XBP1在非洲爪蟾胚胎发育中的作用

目的：探讨X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1)对非洲爪蟾胰腺发育的影响。方法：利用western blot,原位杂交和免疫染色方法检测XBP1在胚胎发育各个阶段的表达;通过显微注射基因特异性反义寡核苷酸实现基因敲降,利用RT-PCR和整体胚胎原位杂交方法检测基因表达变化。结果：XBP1主要表达于非洲爪蟾胚胎发育中的神经、前肾、胰腺等器官中;敲降XBP1s在胚胎发育早期影响非洲爪蟾胚层形成相关基因,在胚胎发育后期影响胰腺发育相关基因。结论：XBP1s在胚胎发育早期影响胚层形成,在晚期影响胰腺的发育。     

IRE1α 通过UPR 影响非洲爪蟾胚胎发育

目的:探讨IRE1α在非洲爪蟾胚胎发育中是否介导未折叠蛋白反应(UPR),并在衣霉素(tunicamycin,TM)诱导的胚胎发育畸形中发挥挽救作用?方法:利用TM处理胚胎激发内质网应激;应用显微注射mRNA方法实现基因过表达,通过注射特异的反义寡核苷酸morpholino(MO)实现基因封闭;RT-PCR检测XBP1 剪切情况?结果:XBP1 剪切随IRE1α过表达及封闭而增加或减少;TM处理导致胚胎发育畸形,XBP1剪切增加,封闭XBP1可部分挽救发育畸形;封闭IRE1a可明显挽救发育畸形,XBP1剪切恢复?结论:IRE1α在非洲爪蟾胚胎发育中介导UPR,封闭IRE1α可逆转TM诱导的胚胎发育畸形,部分通过XBP1途径发挥作用?     

MIA影响非洲爪蟾胚胎中胚层的形成

目的:探讨黑色素瘤抑制蛋白(melanoma inhibitory activity,MIA)在非洲爪蟾早期胚胎发育中的作用?方法:根据热带爪蟾MIA序列在非洲爪蟾EST数据库中找到MIA序列,利用RT-PCR扩增全长序列并克隆至pCS2+,用于测序?利用RT-PCR检测胚胎发育各阶段MIA mRNA的表达?通过显微注射特异的反义寡核苷酸morpholino(MO)敲降MIA;利用整胚原位杂交检测胚层标志性基因的表达?结果:克隆出非洲爪蟾MIA全长序列?在胚胎发育过程中MIA从受精卵开始持续表达?敲降MIA导致胚胎胚孔闭合延缓,中胚层标志基因xbra表达明显受抑,而内胚层标志性基因sox17α表达无明显改变?结论:MIA表达于非洲爪蟾胚胎发育各阶段,敲降MIA抑制中胚层的形成?     

XBPl在非洲爪蟾胚胎发育中的作用

目的：探讨Ｘ盒结合蛋白１（Ｘ-ｂｏｘ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １,ＸＢＰ１）对非洲爪蟾胚胎发育的影响。方法：利用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、原位杂交和免疫染色法检测ＸＢＰ１在胚胎发育各个阶段的表达;通过显微注射基因特异性反义寡核苷酸实现基因敲降,利用ＲＴ-ＰＣＲ和整体胚胎原位杂交法检测基因表达变化。结果：ＸＢＰ１主要表达于非洲爪蟾胚胎发育期的神经、前肾、胰腺等器官中;敲降ＸＢＰ１ｓ在胚胎发育早期影响非洲爪蟾胚层形成相关基因,在胚胎发育后期影响胰腺发育相关基因。结论：ＸＢＰ１ｓ在胚胎发育早期可能影响胚层形成,在晚期可能影响胰腺的发育。     

ETS1/2对非洲爪蛙胰腺发育的影响

目的：探讨ETS1/2对非洲爪蛙胚胎胰腺发育的影响。方法：设计并合成特异性抑制ETS1/2表达的反义吗啉代寡核苷酸(morpholino oligonueleitide,MO),通过显微注射的方法将MO转入爪蛙胚胎,利用整胚原位杂交和定量RT-PCR检测标志性基因的表达变化。结果：单独敲降ETS1或ETS2对爪蛙胚胎发育无明显影响,共同敲降ETS1/2后会使爪蛙胚胎发育异常,胰腺标志基因表达上升,肠道标志基因表达下降,肝脏和胃标志基因无明显变化;胰腺标志基因ngn3、igf1、foxa1的启动子区存在ETS1/2的结合位点。结论：单独敲降ETS1或ETS2对爪蛙胚胎发育无明显影响,敲降ETS1/2促进爪蛙胚胎胰腺发育,抑制肠道发育,对肝脏和胃的发育无明显影响。     

结蛋白对非洲爪蛙胚胎早期发育的影响

目的:探讨结蛋白对非洲爪蛙胚胎早期发育的影响?方法:利用实时定量RT-PCR和原位杂交方法检测结蛋白在胚胎发育各阶段的表达;通过显微注射特异性反义寡核苷酸进行敲降,利用原位杂交和实时定量RT-PCR方法检测各胚层标志基因表达的变化?结果:结蛋白低水平表达起始于囊胚期,自神经胚期起表达量增加,在随后的发育阶段持续高表达;结蛋白敲降导致胚孔闭合延迟,胚层相关标志基因的表达受抑制?结论:结蛋白自囊胚期起表达于非洲爪蛙胚胎发育各阶段,敲降结蛋白导致胚胎发育迟缓,胚层分化受抑     

组蛋白去乙酰化修饰对非洲爪蛙胚胎发育及胚层分化的影响

目的：探讨组蛋白乙酰化修饰对非洲爪蛙胚胎早期发育以及三胚层分化的影响。方法：用400 nmol/L 的曲古抑菌素A（trichostation A,TSA）处理2细胞时期的胚胎,观察胚胎发育的情况,并通过整体原位杂交的方法检测胚层标记基因的表达;通过显微注射组蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase 1,HDAC1）特异性的反义寡核苷酸（HDAC1MO）实现HDAC1基因的敲降,利用整体原位杂交检测胚层标记基因的表达。结果：TSA处理造成胚胎发育异常,TSA处理和敲降HDAC1影响胚层标记基因的表达。结论：组蛋白去乙酰化酶在胚胎早期发育的过程中参与胚层的分化。     

DNA甲基化修饰对非洲爪蛙胚层分化的影响

目的：探讨DNA甲基化修饰对非洲爪蛙三个胚层分化的影响。方法：用30 μmol/L 的5?氮杂?2’?脱氧胞苷（5?AZA?CdR）处理胚胎,抑制早期胚胎细胞内DNA甲基化转移酶1（DNA methyltransferase 1,DNMT1）的活性,观察胚胎的表型,并收集原肠期胚胎通过原位杂交检测三胚层标记基因的表达情况;显微注射DNMT1特异的反义寡核苷酸（DNMT1MO）以敲降胚胎细胞内DNMT1的表达,然后通过原位杂交检测胚层标记基因的表达情况。结果：5?AZA?CdR处理导致胚胎早期发育异常,抑制中胚层标记基因Xbra的表达。敲降DNMT1促进背部中胚层标记基因GSC和Chordin的表达,抑制腹部中胚层标记基因Wnt8的表达。结论：DNA甲基化转移酶参与调节非洲爪蛙三胚层分化形成的过程。     

ETS1在多巴胺能神经元发育中的作用

【立论依据】 帕金森病是第二大神经系统退行性病变,主要多发于60岁以上的老年人。其基本病理改变是特异性多巴胺能神经元因各种原因渐行性退变坏死,数量减少,致使多巴胺释放减少,但具体机制不明。从多巴胺能神经元发育的角度或许能解释多巴胺释放减少的分子机制。多巴胺神经元发育的各个阶段都有转录因子基因参与调控, 如SHH、FGF、Nurr1、Pitx3、Mash1 等。这些因子决定了多巴胺能神经元发育的命运并控制了一些重要的发育过程。作为转录因子,ETS1表达于发育中的脑组织。在前期研究发现ETS1影响胚胎神经发育的基础上,过表达ETS1抑制酪氨酸羟化酶(TH)的表达。但ETS1在多巴胺能神经元发育的哪一阶段发挥作用,如何发挥作用均未阐明。 【设计思路】 利用非洲爪蟾作为模式动物,通过过表达或封闭ETS1表达,检测在多巴胺能神经元发育的不同阶段标志基因的表达,探讨ETS1影响多巴胺能神经元发育的阶段;进而寻找ETS1的下游靶基因。 【实验内容】 选择分裂良好的非洲爪蟾胚胎,利用显微注射方法注射ETS1 mRNA或反义寡核苷酸,实现ETS1的过表达或基因封闭,在神经发育的不同阶段收集胚胎,提取RNA或蛋白质,利用定量RT-PCR、整胚原位杂交及蛋白质印迹方法检测标志基因的表达改变。之后,通过萤光素酶报告基因方法检测ETS1对其靶基因的转录调控。 【材料】 非洲爪蟾胚胎,ETS1 mRNA、反义寡核苷酸,原位杂交用探针及其他试剂,RT-PCR、蛋白质印迹试剂,报告基因检测系统,其他常规试剂。 【可行性】 本课题建立在前期预实验的基础上,研究方向明确;非洲爪蟾胚胎体积大,易于进行显微注射;胚胎在体外发育,便于随时观察表型。 【创新性】 发现新的调节多巴胺能神经元发育的转录因子ETS1及其作用机制,为探讨帕金森病的发生机理提供新的线索。     

KLF7b对斑马鱼胚胎发育的影响

目的：探讨KLF7b对斑马鱼胚胎发育的影响。方法：体外转录野生型KLF7b mRNA、KLF7b 乙酰化位点突变体mRNA;设计合成特异性KLF7b反义吗啉代寡核苷酸（morpholino oligonueleitide,MO）;在1~2细胞期注射到斑马鱼胚胎体内以实现KLF7b的过表达、位点突变与敲降;观察胚胎表型并利用定量PCR检测发育相关基因的表达变化,钙黄绿素染色观察斑马鱼骨骼发育情况。结果：过表达KLF7b对斑马鱼胚胎的发育无明显影响;敲降KLF7b或注射乙酰化位点突变的KLF7b后,斑马鱼胚胎出现心包积液、体轴和头部发育的异常,肌肉发育标志基因表达下调。结论：KLF7b可通过乙酰化修饰影响斑马鱼的发育。