Rho激酶在大鼠严重烧伤后肠黏膜通透性改变中的作用及机制研究

目的观察严重烧伤早期不同时相点大鼠肠黏膜通透性的变化，探讨Rho激酶在这一过程中的作用及机制。方法常规制备烧伤大鼠模型后取回肠末段，分为正常对照组、烧伤组和烧伤6h＋Y27632组，以荧光素标记法（FITC-D）检测大鼠肠黏膜在未烧伤1、2、6、12、24h等不同时相点通透性的变化指标；用Western blot法检测肠黏膜肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）、磷酸化MLC（p-MLC）和Rho激酶蛋白水平的变化。结果严重烧伤后大鼠肠黏膜通透性明显增加，并呈时相依赖性变化，6～12h达到最高；p-MLC以及Rho激酶蛋白表达均明显增加。上述蛋白表达的增强可在加入Rho激酶特异性抑制剂Y27632后消失。结论严重烧伤后肠黏膜Rho激酶激活和p-MLC表达增加，是导致其通透性增加及屏障功能损害的分子机制之一。     

Rho激酶对严重烧伤大鼠血清诱导的肠黏膜上皮细胞调控机制的研究

目的:观察烧伤血清刺激下肠黏膜上皮细胞通透性的变化及Rho激酶信号转导通路所起的作用。方法:常规培养肠黏膜上皮CaCO-2细胞,分为正常对照组、烧伤血清组和烧伤血清6 h Y27632组,以FITC-albumin荧光强度检测法检测人肠黏膜上皮细胞在未烧伤、1、2、6、12、24 h时相点通透性变化指标;采用Western blot法检测人肠黏膜上皮细胞中肌球蛋白轻链(MLC)、磷酸化MLC(p-MLC)和Rho激酶蛋白水平在6个时相点的变化及烧伤血清6 h Y27632组总MLC、p-MLC及Rho激酶蛋白水平表达。结果:严重烧伤后人肠黏膜上皮细胞通透性明显增加,并呈时相依赖性变化,6~12 h达到最高;p-MLC以及Rho激酶蛋白表达均明显增加。上述蛋白表达的增强可在加入Rho激酶特异性抑制剂Y27632后取消。结论:烧伤大鼠血清能诱导肠黏膜上皮细胞内Rho激酶激活、p-MLC表达增加及肠黏膜通透性增加,抑制Rho激酶活性能逆转这一作用。     

ML-7对酒精致肠黏膜屏障功能障碍的作用

目的 探讨MLCK特异性抑制剂ML-7对乙醇诱导的肠上皮细胞通透性的作用.方法 应用ML-7预处理Caco-2细胞后,测定跨上皮细胞电阻值(TEER)及荧光黄透过率,分析肠上皮细胞屏障的通透性的变化.应用Western blotting检测紧密连接相关蛋白(Occludin和ZO-1)的表达.结果 ML-7显著抑制乙醇诱导的肠上皮细胞屏障TEER值降低、荧光黄透过率升高、Occludin(S/IS)比值增加及ZO-1表达减少.结论 MLCK参与乙醇诱导肠上皮细胞屏障通透性增加的过程,揭示了乙醇引起肠上皮细胞屏障对大分子的通透性增加的部分机制.     

健脾通里中药芪黄煎剂对胃切除大鼠肠上皮紧密连接的影响

目的 观察健脾通里中药芪黄煎剂对大鼠胃切除创伤模型肠黏膜紧密连接蛋白的影响,并探讨其作用机制。方法 将45只大鼠随机分为假手术组、标准肠内营养组、中药组,每组15只。假手术组大鼠仅腹壁切开,未切除胃;其余两组采用胃切除手术方案建立大鼠模型。假手术组术后正常饮食饮水,标准肠内营养组术后注射肠内营养液,中药组注射肠内营养液+中药煎剂。干预7 d后取材,透射电镜下观察大鼠肠黏膜上皮紧密连接形态及其结构的连续性和完整性,并测量肠黏膜上皮细胞间紧密连接宽度;实时荧光定量聚合酶链式反应法检测紧密连接蛋白（zonula occludin-1,ZO-1）、封闭蛋白、咬合蛋白mRNA表达水平。结果 与假手术组比较,标准肠内营养组大鼠肠黏膜上皮细胞紧密连接宽度显著减小（P＜0.05）,小肠组织中ZO-1、封闭蛋白、咬合蛋白mRNA表达水平均显著下调（P＜0.05）;与标准肠内营养组比较,中药组大鼠肠黏膜上皮细胞紧密连接宽度显著增加（P＜0.05）,小肠组织中ZO-1、封闭蛋白、咬合蛋白mRNA表达水平均显著上调（P＜0.05）。结论 芪黄煎剂可以减轻胃切除术后大鼠肠黏膜上皮细胞间紧密连接的损伤,其作用机制与调节ZO-1、封闭蛋白、咬合蛋白mRNA的表达有关。     

复合膳食纤维对急性重症胰腺炎大鼠肠黏膜上皮紧密连接蛋白和肌球蛋白轻链激酶的影响

目的探讨含复合膳食纤维（DFC）肠内营养（EN）对重症急性胰腺炎（SAP）大鼠肠黏膜屏障功能的影响。方法采用5%的牛黄胆酸钠（0.1 mL/100 mg）逆行注射入胰胆管法制备大鼠重症急性胰腺炎（SAP）模型。60只随机分为三组：SAP＋肠内营养乳剂（瑞素）组（A组）,SAP＋瑞素加复合膳食纤维（20 g/L）1组[可溶性膳食纤维（SDF）∶不可溶性膳食纤维（IDF）=2∶1,B组],SAP＋瑞素加膳食纤维（20 g/L）2组（SDF∶IDF=1∶2,C组）,于术后48 h处死动物,比较各组肠黏膜病理改变,紧密连接蛋白occludin、ZO-1以及肌球蛋白轻链激酶（MLCK）的变化。结果 B组与C组大鼠肠黏膜损伤相对于A组较轻（P〈0.05）,C组大鼠肠黏膜损伤相对于B组较轻（P〈0.05）。B组与C组大鼠肠黏膜紧密连接蛋白occludin、ZO-1以及肌球蛋白轻链激酶（MLCK）的分布表达相对于A组增高（P〈0.05）,且C组oc-cludin及ZO-1的分布和表达高于B组（P〈0.05）。而C组MLCK的分布和表达高于B组,但差异无统计学意义（P〉0.05）。结论添加DFC的肠内营养在SAP大鼠肠黏膜屏障功能中起重要的保护作用,且适当加大不可溶性膳食纤维（IDF）的比例更有助于肠道黏膜屏障的保护,改善受损的肠屏障功能。这一作用可能是通过调控紧密连接蛋白occludin、ZO-1以及肌球蛋白轻链激酶（MLCK）的分布和表达来实现的。     

血管扩张刺激磷蛋白调节失血性休克大鼠小肠屏障功能与闭锁连接蛋白1的关系

目的 观察血管扩张刺激磷蛋白(vasodilator stimulated phosphoprotein, VASP)调节失血性休克大鼠小肠屏障功能与闭锁连接蛋白1(ZO-1)的关系.方法 采用失血性休克大鼠模型,以血浆D-乳酸含量反映肠屏障功能,观察失血性休克后大鼠小肠上皮黏膜VASP表达和磷酸化的变化、ZO-1的表达变化以及肠屏障功能变化,比较变化趋势,并观察失血性休克加入VASP磷酸化激动剂后对上述分子表达和肠屏障功能的影响.结果 ①与正常对照组相比,失血性休克后大鼠小肠黏膜VASP蛋白表达明显降低(P<0.01),VASP蛋白磷酸化在正常时表达量低,休克1 h时增高,2~4 h迅速降低(P<0.01);ZO-1表达随着休克时间的延长显著降低,在休克2 h时降低明显(P<0.01);血浆D-乳酸含量在休克1 h改变不明显,2~4 h显著增高(P<0.01).②VASP磷酸化激动剂cAMP可明显增强失血性休克2 h大鼠小肠上皮VASP蛋白表达和VASP磷酸化、ZO-1的表达,降低失血性休克2 h大鼠血浆D-乳酸含量增高幅度(P<0.01).结论 ZO-1可能与VASP对失血性休克大鼠肠屏障功能的调节作用有关.     

大鼠角膜损伤修复过程中上皮细胞通透性的改变与紧密连接的重塑有关

目的 探讨大鼠角膜上皮细胞在损伤修复过程中通透性的变化及其与紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的重塑的关系.方法用眼科手术刀片在大鼠右眼角膜中央作 2 mm、深及角膜上皮细胞基底层的无菌性机械性损伤复制角膜损伤模型.通过大分子Sulfo-NHS-LC-Biotin渗透作用经荧光分析检测损伤0、8、24、48、72 h后的角膜通透性的变化;间接免疫荧光分析损伤修复过程中角膜上皮细胞紧密连接蛋白Occludin与ZO-1的重塑.结果 角膜损伤后,缺损处上皮细胞缺失,通透性增加,紧密连接蛋白ZO-1、Occludin结构消失.随时间推移,上皮细胞增殖并向缺损处迁徙,其通透性逐渐降低,紧密连接蛋白结构逐渐形成.24 h时,上皮细胞覆盖角膜上皮缺损处,但其通透性仍较正常组高,其细胞间紧密连接较少、排列紊乱;48 h后,角膜通透性恢复正常,其角膜上皮细胞连接紧密,细胞间形成紧密连接结构.结论大鼠角膜损伤修复过程中通透性的改变与紧密连接的重塑有关.     

槲皮素改善TNF-α诱导的肠上皮Caco-2细胞功能障碍

为研究槲皮素改善TNF-α诱导的肠屏障功能障碍的细胞模型作用,实验采用TNF-α 200 ng/mL孵育Caco-2单层细胞24 h构建上皮屏障功能障碍的模型,再采用槲皮素（5,15,30 μmol/L）干预模型,考察槲皮素对上皮单层细胞通透性及上皮的紧密连接(TJ)蛋白Claudin-1和Occludin蛋白功能及表达的影响。结果表明,与正常对照组比,TNF-α组的上皮通透性增强,屏障功能障碍,且TJ蛋白中的Claudin-1、Occludin的磷酸化成分减少。槲皮素干预模型细胞后浓度依赖地增强上皮屏障功能,上调Claudin-1、Occludin的磷酸化成分及Occludin的整体蛋白成分。提示槲皮素可通过加强紧密连接蛋白的结构和功能改善肠上皮屏障功能。     

高氧致新生大鼠肠屏障功能的变化

  目的 研究高氧对新生大鼠肠屏障功能的影响。方法 采用Western blot检测高氧对新生大鼠肠道表达分泌片（SC）、Occludin和ZO-1蛋白影响。结果 高氧组新生大鼠肠道SC蛋白表达量与空气对照组相比明显增加（P<0.01）,但高氧组新生大鼠肠道紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达量与空气对照组相比差异无统计学意义。结论 高氧刺激肠道上皮分泌SC增加,使得高氧对紧密连接蛋白Occludin 和ZO-1表达没有明显的影响,以此增强肠道屏障功能。     

C3 胞外酶抑制缓激肽诱导的血肿瘤屏障通透性的增加

 目的 研究RhoA的特异性抑制剂C3 exoenzyme对缓激肽诱导的血肿瘤屏障通透性的作用 方法 应用RhoA的特异性抑制剂C3 exoenzyme 预处理大鼠原代脑微血管内皮细胞后,测量跨内皮阻抗值,辣根过氧化物酶渗漏量,分析血肿瘤屏障的通透性的改变;应用Western-blot法检测紧密连接相关蛋白ZO-1的表达;应用免疫荧光方法观察原代大鼠脑微血管内皮细胞紧密连接相关蛋白ZO-1和丝状肌动蛋白结构和分布的改变。结果C3 exoenzyme显著抑制缓激肽诱导TEER值的降低,HRP的升高;C3 exoenzyme显著抑制ZO-1的表达;C3 exoenzyme 抑制ZO-1由内皮细胞的边缘向细胞质转移,抑制丝状肌动蛋白由细胞膜边缘向细胞中央区分布,分布于细胞边缘的F-actin明显增加,应力纤维形成明显减少。结论RhoA介导缓激肽开放血肿瘤屏障。 关键词：RhoA;缓激肽;血肿瘤屏障;紧密连接;ZO-1;肌动蛋白重排 中图分类号：R338.2     

脾虚1号方对功能性消化不良脾虚证大鼠胃体组织MLC蛋白与基因表达的影响

目的探讨功能性消化不良(FD)脾虚证大鼠胃体组织肌球蛋白轻链(MLC)蛋白与mRNA表达及脾虚1号方的干预作用。方法 60只7 d龄雄性SD大鼠随机分为正常对照组(n=10)、FD脾虚证模型组(n=50)。正常组给予2%蔗糖溶液灌胃,FD脾虚证模型组给予0.1%蔗糖碘乙酰胺溶液灌胃,0.2 m L/(只·d),连续6 d。FD脾虚证模型组正常饲料喂养至6周龄后叠加改良小平台站立,连续14 d。造模结束后随机分为模型组、多潘立酮组、脾虚1号方低、中、高剂量组,各10只,连同正常组,分别给予蒸馏水10 m L/(kg·d)、多潘立酮3.125 mg/(kg·d)、脾虚1号方1.275、2.550、5.100 g/(kg·d),灌胃14 d。采用免疫组化、蛋白质印迹(Western blot)和RT-PCR方法检测胃体组织MLC蛋白及mRNA表达量。结果与正常组相比,免疫组化检测模型组大鼠胃体肌层MLC蛋白定位表达降低;Western blot检测模型组胃体组织MLC蛋白表达量降低;RT-PCR检测模型组大鼠胃体组织MLC mRNA表达量降低,差异均有统计学意义(P0.01)。与模型组相比,免疫组化检测脾虚1号方低、中、高剂量组大鼠胃体肌层MLC蛋白定位表达增加,差异均有统计学意义(P0.05,P0.01);Western blot检测脾虚1号方中、高剂量组大鼠胃体MLC蛋白表达量增加,差异均有统计学意义(P0.01);RT-PCR检测脾虚1号方高剂量组MLC mRNA表达量升高,差异有统计学意义(P0.01)。结论 FD脾虚证模型大鼠存在胃体组织MLC蛋白及基因表达的降低,而脾虚1号方能够上调MLC蛋白及基因的表达。     

大鼠烧伤后立即切痂对心肌损伤的保护作用

目的：探讨烧伤后即行切痂对心肌损伤的防治作用。方法：建立３０％ＴＢＳＡⅢ°烧伤大鼠伤后立即一次性切痂模型，动物随机分为对照组（ｎ＝１０），未切痂组（ｎ＝５０）和切痂组（ｎ＝５０），于伤后１、３、６、１２和２４ｈ检测血浆肌球蛋白轻链１（ＭＬＣ１）、血浆及心肌组织ＴＮＦ等指标。结果：烧伤后６ｈ血浆ＭＬＣ１、ＴＮＦ即显著升高，心肌组织中ＴＮＦ也在伤后１２ｈ显著升高。未切痂组与切痂组比较，伤后１～６ｈ未切痂组ＭＬＣ１略低于切痂组，至伤后１２ｈ，未切痂组ＭＬＣ１、ＴＮＦ显著高于切痂组。ＭＬＣ１与ＴＮＦ存在显著正相关。结论：伤后即行一次性切痂可以降低血浆ＭＬＣ１和ＴＮＦ水平，提示其对烧伤后心肌损伤具有一定防治作用     

同种异系抗原不同途径诱导大鼠免疫低反应性的研究

目的　比较同种异系抗原通过不同途径接种后机体对该抗原免疫反应状态的变化,探讨口服耐受的机制。方法　以SD大鼠为供者,Wistar大鼠为受者,将SD大鼠脾细胞,分别以口服、联合(口服+门静脉注射)两种途径接种于Wistar大鼠,测定供受体之间单向混合淋巴细胞培养(MLC)和受体对供体抗原的迟发性超敏反应(DTH)。结果　两种途径与对照组相比MLC (A)、DTH脚掌厚度增值均显著降低,其差异有显著性(P<0 .0 5 )。结论　两种途径均可诱导机体对该抗原的免疫低反应性。     

IL-1β下调Rho激酶活性介导脓毒症大鼠血管钙失敏的机制研究

目的 探讨白细胞介素(IL)-1β下调Rho激酶活性介导脓毒症大鼠血管钙失敏的机制.方法 SD大鼠32只,按随机数字表完全随机分为假手术组、盲肠结扎穿孔(CLP) 3 h组、CLP 6 h组、CLP 12 h组,每组8只.经CLP复制脓毒症大鼠模型,检测不同时点血浆IL-1β浓度及肠系膜上动脉(SMAs)钙敏感性,分析二者之间的相关性.培养SMAs来源的血管平滑肌细胞(VSMCs)并与不同浓度重组人IL-1β孵育24 h,观察IL-1β对其肌球蛋白轻链(MLC20)磷酸化水平、Rho激酶活性、G蛋白表达水平及RhoGEFs活性的影响.结果 经CLP 3 h后SMAs钙敏感性开始下降(P＜0.05),而血浆IL-1β在CLP 6 h后开始上升(P＜0.05),SMAs钙敏感性变化趋势与血浆IL-1β浓度变化呈明显负相关(P＜0.05).IL-1β可降低VSMCs MLC20磷酸化水平及Rho激酶活性(P＜0.05),上调Gα11表达而下调Gα12表达(P＜0.05),但对Gαq和Gα13表达无明显作用(P＞0.05).IL-1β可明显降低RhoGEF和PDZ-RhoGEF活性(P＜0.05),升高p63 RhoGEF活性(P＜0.05).结论 IL-1β通过下调Gα12表达,引起PDZ-RhoGEF和Rho激酶的活性下降,导致MLC20磷酸化水平下降从而介导脓毒症大鼠血管钙失敏的发生;另外也能通过上调Gα11表达,引起p63 RhoGEF活性增加而介导脓毒症大鼠血管钙敏感性增加,但总效应是使钙敏感性降低.     

逼尿肌相关蛋白在慢性前列腺炎大鼠模型中的表达及意义

目的：采用17β-雌二醇联合去势建立大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型,检测膀胱逼尿肌蛋白在慢性前列腺炎大鼠膀胱的表达。方法取2月龄 SD 雄性大鼠60只随机分为6组,每组10只,即：空白对照组、生理盐水组、假手术组、单纯17β-雌二醇组、单纯去势组、17β-雌二醇联合去势组。HE 染色判定大鼠慢性前列腺炎模型建造成功后,采用 SP 免疫组化法、Western blot 检测6组大鼠膀胱组织肌动蛋白(α-actin)、肌球蛋白(MLC 2)及高分子量钙调素结合蛋白(h-cad)表达的差异。结果免疫组化结果显示17β-雌二醇联合去势组中α-actin、MLC 2、h-cad 蛋白表达增多,Western blot 显示α-actin 在各组的表达,与空白对照组相比,生理盐水组、假手术组、单纯17β-雌二醇组、单纯去势组联合去势组差异有统计学意义。 MLC 2、h-cad 在各组的表达与空白对照组相比,生理盐水组、假手术组差异无统计学意义,单纯17β-雌二醇组、单纯去势组、联合去势组差异有统计学意义。结论α-actin、MLC 2、h-cad 表达变化可能参与慢性前列腺炎排尿相关症状的发病。     

新生大鼠同种心脏移植免疫耐受的实验研究

目的探讨诱导新生大鼠免疫耐受性。方法实验组新生SD大鼠胸腺内接种成年wistar大鼠2.5×10     

三羟异黄酮对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用

目的:研究三羟异黄酮对肠缺血再灌注损伤的影响.方法:24只雄性Wistar大鼠随机分为假手术组(S组)、肠缺血再灌注损伤组(IIRI组)和三羟异黄酮组(G组).观察三组肠组织病理学变化,测定比较肠组织湿/干重比(W/D)、髓过氧化物酶(MP0)活性、细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子-1(CINC-1)含量和血浆D-乳酸含量.结果:与S组比较,IIRI组肠损伤严重,W/D、MP0活性、CINC-1含量和血浆D-乳酸含量升高(P＜0.01);与IIRI组比较,G组肠损伤明显减轻,W/D、MPO活性、CINC-1含量和血浆D-乳酸含量降低(P＜0.05或P＜0.01).结论:三羟异黄酮对肠缺血再灌注损伤具有保护作用,可能与其下调CINC-1的表达而抑制中性粒细胞在肠组织的聚集有关.     

谷氨酰胺预处理对大鼠肠缺血再灌注后肺损伤的影响

目的探讨谷氨酰胺预处理对大鼠肠缺血再灌注后肺损伤的影响。方法建立大鼠肠缺血再灌注损伤模型,观察谷氨酰胺预处理对大鼠肺组织细胞间黏附分子(ICAM-1)、热休克蛋白-70(HSP-70)基因表达、髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)水平以及肺组织病理变化的影响。结果谷氨酰胺预处理可以增强大鼠肺组织HSP-70的表达,抑制ICAM-1的表达,降低肺组织MPO、MDA水平。结论谷氨酰胺预处理对大鼠肠缺血再灌注后肺组织具有保护作用,其机制可能与诱导HSP-70基因表达有关。     

胸腺内接种同种脾细胞诱导新生期大鼠免疫耐受的研究

为了诱导新生大鼠免疫耐受。方法：将 ２．５ ｘ １０７个 Ｗｉｓｔａｒ大鼠脾淋巴细胞通过胸腺途径注射给 新生ＳＤ大鼠,４－６周龄时取其脾淋巴细胞与Ｗｉｓｔａｒ大鼠脾淋巴细胞（２０ Ｇｙ照射）进行混合培养,作氚标记并测定 放射强度。结果：实验组放射强度平均为（１０．８５±２．５６）Ｂｑ;对照组为（２４．８２±５．４４）Ｂｑ,２组比较差异显著（Ｐ＜ ０．００１）。结论：新生期大鼠胸腺内接种同种脾淋巴细胞可以诱导其免疫耐受。