结蛋白对非洲爪蛙胚胎早期发育的影响

目的:探讨结蛋白对非洲爪蛙胚胎早期发育的影响?方法:利用实时定量RT-PCR和原位杂交方法检测结蛋白在胚胎发育各阶段的表达;通过显微注射特异性反义寡核苷酸进行敲降,利用原位杂交和实时定量RT-PCR方法检测各胚层标志基因表达的变化?结果:结蛋白低水平表达起始于囊胚期,自神经胚期起表达量增加,在随后的发育阶段持续高表达;结蛋白敲降导致胚孔闭合延迟,胚层相关标志基因的表达受抑制?结论:结蛋白自囊胚期起表达于非洲爪蛙胚胎发育各阶段,敲降结蛋白导致胚胎发育迟缓,胚层分化受抑     

ETS1对非洲爪蛙早期胚胎发育的影响

目的:通过在非洲爪蛙胚胎中过表达ETS1探讨该基因对爪蛙胚胎早期发育的影响?方法:将克隆PCR获得的ETS1全长片段连接到质粒上,获得pCS2+-ETS1质粒;利用RT-PCR和Western blot检测ETS1 mRNA和蛋白在胚胎发育不同时期的表达情况;显微注射ETS1 mRNA入爪蛙胚胎,利用整胚原位杂交?定量PCR检测胚层标志性基因的表达;通过Western blot检测过表达ETS1对细胞凋亡和增殖的影响?结果:ETS1从受精卵时期即已开始表达,在器官形成期表达增强,过表达ETS1抑制了细胞分化以及神经胚期中胚层和外胚层标志基因表达,凋亡相关蛋白表达增加,增殖相关蛋白无明显变化?结论:ETS1表达于非洲爪蛙胚胎发育各阶段,过表达ETS1抑制了中胚层和外胚层发育,促进细胞凋亡但不影响细胞增殖?     

XBP1在非洲爪蟾胚胎发育中的作用

目的：探讨X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1)对非洲爪蟾胰腺发育的影响。方法：利用western blot,原位杂交和免疫染色方法检测XBP1在胚胎发育各个阶段的表达;通过显微注射基因特异性反义寡核苷酸实现基因敲降,利用RT-PCR和整体胚胎原位杂交方法检测基因表达变化。结果：XBP1主要表达于非洲爪蟾胚胎发育中的神经、前肾、胰腺等器官中;敲降XBP1s在胚胎发育早期影响非洲爪蟾胚层形成相关基因,在胚胎发育后期影响胰腺发育相关基因。结论：XBP1s在胚胎发育早期影响胚层形成,在晚期影响胰腺的发育。     

XBPl在非洲爪蟾胚胎发育中的作用

目的：探讨Ｘ盒结合蛋白１（Ｘ-ｂｏｘ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １,ＸＢＰ１）对非洲爪蟾胚胎发育的影响。方法：利用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、原位杂交和免疫染色法检测ＸＢＰ１在胚胎发育各个阶段的表达;通过显微注射基因特异性反义寡核苷酸实现基因敲降,利用ＲＴ-ＰＣＲ和整体胚胎原位杂交法检测基因表达变化。结果：ＸＢＰ１主要表达于非洲爪蟾胚胎发育期的神经、前肾、胰腺等器官中;敲降ＸＢＰ１ｓ在胚胎发育早期影响非洲爪蟾胚层形成相关基因,在胚胎发育后期影响胰腺发育相关基因。结论：ＸＢＰ１ｓ在胚胎发育早期可能影响胚层形成,在晚期可能影响胰腺的发育。     

IRE1α 影响非洲爪蟾胰腺发育

目的:探讨肌醇依赖性激酶1α(inositol requiring enzyme 1α,IRE1α)对非洲爪蟾胰腺发育的影响?方法:通过显微注射基因特异性反义寡核苷酸实现基因敲降;利用整体胚胎原位杂交方法检测基因表达? 结果:IRE1α表达于爪蟾发育中的胰腺;利用基因特异性反义寡核苷酸敲降IRE1α后,非洲爪蟾肠道明显异常,胰腺内外分泌标志性基因胰岛素?淀粉酶表达显著减少;胰腺前体细胞的标志基因pdx1和p48表达明显减少;敲降IRE1α下游基因X-盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)后,非洲爪蟾的胰岛素?淀粉酶表达也明显减少?结论:IRE1α影响非洲爪蟾胰腺发育,可能通过XBP1发挥作用?     

DNA甲基化修饰对非洲爪蛙胚层分化的影响

目的：探讨DNA甲基化修饰对非洲爪蛙三个胚层分化的影响。方法：用30 μmol/L 的5?氮杂?2’?脱氧胞苷（5?AZA?CdR）处理胚胎,抑制早期胚胎细胞内DNA甲基化转移酶1（DNA methyltransferase 1,DNMT1）的活性,观察胚胎的表型,并收集原肠期胚胎通过原位杂交检测三胚层标记基因的表达情况;显微注射DNMT1特异的反义寡核苷酸（DNMT1MO）以敲降胚胎细胞内DNMT1的表达,然后通过原位杂交检测胚层标记基因的表达情况。结果：5?AZA?CdR处理导致胚胎早期发育异常,抑制中胚层标记基因Xbra的表达。敲降DNMT1促进背部中胚层标记基因GSC和Chordin的表达,抑制腹部中胚层标记基因Wnt8的表达。结论：DNA甲基化转移酶参与调节非洲爪蛙三胚层分化形成的过程。     

ETS1/2对非洲爪蛙胰腺发育的影响

目的：探讨ETS1/2对非洲爪蛙胚胎胰腺发育的影响。方法：设计并合成特异性抑制ETS1/2表达的反义吗啉代寡核苷酸(morpholino oligonueleitide,MO),通过显微注射的方法将MO转入爪蛙胚胎,利用整胚原位杂交和定量RT-PCR检测标志性基因的表达变化。结果：单独敲降ETS1或ETS2对爪蛙胚胎发育无明显影响,共同敲降ETS1/2后会使爪蛙胚胎发育异常,胰腺标志基因表达上升,肠道标志基因表达下降,肝脏和胃标志基因无明显变化;胰腺标志基因ngn3、igf1、foxa1的启动子区存在ETS1/2的结合位点。结论：单独敲降ETS1或ETS2对爪蛙胚胎发育无明显影响,敲降ETS1/2促进爪蛙胚胎胰腺发育,抑制肠道发育,对肝脏和胃的发育无明显影响。     

组蛋白去乙酰化修饰对非洲爪蛙胚胎发育及胚层分化的影响

目的：探讨组蛋白乙酰化修饰对非洲爪蛙胚胎早期发育以及三胚层分化的影响。方法：用400 nmol/L 的曲古抑菌素A（trichostation A,TSA）处理2细胞时期的胚胎,观察胚胎发育的情况,并通过整体原位杂交的方法检测胚层标记基因的表达;通过显微注射组蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase 1,HDAC1）特异性的反义寡核苷酸（HDAC1MO）实现HDAC1基因的敲降,利用整体原位杂交检测胚层标记基因的表达。结果：TSA处理造成胚胎发育异常,TSA处理和敲降HDAC1影响胚层标记基因的表达。结论：组蛋白去乙酰化酶在胚胎早期发育的过程中参与胚层的分化。     

IRE1α 通过UPR 影响非洲爪蟾胚胎发育

目的:探讨IRE1α在非洲爪蟾胚胎发育中是否介导未折叠蛋白反应(UPR),并在衣霉素(tunicamycin,TM)诱导的胚胎发育畸形中发挥挽救作用?方法:利用TM处理胚胎激发内质网应激;应用显微注射mRNA方法实现基因过表达,通过注射特异的反义寡核苷酸morpholino(MO)实现基因封闭;RT-PCR检测XBP1 剪切情况?结果:XBP1 剪切随IRE1α过表达及封闭而增加或减少;TM处理导致胚胎发育畸形,XBP1剪切增加,封闭XBP1可部分挽救发育畸形;封闭IRE1a可明显挽救发育畸形,XBP1剪切恢复?结论:IRE1α在非洲爪蟾胚胎发育中介导UPR,封闭IRE1α可逆转TM诱导的胚胎发育畸形,部分通过XBP1途径发挥作用?     

zili在斑马鱼早期胚胎发育胚层分化中作用的初步研究

目的 探讨斑马鱼胚胎发育早期,piwil2基因(zili)对外胚层、中胚层、内胚层分化的影响.方法 设计并合成zili-MO和zili-cMO两条吗啡啉修饰的反义核苷酸,构建zili基因的表达载体并体外合成mRNA.制备外、中、内胚层标志基因(gsc、eve1、sox17)的反义RNA探针.对单细胞期胚胎分别进行显微注射zili-MO、zili-cMO或zili mRNA,采用整胚原位杂交技术检测标志基因的表达变化.结果 整胚原位杂交检测结果表明,在注射了zili-MO后zili表达下调,外胚层及中胚层标志基因gsc的表达减弱.外胚层标志基因eve1的表达增强,表达sox17基因的内胚层细胞数量减少.在注射了zili mRNA后zili表达上调,外胚层及中胚层标志基因gsc的表达增强,外胚层标志基因evel的表达减弱,表达sox17基因的内胚层细胞数量减少.结论 zili在胚胎发育早期对外胚层、中胚层、内胚层的分化均起到了一定的作用,而且对于维持正常胚胎发育也具有重要作用.     

黑素瘤抑制蛋白启动子在小鼠体内的表达活性

目的;观察黑素瘤抑制蛋白（ＭＩＡ／ＣＤ－ＲＡＰ）启动子在小鼠体内的表达活性。方法：利用ＰＣＲ技术扩增２．２ｋｂ的ＭＩＡ／ＣＤ－ＲＡＰ启动子,分子克隆技术构建ＭＩＡ启动子－半乳糖苷酶（２．２１ａｃＺ）载体,显微注射法将纯化的２．２ｌａｃＺ ＤＮＡ注入来自Ｂ６ＳＪＬ杂交小鼠受精卵的原以制备转基因小鼠。提取幼鼠尾ＤＮＡ,用ｌａｃＺ特异性引物筛选阳性转基因小鼠。结果：８只首建小鼠以体基因组整合有２．２ｌａ     

敲低造血前B细胞白血病转录因子相互作用蛋白对胰腺癌细胞增殖、周期和凋亡的影响

目的 探讨造血前B细胞白血病转录因子相互作用蛋白(HPIP)对胰腺癌细胞增殖、周期及凋亡的影响。方法 采用免疫组织化学染色方法检测胰腺癌组织及对应癌旁组织中HPIP的表达水平,小干扰RNA瞬时转染的方法敲低胰腺癌细胞中HPIP的表达水平,细胞计数试剂盒-8实验、克隆形成实验、流式细胞术检测敲低HPIP对细胞增殖、周期及凋亡的影响,免疫印迹法检测敲低HPIP对于cyclin D1、caspase 7和cleaved caspase 7表达水平的影响。结果 胰腺癌组织中HPIP的表达明显高于癌旁组织(Z=-2.060,P=0.039)。敲低HPIP表达水平后,在24 h起MIA PaCa-2和BxPC-3细胞的生长受到抑制(P均<0.05);MIA PaCa-2(t=4.706,P=0.009)和BxPC-3细胞(t=9.514,P=0.000)形成的阳性克隆数明显减少;MIA PaCa-2(t=7.642,P=0.001)及BxPC-3细胞(t=2.714,P=0.051)中S期细胞比例明显降低,G₀/G₁ 期细胞比例明显增加(t=3.244,P=0.031;t=6.095,P=0.003);MIA PaCa-2(t=24.58,P=0.000;t=29.43,P=0.000)和BxPC-3细胞(t=36.45,P=0.000;t=43.52,P=0.000)中的晚期凋亡率和总凋亡率均明显上升;MIA PaCa-2(t=6.705,P=0.002)和BxPC-3细胞(t=6.238,P=0.003)的cyclin D1表达水平明显下降,caspase 7表达水平变化无统计学意义(t=0.711,P=0.516;t=0.027,P=0.979),cleaved caspase 7表达水平明显上升(t=3.991,P=0.016;t=6.536,P=0.002)。结论 与癌旁组织相比,HPIP在胰腺癌中表达水平较高。敲低HPIP可导致胰腺癌细胞生长受到抑制,细胞周期由G₀/G₁期向S期转化受阻,并促进胰腺癌细胞凋亡。HPIP可能在胰腺癌中发挥癌基因作用。     

黑素瘤抑制蛋白在转基因小鼠胚胎乳腺组织中的表达

目的：检测黑素瘤抑制蛋白（ＭＩＡ／ＣＤ－ＲＡＰ）在小鼠胚胎乳腺组织中的表达。方法：剖腹分离出１０．５－１６．５ｄ的ＭＩＡ－ＣＤ／ＲＡＰ启动子－半乳糖苷酶（２．２１ｌａｃＺ）转基因小鼠胚胎,利用Ｘ－ｇａｌ全胚胎染色观察转基因的组织和细胞染色,并以免疫组织化学染色检测内源性ＭＩＡ／ＣＤ－ＲＡＰ蛋白在胚胎乳腺组织叫的表达。结果：ＭＩＡ／ＣＤ－ＲＡＰ在孕期１１．５ｄ的小鼠胚胎乳腺上皮细胞中开始表达,至１３     

hand2 基因对斑马鱼胚胎发育影响的实验研究

  目的 观察hand2在斑马鱼胚胎内的表达情况，验证显微注射吗啡啉修饰的反义寡核苷酸（Morpholino oligonucleotides，MO）使hand2 表达下调的有效性。观察hand2 表达下调后斑马鱼胚胎发育的异常表型，初步探讨hand2在斑马鱼胚胎发育中的作用，为利用斑马鱼开展hand2的功能研究提供线索。 方法 采用胚胎整体原位杂交的方法观察hand2在斑马鱼胚胎内的表达情况。利用向斑马鱼受精卵显微注射MO的方法使hand2 表达下调，并进行hand2 表达下调的效率验证。将斑马鱼单细胞受精卵分为四组进行显微注射，即对照MO（Con MO）注射组、hand2 MO注射组、hand2-GFP mRNA注射组和hand2-GFP mRNA+hand2 MO注射组。在荧光显微镜下观察hand2-GFP mRNA注射组和hand2-GFP mRNA+hand2 MO注射组的荧光表达情况以验证hand2 表达下调的效率。在显微镜下观察hand2 MO注射组斑马鱼胚胎的各器官发育情况并进行评定。 结果 hand2在斑马鱼胚胎的侧板中胚层、咽弓、心脏和鳍有较强表达。hand2-GFP mRNA注射组在8hpf（hours post fertilization）时胚胎有较强的荧光表达，而hand2-GFP mRNA+hand2 MO注射组胚胎几乎无荧光表达。与Con MO注射组相比，hand2 MO注射组斑马鱼胚胎的心脏、血管、血细胞、鳍以及体节有明显的发育异常。 结论 向斑马鱼受精卵显微注射hand2 MO的方法可有效的使 hand2表达下调。hand2 在斑马鱼胚胎的心脏、血管、血细胞、鳍以及体节的发育过程中有重要作用。     

Inhibitory effect of live-attenuated Listeria Monocytogenes-based vaccines expressing MIA gene on malignant melanoma

Listeria monocytogenes(LM),a Gram-positive facultative intracellular bacterium,can be used as an effective exogenous antigen expression vector in tumor-target therapy.But for successful clinical application,it is necessary to construct attenuated LM stain that is safe yet retains the potency of LM based on the full virulent pathogen.In this study,attenuated LM and recombinants of LM expressing melanoma inhibitory activity(MIA) were constructed successfully.The median lethal dose(LD 50) and invasion efficiency of attenuated LM strains were detected.The recombinants were utilized for immunotherapy of animal model of B16F10 melanoma.The level of MIA mRNA expression in tumor tissue was detected by using real-time polymerase chain reaction(PCR) with specific sequence,meanwhile the anti-tumor immune response was assayed by flow cytometric analysis and enzyme-linked immunosorbent spot(ELISPOT) assay.The results showed the toxicity and invasiveness of attenuated LM were decreased as compared with LM,and attenuated LM expressing MIA,especially the double-genes attenuated LM recombinant,could significantly induce anti-tumor immune response and inhibit tumor growth.This study implicates attenuated LM may be a safer and more effective vector for immunotherapy of melanoma.     

靶向敲减Ras癌蛋白融合型泛素连接酶E3的构建

目的应用蛋白质敲减技术原理,构建理论上能够靶向敲减Ras癌蛋白的融合型泛素连接酶E3的真核表达载体。方法选取Raf-1、PI3K、RalGDS中能够与Ras蛋白相互作用的结合结构域和具有泛素连接酶活性的F-Box及U-Box作为功能结构域,采用分子克隆技术依次将其连入pcDNA3.1中构建融合蛋白表达载体,双酶切、PCR和测序技术检测连入核苷酸片段的正确性,Western blot检测融合蛋白表达载体在真核细胞内表达的正确性和作用有效性。结果成功获得6个融合蛋白E3表达载体,5个能够在真核细胞内有效表达,其中(RBD+CRD)Raf-1-U-Box-pcDNA3.1能够敲减人胰腺癌细胞系PANC-1细胞中Ras蛋白。结论成功构建能够靶向敲减Ras癌蛋白的融合蛋白表达载体,为下一步应用蛋白质敲减技术奠定了实验基础。     

斑马鱼Tbx2基因阻抑先天性心脏病模型的建立与研究

目的建立斑马鱼Tbx2基因阻抑先天性心脏病动物模型,并研究Tbx2基因对心脏发育的影响。方法通过吗啉环寡聚核苷酸显微注射介导的翻译抑制,观察Tbx2基因阻抑胚胎的心脏发育,并通过心脏特异性分子标记整胚原位杂交技术进一步阐明Tbx2在心脏发育中的作用。结果600枚Tbx2基因阻抑的斑马鱼胚胎受精后8h27．2％（163／600）胚胎死亡,24～96h出现轻、中、重度不同程度的心脏发育异常,比例分别为21．3％（128／600）、32．8％（197／600）、18．7％（112／600）,心脏缺陷包括心室发育不良、心房扩张、房室区异常、心率缓慢、心律不齐、血液反流等,整胚原位杂交结果显示了房室区特异性分子标记多能聚糖（versican）基因表达的异常。结论斑马鱼是研究心脏发育的理想模式生物,吗啉环寡聚核苷酸基因阻抑是研究基因功能的良好方法。Tbx2基因在房室特异性分化和房室管形成方面起了重要的作用。