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1.
PCR技术检测RH株弓形虫组织内感染的实验研究   总被引:3,自引:0,他引:3  
目的:建立敏感,特异的聚合酶链反应(PCR),以检测组织内弓形虫感染。方法:优化PCR反应关键步骤的条件。以相同的B1引物扩增相近的病原体判断其特异性,扩增倍比稀释的DNA检测其灵敏度,并以PCR法检测实验鼠肝,血中DNA的动态变化。结果与免疫组化法进行比较。评价其检测生物学样本的可行性。结果:实验建立的PCR技术的灵敏度能达到检测出一个虫体的DNA,且特异性强,不扩增鼠DNA,人DNA,隐孢子虫,卡氏肺孢子虫,鼠疟原虫的DNA,检测实验感染小鼠血,肝脏样本,在感染后2天,3只鼠血样本PCR结果阳性,3只小鼠肝标本2只阳性;感染后3天至濒死前后有小鼠检测结果均阳性;血样本阳性检出率100%(11/11),肝脏组织样本阳性检出率81.8%(9/11)。结论:PCR方法是一种敏感,特异快速的诊断方法,可用于诊断血和肝脏组织内的弓形虫。  相似文献   

2.
目的建立检测日本血吸虫感染的巢式PCR技术。方法设计2对巢式引物特异性扩增日本血吸虫高拷贝的Sjα1基因片段,分析反应的敏感性和特异性,并对感染小鼠血清、全血样本以及实验和现场钉螺样本进行检测。结果建立的巢式PCR方法特异性扩增日本血吸虫420bp的Sjα1片段,和曼氏血吸虫没有交叉,基因组DNA作为模板时最低检测量为0.1fg。小鼠感染日本血吸虫后2周的血清样本即能检测出特异性DNA,建立的方法能同时检测血清和全血标本。钉螺实验感染4hr后能检测到日本血吸虫DNA,现场采集钉螺的检测结果显示比传统的镜检方法敏感性高。结论建立的巢式PCR检测日本血吸虫感染具有较高的敏感性和特异性,为疾病诊断和媒介调查提供了新的分子生物学检测技术。  相似文献   

3.
目的建立快速检测多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体和肺炎克雷伯杆菌4种实验动物病原体的多重PCR方法。方法根据Gen Bank基因设计出特异性引物;经过多重PCR的优化,特异性和敏感性的检测,建立多重PCR体系。应用该PCR体系检测人工感染样本和实验动物的气管分泌物,并与传统方法做对比。结果多重PCR扩增出多杀巴氏杆菌(356 bp)、支气管鲍特杆菌(237 bp)、支原体(266 bp)和肺炎克雷伯杆菌(142 bp)的目的条带。肺炎克雷伯杆菌敏感性为10 pg,多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体敏感性为1 pg,特异性检测未从其他病原菌中检测出目的条带。应用建立的多重PCR体系检测人工感染样本的不同组合,45只实验动物气管检测出15只多杀巴氏杆菌阳性,9只肺支原体阳性,但传统培养方法和血清学方法未检测出阳性标本。结论本文建立的多重PCR方法操作简单、快速、特异性强、灵敏度高,能够实现对多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体和肺炎克雷伯杆菌4种实验动物病原体的快速检测。  相似文献   

4.
目的 利用BALB C(H - 2Kd)和C5 7BL 6 (H - 2Kb)小鼠H - 2K等位基因不同 ,建立一种检测异基因骨髓移植 (allo -BMT)后供体植活的方法。方法 分别以供鼠 (BALB C)和受鼠 (C5 7BL 6 )及allo -BMT后小鼠骨髓和脾细胞DNA为模板进行巢式PCR ,并用琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物。结果 以供鼠和移植后小鼠骨髓和脾细胞DNA行巢式PCR可扩增出约 42 1bp的特异性片段 ,而未经移植的C5 7BL 6小鼠无此条带 ,与预期结果相符。结论 巢式PCR可敏感检测到不同品系小鼠H - 2K基因间的差异 ,可作为异基因骨髓移植后检测异基因是否嵌合的方法  相似文献   

5.
目的:小鼠和大鼠感染鼠棒状杆菌后,大多可从脓肿等的病变部分离到本菌。已有报告认为,本病大多是隐性感染,但经可的松处理和动物绝食等应激作用时,往往会诱发本病。笔者等试用微量法凝集试验来探索鼠棒状杆菌凝集抗体作为检测方法之一,并从抗体检出方面来探讨鼠棒状杆菌感染和凝集抗体的关系。  相似文献   

6.
目的建立多瘤病毒荧光定量PCR检测方法,并对裸鼹鼠中多瘤病毒感染情况进行调查。方法比较NCBI中小鼠多瘤病毒(Genbank:NC_001515)的核酸序列,选择保守区域设计引物和探针,建立多瘤病毒的荧光定量PCR方法,对方法的敏感性和特异性进行验证。人工感染9只1日龄KM乳鼠,21 d后采集心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、盲肠内容物和血液等组织脏器,用建立的荧光PCR方法进行检测,验证方法在应用中的有效性,最后用该方法检测62份裸鼹鼠的盲肠内容物样本。结果建立的检测方法特异性好,在以多瘤病毒为模板时出现明显的荧光信号,以猴空泡病毒、小鼠K病毒、小鼠微小病毒和大鼠细小病毒H-1株为模板时无荧光信号出现;方法的最低检出限为100 copies/μL;人工感染小鼠的心、肝、脾、肺、肾和盲肠内容物中均检测到多瘤病毒核酸,其中肺组织中含量最高,脑、胸腺和血液中未检出;62份裸鼹鼠的盲肠内容物样本经检测多瘤病毒为阴性。结论建立的多瘤病毒荧光定量PCR方法可有效检测动物组织中的多瘤病毒,对裸鼹鼠自然感染多瘤病毒的调查为实验用裸鼹鼠微生物标准的制定提供了参考。  相似文献   

7.
目的探索一种快速、高效提取革兰氏阳性杆菌基因组DNA的方法。方法采用Chelex-100法提取14株革兰氏阳性杆菌的基因组DNA,利用PCR技术扩增16SrRNA基因及4个单拷贝管家基因以评价提取核酸的质量。结果 Chelex-100法能够在20min内从革兰氏阳性杆菌中提取出基因组DNA,所提取的DNA可直接用于PCR扩增。所有菌株的16SrRNA基因及棒状乳杆菌的4个单拷贝管家基因均扩增成功,PCR产物经电泳检测目的条带清晰特异,与预期目的片段长度相符。结论 Chelex-100法具有快速、高效、安全、经济的特点,采用这种方法提取的革兰氏阳性杆菌的基因组DNA可直接作为PCR扩增的模板。  相似文献   

8.
目的 建立一种快速、特异、敏感的小鼠多瘤病毒 (murine polyomavirus, MPyV)荧光定量 TaqMan PCR检测方法, 用于MPyV核酸的检测。 方法 根据GenBank中小鼠多瘤病毒基因组序列设计了一对特异性引物及TaqMan探针, 扩增长度为69 bp的片段, 通过优化反应体系和反应条件, 对构建的重组质粒标准品进行检测, 并绘制标准曲线, 进行特异性、敏感性和重复性试验。最后用建立的方法对人工感染MPyV的肺脏、脾脏和粪便, 及86 份小鼠临床样本进行检测, 验证在临床应用中的效果。 结果 所建立的检测方法特异性强, 只能在小鼠多瘤病毒DNA中检出荧光信号, 检测灵敏度达到100拷贝, 批内和批间重复性好, 检测结果变异系数(CV)均小于1.13%, 人工感染MPyV小鼠的肺脏、脾脏和粪便均为阳性, 对86份临床样本进行检测, 有3份样本呈阳性(阳性率为3.5%)。 结论 建立的MPyV荧光定量TaqMan-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好, 适合用于MPyV临床诊断、日常监测和流行病学调查。  相似文献   

9.
弓形虫病基因诊断的动物实验研究   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的:建立敏感、特异、稳定的PCR法,用于弓形虫病诊断。方法:选择与合成引物并确立最佳扩增条件,用PCR法检测实验感染鼠血液中弓形虫DNA,并与ELISA法检测循环抗原(CAg)作比较。结果:该PCR检测弓形虫DNA法特异性强,对其他7种寄生虫DNA均不扩增;敏感性高,可检测到0.2pg DNA;检测急性感染弓形虫小鼠血液最早于感染后第2天出现用性,与ELISA法查CAg比较。PCK检测弓形虫DNA法阳性出现时间早、检出率高。结论:该PCR法可应用于弓形虫感染的早期诊断。  相似文献   

10.
目的 建立念珠状链杆菌的实时荧光定量PCR检测方法, 实现该菌在多种实验动物中的快速检测。方法 根据NCBI公布的念珠状链杆菌序列, 设计特异性引物和探针, 通过对24株标准参考菌株的扩增, 验证其特异性、敏感性和重复性。运用所建立的方法对小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、长爪沙鼠和树鼩的共823份呼吸道样本进行检测。结果 用所建Taqman MGB荧光定量PCR方法在小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠和兔中未检出念珠状链杆菌;检出普通级长爪沙鼠和树鼩中念珠状链杆菌的阳性率分别为1.5%(1/65)和61.7%(37/60)。结论 本研究所建立的念珠状链杆菌Taqman MGB荧光定量PCR检测方法, 能够对实验动物中念珠状链杆菌进行快速准确的检测, 敏感性优于国标方法, 为实验动物质量检测体系的完善奠定了基础。  相似文献   

11.
缺口连接酶链反应检测沙眼衣原体DNA的实验研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的:建立缺口连接酶链反应方法检测沙眼衣原体.方法:根据编码CT主要外膜蛋白的基因(ompl)的稳定区设计2对互补的寡核苷酸探针.采用G-LCR和常规PCR扩增CT标准株DNA,并对二者检测CT的敏感性进行比较.结果:对5种CT标准株进行G-LCR扩增,均出现54bp长度的DNA片段.敏感性实验可检测出2个CT原体,而PCR可检测出20EBs.G-LCR较PCR敏感10倍;在特异性方面,不扩增肺炎衣愿体及其他细菌DNA,具有很高的特异性.结论:G-LCR用于检测沙眼衣原体特异、敏感、快速、准确,可为CT感染的临床诊断提供依据.  相似文献   

12.
空肠弯曲菌套式PCR快速检测方法的建立与初步应用   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的建立套式PCR快速检测实验动物空肠弯曲菌的方法。方法根据GenBank数据库的空肠弯曲菌flaA基因设计2对引物,对空肠弯曲菌抽提DNA作PCR扩增及克隆测序。同时,对其他病原菌抽提核酸扩增,并对120份临床样品进行检测。结果空肠弯曲菌经2对引物分别扩增出1719bp和640bp片段,与预期大小一致。套式PCR检测的最低限度为10CFU。整个检测过程可在8h内完成。而其他病原菌未出现特异性扩增条带。采用套式PCR对121份临床样品进行检测,检出31份阳性,与传统的细菌分离方法完全一致。结论本研究建立的套式PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于实验动物空肠弯曲菌的快速检测。  相似文献   

13.
目的提高对梅毒诊断的灵敏性和特异性。方法运用PER扩增了梅毒螺旋体(Tp)的DNA多聚酶I基因(polA)的特异性片段,检测了该方法的特异性和灵敏性;用该方法检测了118例生殖器溃疡,同时用Tp PCR试剂盒和血清学方法平行检测同批病人的溃疡或血清标本。结果polA PCR只在扩增Tp时有特异性产物,灵敏性约为20个Tp拷贝;检测118例生殖器溃疡标本,用Tp PCR试剂盒为对照,polA PCR方法的特异性和灵敏性分别为96.8%和95.7%,两种PCR检验结果差异无显著性(x2=0.25,P>0.05);polA PCR方法与血清学方法对一期梅毒诊断结果差异有显著性(x2=4.45,P<0.05)。结论polA PCR方法高度敏感、特异,在一期梅毒诊断中优于血清学方法,可作为血清学方法的补充用于梅毒的诊断。  相似文献   

14.
目的针对乙肝病毒(HBV)不同亚型,建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,实现对HBV的快速检测及基因分型。方法分别设计HBV B、C、D三亚型基因组特征序列的LAMP引物,优化反应条件,建立特异灵敏的HBV亚型LAMP检测方法,并与Real-time PCR方法进行临床样本检测结果比对。结果 LAMP法在数十分钟内有效地检测出HBV的B、C、D三亚型;其中,HBV-B亚型的检出限为17拷贝;C亚型的检出限为25拷贝;D亚型的检出限为10拷贝。与Real-time PCR法相比,灵敏度提高1 000倍左右。结论 LAMP法可实现HBV的快速检测及分型,具有高特异度和高灵敏度,可用于临床检测诊断。  相似文献   

15.
目的建立丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌的实时荧光PCR快速检测方法,用于沙门菌属内的分型鉴定。方法根据GenBank公布的丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立实时PCR检测方法。结果检测体系灵敏度高,纯DNA和菌液的最低检出限分别可达10fg和20CFU/反应体系;特异性好,对71株细菌的检测符合率达100%。20株沙门菌采取盲号模拟血培养标本进行血培养检测及鉴定,检出5株丙型副伤寒沙门菌和4株猪霍乱沙门菌,与试验的菌株相符。70份食品中用实时荧光PCR同时检测丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌均为阴性,而用传统方法分离培养未检出。结论建立的实时PCR检测方法可以快速、特异、灵敏地检测出丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌。  相似文献   

16.
目的建立快速、灵敏、特异的香港海鸥形菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR体系,用于食源性致病菌监测和淡水鱼产品贸易往来的快速检测。方法根据GenBank公布的香港海鸥形菌16SrRNA基因高保守序列,设计特异引物对和TaqMan-MGB探针,建立和优化快速检测体系,评价反应体系的特异性、灵敏度、重复性,并在淡水鱼类、急性胃肠炎腹泻患者标本中临床应用,结合细菌分离方法和序列测定分析进行验证。结果建立的香港海鸥形菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR反应体系检测时限短,仅40min就可出结果,特异性好,与沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌等非目标菌无交叉反应,灵敏度高,检测下限达10拷贝/反应,稳定性好,同一浓度阳性质粒进行16次重复检测的Ct值变异系数0.183%。92份淡水鱼及211份医院急性胃肠炎腹泻标本实时荧光PCR与常规细菌分离结果完全一致,均检出了12株香港海鸥形菌。16SrRNA测序结果显示与HKU1株同源性在99.5%以上,进一步验证了实时荧光PCR的特异性。结论本研究建立的香港海鸥形菌TaqMan—MGB探针实时荧光PCR反应体系快速、特异、灵敏,在防止食源性疾病的传播和加快贸易通关速度方面,具有较强的的应用价值。  相似文献   

17.
病原性真菌PCR检测方法的建立   总被引:5,自引:0,他引:5  
目的:建立一种快速、灵敏和特异的病原性真菌的检测方法。方法:选取真菌18S rRNA保守区的一对寡核苷酸序列作为通用引物,对10种真菌、3种常见细菌及80例临床标本进行PCR扩增。结果:所试10种真菌均能扩增出一条约400bp的DNA片段,而3种细菌则无此扩增条带。通过对80例临床标本的检测,证实PCR法和常规培养法结果基本一致。此外,对白色念珠菌检测的最低限为10pg的DNA。结论:PCR方法检测临床常见真菌有较高的灵敏性与特异性,有助于临床真菌感染性疾病的诊断与治疗。  相似文献   

18.
目的建立伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌的快速和特异的检测方法,用于沙门菌属内的分型鉴定。方法根据GenBank公布的伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌的保守序列设计引物和改良分子信标探针,建立多重PCR检测方法和实时荧光PCR检测方法。结果采用所建立的多重PCR方法可分别检测到伤寒的3条特异性条带、甲型副伤寒沙门菌的2条特异性条带和丙型副伤寒沙门菌的1条特异性条带,但是乙型副伤寒沙门菌未出现特异性条带。建立的实时荧光PCR方法可以快速、特异、灵敏地检测出伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌,纯DNA和菌液的最低检出限分别可达10 fg/reaction和20 CFU/reaction;对77株细菌的检测正确率达100%。结论建立的实时荧光PCR检测方法比多重PCR方法更能快速、特异、灵敏地检测伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌。  相似文献   

19.
目的:建立快速检测肺炎链球菌recA,ply及16SrRNA基因的多重降落PCR方法并应用。方法:设计肺炎链球菌的特异基因recA,ply及其菌属保守序列16SrRNA基因的引物,建立多重降落PCR的反应体系及条件,通过该方法检测13株标准菌株的基因以判定recA、ply、16SrRNA基因的检测特异性;并通过对不同稀释度肺炎链球菌DNA的检测判定该方法的灵敏度。最后,应用多重降落PCR方法检测98份痰标本的肺炎链球菌,并与细胞培养法进行比较。结果:建立的多重降落PCR方法检测肺炎链球菌的特异性达100%,灵敏度达5pg/μL,该方法对98份痰标本中肺炎链球菌的检测结果与细胞培养法一致。结论:成功建立检测肺炎链球菌的多重降落PCR方法,灵敏度高,特异性强,可用于临床标本肺炎链球菌的快速检测。  相似文献   

20.
RT-PCR 扩增MUC1检测胃癌微转移研究   总被引:5,自引:0,他引:5  
目的 以RT-PCR检测胃周淋巴结胃癌转移细胞并评价其临床应用价值。方法 以MUC1cDNA的特异旬为RT-PCR引物,酶切分析法及系列稀释该法的特异性和敏感性进行分析,对临床收集的胃周淋巴样品作RT-PCR检测及产物DNA点杂交验证。结果 (1)胃及胃癌组织均存在MUC1mRNA的表达;(2)该扩增体系具有较好的特异性;(3)敏感性可达1pgRNA,相当于从10^5个淋巴细胞中检出1个胃癌细胞;  相似文献   

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