚合酶链式反应技术从A型流感病毒基因组中扩增出编码核蛋白的基因片段,克隆至pGEM-T Easy载体,PCR筛选阳性克隆并测序.经酶切后将目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL2(CDE3),PCR和酶切鉴定转化菌落.将阳性菌落经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析目的蛋白的表达.结果:RT-PCR扩增出NP基因序列,将其亚克隆至表达载体pGEX-4T-1构建成重组表达质粒,并在BL2(CDE3)中表达了NP融合蛋白.结论:成功构建A型流感病毒NP的重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达了NP融合蛋白.     

TAT-EGFP融合蛋白的表达及在PC12细胞的转导活性

目的:构建pET28a-TAT-EGFP重组子,观察表达的融合蛋白TAT-EGFP在细胞内的转导活性.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后再连接EGFP基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达,组氨酸亲和层析柱纯化.将融合蛋白加入培养的PC12细胞,观察荧光进入细胞的情况.结果:成功地构建了高表达pET28a-TAT-EGFP重组子,纯化了分子质量约为29 ku的融合蛋白TAT-EGFP,并在体外培养的PC12细胞中证实TAT-EGFP融合蛋白穿透生物膜的能力.结论:通过对TAT-EGFP融合蛋白的表达纯化及活性分析,证实了TAT的蛋白转导作用,为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础.