GRP94表达在肺癌细胞对VP-16化疗耐药中的作用

[目的]检测在Ca2+拮抗剂A23187诱导下,人肺腺癌细胞SPCA1中GRiP94的表达水平,并分析其表达在肺癌细胞对VP-16耐药中的作用.[方法]采用RT-PCR、免疫荧光细胞化学方法检测不同浓度A23187处理组细胞的GRP94核酸及蛋白表达,用MTT法测定细胞在VP-16作用下的生存率.[结果]A23187可...     

胰岛素样生长因子I 受体反义寡核苷酸对肺癌NCI—H460细胞中该受体蛋白表达的影响

目的：探讨胰岛素样生长因子I受体（IGF～IR）反义寡核苷酸（ASODN）对肺癌NCI—H460细胞中IGF～IR堡内表达的影响。方法：设计并合成3条IGF～IR反义寡核苷酸序列，转染NCI—H460细胞，另设无关的IGF～IR反义寡核苷酸序列和空白培养液作对照，细胞培养48h后，蛋白酶消化收集细胞，滴于预处理的载玻片匕。米用免疫细胞化学SP法检测各组NCI—H460细胞中IGF—IIR的蛋白表达。结果：3条IGF—IRASODN转染的NCI～H460细胞中IGF-IR蛋白表达差异无统计学意义（P〉0．05），但均低于无关寡核苷酸转染组及空白培养液对照组（P〈0.05）。结论：IGF—IR ASODN可抑制啼癌NCI—H460细胞中IGF—IR蛋白的表达。     

5F对非小细胞肺癌NCI-H460细胞survivin、p65和bcl-2mRNA的影响

目的：研究5F对非小细肺癌NCI—H460细胞survivin、p65和bcl-2mRNA水平的影响。方法：MTT法检测5F对NCI—H460细胞的生长抑制作用;用半定量RT—PCR方法检测survivin、p65及bcl一2mRNA水平的变化。结果：5F抑制NCI—H460细胞的生长,其效果与5F的浓度和作用时间相关,24、48、72h的IC50分别为：21．40、4．52、1．02μg·mL^-1：100μg·mL^-1。5F作用NCI—H460细胞6h后能引起survivinmRNA水平显著的降低（P〈0．05）,24h后出现增加（P〈0．05）;p65和bcl-2mRNA水平在作用3h就发生明显减少（P〈0．05）。结论：5F诱导NCI—H460细胞凋亡的机制可能是通过抑制survivin、p65和bcl-2mRNA水平来发挥作用的。     

钙离子载体联合GM．CSF体外诱导外周血单核细胞生成树突状细胞

目的：利用新型诱导剂钙离子载体A23187联合重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）体外诱导人外周血单核细胞（PBMC）生成树突状细胞（DCs）。方法：采用密度梯度离心法及黏附法分离出PBMC,按不同培养方法分成：传统方法组,rhGM-CSF＋重组人白介素-4（rhIL-4）＋重组人肿瘤坏死因子-α（rhTNF-α）;新型诱导剂组,加入rhGM—CSF4＋A23187。光镜观察细胞形态的变化,流式细胞仪检测DC细胞的表面标志,MTT比色法检测各组DCs刺激同种异体外周血T细胞增殖的能力。结果：与传统方法相比,A23187联合rhGM—CSF诱导培养的DCs更具有典型的树突形态;DC表面分子CD83D1a、CD86、CIM0表达（45．2％、31．5％、40．1％、36．4％）较传统方法组（16．9％、20．4％、26．5％、22．3％）明显上调（P〈0．05）,而CD14表达（5．7％vs19．0％）明显下降（P〈0．05）,刺激同种异体T细胞增殖的能力更强。结论：新型诱导剂钙离子载体A23187联合GM-CSF能更有效地诱导PBMC生成强效成熟的DCs。     

ABCE1基因通过RNaseL途径抑制人大细胞肺癌H460细胞凋亡

摘要：目的研究ABCEl基因表达对人大细胞肺癌H460细胞增殖、凋亡的影响并初步探讨其机制。方法体外培养H460细胞,分为A组（转染ABCE1-siRNA-1组）、B组（转染ABCEl-siRNA-2组）、C组（转染空质粒组）以及D组（空白对照组）。将构建好的ABCEl的siRNA（小干扰RNA）载体转染人培养的细胞中,荧光显微镜下观察转染效率,WesternBlot法检测ABCEl蛋白以及RNaseL蛋白的表达,RT—PCR法检测ABCElmRNA的表达,MTT法分析细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果将构建好的载体成功转入了H460细胞,转染后A、B组的细胞活性降低,ABCEl的表达受到阻断俨〈0．01）,RNaseL蛋白含量明显增加（P〈0．01）,细胞的增殖能力明显降低并逐渐凋亡（P〈0．01）。结论ABCEl基因可促使人大细胞肺癌H460细胞增殖并抑制细胞凋亡,其机制是阻断了2-5A／RNaseL细胞通路。     

蛋白激酶C在A23187诱导HL-60细胞分化为树突状细胞中的作用

目的 运用蛋白激酶C(PKC)特异性抑制剂Bis-1,初步探讨细胞内PKC信号途径在A23187诱导HL-60细胞向树突状细胞(dendritic cell,DC)分化过程中的作用,了解细胞内钙离子信号转导途径与PKC信号途径是否存在相互应答.方法 用PKC特异性抑制剂Bis-1预先处理HL-60细胞再用钙离子载体A23187处理,比较其与单用A23187处理的HL-60细胞在形态学、免疫表型及刺激T细胞增殖能力方面的差异.结果 单用A23187处理的HL-60细胞培养36 h后细胞出现树状突起,DC特异性标记CD83、CD80、CD86表达阳性率分别为(28.97±4.05)%、(19.10±5.46)%、(41.03±6.43)%;用PKC特异性抑制剂Bis-1预先处理再予A23187处理36h的HL-60细胞其形态、免疫表型及刺激T淋巴细胞增殖的能力均较单用A23187的HL-60细胞受到不同程度的抑制,细胞表面DC特异抗原CD83、CD80,CD86分子的阳性表达率分别降为(13.23±2.15)%、(9.70±1.69)%、(23.37±7.50)%,与单用A23187处理的HL-60细胞比较,差异有统计学意义(P均＜0.05).结论 PKC特异性抑制剂Bis-1在A23187诱导HL-60细胞分化为DC的过程中起抑制作用,表明PKC信号路径参与A23187诱导HL-60白血病细胞分化为DC的过程.     

肺癌细胞株E - cadherin的表达状态及其与启动子甲基化的关系

[目的]研究肺癌细胞株上皮钙粘蛋白(E - cadherin)的表达与基因启动子甲基化状态的关系.[方法]采用免疫细胞化学法检测肺癌细胞株NCI - H460、SPCA和A549的E- cadherin蛋白表达;半巢式甲基化特异性PCR法(MSP)和微流控芯片技术检测E- cadherin基因启动子甲基化状态.[结果]...     

TopoⅡα和Ⅱβ抑制剂诱导H460细胞G2/M周期阻滞的机制分析

目的 探讨TopoⅡα和Ⅱβ抑制荆诱导H460细胞的G2/M周期阻滞时其机制的异同.方法 分别以MTT法测定细胞的生长抑制率、以流式细胞术分析细胞周期和蛋白印迹法检测细胞内某些蛋白质的表达情况.结果 两种TopoⅡα抑制剂和一种topoⅡβ抑制剂都能够诱导H460细胞的G2/M周期阻滞和抑制其生长,都能够诱导细胞周期调节蛋白p-cdc的表达且呈剂量依赖性,但是,只有TopoⅡα抑制剂能够诱导H460细胞14-3-3σ的表达.结论 14-3-3σ有可能在TopoⅡα、Ⅱβ抑制剂诱导H460细胞的G2/M周期阻滞机制中起着关键作用,但需进一步的14-3-3σ功能抑制实验确定.     

A23187联合IFN-γ诱导人外周血单个核细胞生成树突状细胞

目的:研究钙离子载体(calcium ionophore, CI)A23187 联合γ- 干扰素(IFN-γ) 诱导健康人外周血单个核细胞(PBMNC) 生成树突状细胞(DC), 探索DC 扩增的新方法。方法:分离健康人PBMNC, 分别加入GM-CSF +IL-4, A23187, A23187+IFN-γ。体外培养72 h 后, 分别于光镜、电镜下观察细胞的形态, 流式细胞仪检测细胞表面标志, M 比色法检测其对同种异体T 细胞的刺激增殖作用, ELISA 检测IL-12 和IFN-γ 的水平。结果:健康人PBMNC在A23187+IFN-γ 的条件下培养72 h 后, 与GM-CSF +IL-4 组, A23187 组比较, 能迅速获得典型的树突状细胞形态;CD40, CD83, CD86 分子的表达较均明显升高(P<0.01), 但CD1a 分子的表达明显下降(P<0.01);具有明显刺激同种异体T 细胞增殖的能力;IL-12, IFN-γ 的水平比其他组明显增高(P<0.01)。结论:A23187 联合IFN-γ 诱导健康人PBMNC 能更快速、有效地诱导生成成熟的DC。     

葡萄糖调节蛋白78对胃癌SGC7901细胞侵袭和转移的影响

目的:探讨钙离子螯合剂BAPTA-AM和钙离子载体A23187对胃癌SGC7901细胞葡萄糖调节蛋白78(Glucose regulated protein,GRP78)表达水平的影响,分析GRP78表达改变对胃癌细胞侵袭转移能力的影响.方法:BAPTA-AM和A23187处理细胞,RT-PCR和Western-blot检测3组细胞GRP78在mRNA和蛋白水平的表达,体外侵袭实验和划痕实验检测3组细胞的侵袭转移能力.结果:与对照组相比,BAPTA-AM组GRP78在mRNA和蛋白水平表达量降低,A23187组GRP78表达量升高;且BAPTA-AM组侵袭和转移能力明显低于对照组,而A23187组则高于对照组.结论:BAPTA-AM和A23187可分别下调和上调胃癌细胞GRP78的表达水平,GRP78的表达水平可能与胃癌细胞的侵袭和转移有关.     

GRP78 upregulation-induced increase in cisplatin sensitivity of SPCA1 lung cancer cells

Background  Glucose regulated protein 78 (GRP78), an endoplasmic reticulum (ER) chaperone, plays a critical role in chemotherapy resistance in a variety of cancers. In this study, we investigated the up-regulation of GRP78 induced by A23187 and its association with the chemotherapeutical sensibility to cisplatin in human lung cancer cell line SPCA1.

Methods  SPCA1 cells were pretreated with A23187 at different concentrations. The expression of GRP78 at the mRNA level was analyzed by RT-PCR; the expression of GRP78 at the protein level was determined by Western blotting and immunofluorescence assay. Cell survival was determined by MTT assay. Cell apoptosis was analyzed by flow cytometry.

Results  The expression of GRP78 at both the mRNA and protein levels was obviously induced by A23187 in SPCA1 cells, with an elevation of GRP78 by 2.1-fold at the mRNA level and by 3.8-fold at the protein level compared to the control. There was a dose-dependent response. Survival curve analysis demonstrated that A23187 induction caused a significant reduction of survival for the cells subjected to cisplatin treatment (P <0.05). After treatment by cisplatin, the percentage of apoptotic cells in the A23187 pretreated group increased about three fold compared with the control group ((27.53±4.32)% vs. (9.25±3.64)%, P <0.05).

Conclusions  A23187 treatment was fairly effective for the induction of GRP78 in SPCA1 cells at both the mRNA and protein levels. To a certain extent, GRP78 up-regulation by A23187 was associated with the enhancement of drug sensitivity to cisplatin in human lung cancer cell line SPCA1.

     

葡萄糖调节蛋白78与胃癌细胞化疗敏感性的关系

目的:探讨葡萄糖调节蛋白78(Glucose regulated protein 78,GRP78)在不同胃癌细胞株中的表达和对化疗药物敏感性的关系,并探讨其初步机制.方法:用RT-PCR及Western blot法检测分化程度不同的胃癌细胞株MKN45、SGC7901和NCI-N87中GRP78的表达,并分别观察经c...     

Gefitinib获得性耐药产生时非小细胞肺癌上皮性标志EGFR及E-cadherin表达的变化

[目的]了解gefitinib获得性耐药产生时非小细胞肺癌上皮性标志EGFR及E-cadherin表达的变化。[方法]采用逐步递增药物浓度、间歇作用体外诱导法诱导人肺腺癌NCI-H1975细胞株gefitinib获得性耐药;倒置显微镜下观察亲本细胞株和耐药细胞株在gefitinib作用前后的细胞形态学变化差异;细胞计数法描绘耐药细胞株和亲本细胞株的生长曲线并计算群体倍增时间;免疫细胞化学法检测耐药细胞株及亲本细胞株的EGFR及E-cadherin蛋白表达状态,并比较二株细胞间两种蛋白表达的差异。[结果]历时6个月诱导建成人肺腺癌gefitinib耐药细胞株NCI-H1975/GR。Gefitinib作用后耐药细胞株NCI-H1975/GR的细胞形态变化与亲本株NCI-H1975有所不同;在gefitinib的作用下,NCI-H1975/GR细胞体积变小,部分细胞变为纺锤形;NCI-H1975/GR细胞株群体倍增时间延长7.14 h(P<0.05);免疫细胞化学结果显示:与亲本株比较,虽然耐药细胞株NCI-H1975/GR细胞细胞膜EGFR蛋白的表达无明显变化,但在细胞浆的表达明显增高;E-cadherin在细胞膜的表达明显降低。[结论]非小细胞肺癌产生gefitinib获得性耐药后EGFR蛋白在细胞浆积聚;而以E-cadherin为代表的上皮分化标记表达减弱。     

非小细胞肺癌体外化疗药物敏感性与GRP94表达的相关性

[目的]探讨非小细胞肺癌(NSCLC)对8种化疗药物的体外敏感性与GRP94表达的相关性。[方法]用四噻唑蓝(MTT)法检测52例手术切除新鲜NSCLC组织8种化疗药物体外敏感性;免疫组织化学方法检测肺癌组织GRP94表达。采用Spearman法进行相关性分析。[结果]NSCLC52例对紫杉醇(PTX)、阿霉素(ADM)、卡铂(CBP)、拓扑替康(TPT)、长春瑞滨(NVB)、长春新碱(VCR)、顺铂(DDP)和鬼臼乙叉苷(VP-16)8种化疗药物的耐药率分别为42.31%、57.69%、63.46%、65.38%、67.31%、73.08%、78.85%和90.38%。其中,14例表现为完全耐药;且其高表达与肺癌细胞对VP-16的耐药明显相关(P<0.05)。[结论]检测GRP94表达对推测NSCLC对VP-16的耐药性具有参考意义。     

siRNA 干扰 TRIM29基因对人肺癌 NCI-H520细胞株增生及迁移能力的影响

目的：探讨 TRIM29基因沉默对肺癌细胞株 NCI-H520增生和迁移能力的影响。方法将针对 TRIM29的 siRNA 导入NCI-H520细胞,用 real time PCR 和 Western blotting 法分析 TRIM29基因及蛋白表达情况,MTT 法和 Transwell 小室法检测其增生、迁移能力。结果 NCI-H520细胞转染48 h 后,与空白组及对照组相比,TRIM29 siRNA 转染组 TRIM29 mRNA 和蛋白表达均明显下调,细胞生长明显减慢,细胞迁移能力下降。结论 siRNA 干扰下调 TRIM29基因表达能抑制肺癌细胞 NCI-H520的增生和迁移能力。     

异常黑胆质成熟剂与顺铂能下调宫颈癌细胞Bcl-2和Survivin的表达

目的:研究异常黑胆质成熟剂总酚与顺铂联合对体外培养的人宫颈癌细胞SiHa增殖的影响,并探讨对凋亡抑制基因Bcl-2和Survivin的表达的影响。方法:异常黑胆质成熟剂总酚分别与顺铂联合作用于SiHa细胞后,荧光倒置显微镜下观察细胞生长情况,流式细胞术检测Siha细胞各组早期凋亡率的变化及Bcl-2的表达,实时荧光定量PCR法检测Survivin的表达。结果:①倒置显微镜下观察单药和联合用药组细胞体积变小变圆,细胞核固缩,核质比减小,胞质浑浊,可见空泡状细胞,部分细胞核膜消失,可见较多脱落圆形死亡细胞。②异常黑胆质成熟剂总酚和顺铂对Siha细胞作用48 h后,流式细胞术检测Siha细胞各组早期凋亡率分别为(14.2±4.06)%和(16.2±1.66)%,明显高于对照组(5.43±0.31)%,差异有统计学意义(P<0.001)都有很好地促进凋亡的作用,异常黑胆质成熟剂总酚与顺铂联合有交互作用,其促进凋亡的作用比单药更显著(P<0.01)。③异常黑胆质成熟剂总酚和顺铂单药及总酚与顺铂联合均能降低Bcl-2的表达,并且单药与对照组、联合用药组与单药组之间均有统计学差异(P<0.001)。④实时荧光定量PCR法检测Survivin的表达定量在异常黑胆质成熟剂总酚组和顺铂组分别为(0.334±0.038)及(0.562±0.035),明显低于对照组Survivin的表达(3.470±0.091),差异有统计学意义(P<0.001),药物联合组有很好的交互作用,差异有统计学意义(P<0.001)。结论:异常黑胆质成熟剂总酚与顺铂联合能显著增加SiHa细胞的早期凋亡率,其机制与降低Bcl-2和Survivin表达有关。     

miRNA-155表达对人肺癌细胞A549增殖的影响

【目的】探讨miRNA-155在正常肺组织和非小细胞肺癌组织中的表达及miRNA-155对人肺癌细胞A549增殖的影响。【方法】采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术检测15例非小细胞肺癌组织及其癌旁组织中miRNA-155的表达;A549细胞分别转染miR-NC和miRNA-155 mimic ,采用Real-time PCR技术检测转染后A549细胞中的miRNA-155表达水平,同时采用MTT 技术和流式细胞技术检测转染后A549细胞增殖情况,Western印迹法检测转染后A549细胞中Akt、p-Akt（Ser473）、p27、bcl-2、bax的表达。【结果】miRNA-155在非小细胞肺癌组织中的表达情况明显高于癌旁组织（ P ＜0．05）;与转染 miR-NC 组相比, A549细胞转染miRNA-155 mimic后miRNA-155表达水平明显增高（ P ＜0．001）,MTT实验和流式细胞技术显示miRNA-155促进A549细胞的增殖;Western印迹法结果显示：转染miRNA-155的A549细胞p-Akt （Ser473）,bcl-2的表达水平增高,p27、bax的表达水平降低。【结论】miRNA-155可能通过促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,上调p-Akt（Ser473）、bcl-2表达,同时抑制p27、bax的表达来促进非小细胞肺癌的发生发展。