β1整合素表达下调对人结肠癌细胞增殖和化疗敏感性影响

目的 观察β1整合素表达下调对人结肠癌HT-29细胞增殖和化疗敏感性的影响.方法 采用反义寡核苷酸(ASODN)技术转染HT-29细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测β1整合素表达下调情况.MTT法检测HT-29细胞相对存活率.给予梯度浓度氟尿嘧啶(5-FU),计算IC50.结果 实验组β1整合素条带吸光度积分(IAD)值/β-actin条带IAD值的比值及HT-29细胞的存活率与对照组相比显著降低(F=1 630.08,q=72.40,P<0.01;t=4.37,P<0.05).5-FU+ASODN组HT-29细胞对5-FU的IC50与5-FU组比较显著下降(t′=37.71,P<0.05).结论 β1整合素表达下调可抑制结肠癌细胞增殖,增强结肠癌细胞对化疗药物敏感性.     

CD133功能对人脑胶质瘤及恶性黑色素瘤细胞体外生长的影响

目的 分析肿瘤干细胞表面标记物CD133/Prominin-1的功能对人脑胶质瘤及恶性黑色素瘤肿瘤细胞体外生长特性的影响.方法 选取人脑胶质瘤细胞U251及人恶性黑色素瘤细胞A357为对象,采用脂质体介导CD133/Prominin-1反义寡核苷酸(ASODN)及无关寡核苷酸(NSODN)分别转染细胞.转染后采用RT-PCR检测CD133/Prom-inin-1 mRNA水平,同时接种各组细胞,转染后第14天观察细胞生长情况.结果 在A357细胞中,CD133/Prominin-1ASDON转染组的CD133/Prominin-1 mRNA水平明显低于空白对照组及NSODN转染组(P<0.05),但其细胞集落形成率与其它两组比较差异并无统计学意义.在U251细胞中,CD133/Prominin-1 ASDON转染组的CD133/Prominin-1mRNA水平亦低于空白对照组及NSODN转染组,其第14天细胞数量也较其它两组明显减少(P<0.05).结论 通过反义寡核苷酸(ASODN)转染下调CD133/Prominin-1表达对人恶性黑色素瘤细胞的集落形成能力无明显影响,但可以显著抑制人脑胶质瘤细胞的体外增殖.     

骨桥蛋白反义寡核苷酸对微缺氧下人结肠癌细胞HT-29增殖活性及侵袭力的影响

目的 观察靶向骨桥蛋白(OPN)的反义寡核苷酸(ASODN)对微缺氧下HT-29细胞增殖活性、侵袭转移潜能等的影响,探讨OPN与微缺氧诱导的肿瘤恶性表型的关系.方法 合成ASODN,以Lipofectamine为载体,将其转染入微缺氧下高表达OPN的HT-29细胞.用RT-PCR和Western blot法分别检测转染细胞微缺氧下OPN mRNA和蛋白的表达,MTT检测转染的HT-29细胞微缺氧下的增殖活性,MTT比色试验测定HT-29细胞的异质性黏附能力,明胶酶谱分析检测分泌的MMP-2/9活性变化.结果 微缺氧诱导的OPN mRNA和蛋白表达被靶向OPN的ASODN特异性地抑制,表达量分别是对照组的31.5%和35.4%.ASODN组HT-29细胞的吸光度值(A570)明显低于各对照组(P<0.01),生长抑制率(IR)达(41.6±1.2)%.ASODN组HT-29细胞在各时限点的黏附率均明显降低,明胶酶活性下降71%,与各对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 靶向OPN的ASODN明显抑制微缺氧诱导的OPN mRNA和蛋白表达,显著拮抗微缺氧诱导的细胞增殖、异质性黏附,并显著下调微缺氧诱导的细胞分泌MMP2/9的活性.OPN在微缺氧促进肿瘤向恶性表型转化中起着重要作用.     

Beta-微管蛋白ⅢASODN对Ec9706/P-1细胞凋亡的影响

目的:观察β-微管蛋白Ⅲ(β-TubulinⅢ,TUBB3)反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide,ASODN)对Ec9706/P-1细胞凋亡的影响。方法:以体外诱导的人食管癌紫杉醇耐药细胞株Ec9706/P-1为模型,设ASODN组和无关序列寡核苷酸(Nonsense oligonucleotide,NSODN)组,应用免疫细胞化学方法检测NF-κBppabp65、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达;采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测NF-κBppabp65、bcl-2和caspase-3 mRNA的表达;采用DNA凝胶电泳和吖啶橙荧光染色法检测细胞凋亡变化。结果:免疫细胞化学方法显示ASODN组NF-κBppabp65蛋白表达率与NSODN组比较差异无统计学意义(P>0.05),ASODN组Bcl-2蛋白表达率与NSODN组比较差异有统计学意义(P<0.05),ASODN组Caspase-3蛋白表达率与NSODN组比较,差异有统计学意义(P<0.05);RT-PCR法显示ASODN组caspase-3 mRNA条带亮度强于NSODN组,bcl-2 mRNA条带亮度低于NSODN组,ASODN组NF-κBppab mRNA条带亮度与NSODN组相近;DNA凝胶电泳显示紫杉醇作用后ASODN组有凋亡特征的DNA改变,而NSODN组细胞却未出现;吖啶橙荧光染色法表明ASODN组凋亡率与NSODN组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:TUBB3反义寡核苷酸增加了紫杉醇对Ec9706/P-1细胞的诱导凋亡能力,证明了Bcl-2和Caspase-3的表达变化很可能是产生紫杉醇耐药的主要机制之一。     

C-myc反义寡核苷酸对人胆管癌细胞增殖和侵袭力的影响

目的 探讨C-myc反义寡核苷酸(ASODN)对人胆管癌QBC939细胞增殖和侵袭力的影响.方法 合成C-mycASODN,并将其转染QBC939细胞;四甲基噻唑蓝(MTT)实验检测C-myc ASODN抑制QBC939细胞增殖的影响;Transwell法检测C-myc ASODN抑制QBC939细胞侵袭力的影响.结果 ASODN组细胞的存活率低于空白对照组(P<0.05);ASODN组较空白对照组的细胞穿透数目下降(P<0.01);空载体组细胞的存活率及细胞穿透数目较空白对照组差异无统计学意义(P>0.05).结论 C-myc ASODN能抑制QBC939细胞的增殖和侵袭力.     

RhoC-shRNA对结肠癌细胞HT-29细胞生物学行为的影响

目的探讨RhoC-shRNA对结肠癌细胞生物学行为的影响。方法构建RhoC-shRNA表达载体,以脂质体转染法将之稳定转染入HT-29结肠癌细胞株,Western blot检测转染细胞中RhoC蛋白表达的抑制情况,观察转染前后结肠癌细胞周期、凋亡和侵袭能力的变化。结果成功构建RhoC-shRNA真核表达载体,并且转染入结肠癌细胞后,细胞中RhoC蛋白表达水平明显受到抑制,并且抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,降低肿瘤细胞侵袭能力。结论下调RhoC蛋白的表达可抑制结肠癌细胞HT-29的体外增殖和侵袭能力。     

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白在人结肠癌中的表达及其对HT-29细胞增殖凋亡的影响

目的 探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白( mTOR)基因在人结肠癌组织中的表达及其对HT-29细胞增殖与凋亡的影响.方法 免疫组织化学方法检测磷酸化mTOR (p-mTOR),在郑州大学第一附属医院普通外科2009年10月至2010年6月50例结肠癌组织和50例正常结肠组织中的表达情况.体外合成mTOR小干扰RNA(siRNA),转染人结肠癌HT-29细胞为实验组,同时设空白对照组(不转染)及无义对照组(转染无义siRNA),Western印迹法检测各组HT-29细胞的mTOR蛋白表达;四甲基偶氮唑蓝法检测细胞增殖;原位末端标记法检测细胞凋亡.结果 结肠癌组织中p-mTOR的表达高于对照组[60％(30例)比14％(7例),P＜0.05],mTOR的表达和淋巴结转移、肿瘤的分化程度相关(r=0.311、0.427,均P＜0.05).实验组HT-29细胞mTOR的表达和细胞增殖均低于空白对照组和无义对照组(0.39±0.25比1.18±0.05、1.46±0.09,0.275±0.033比0.460±0.028、0.450±0.037,均P＜0.05);细胞凋亡指数则均高于空白对照组和无义对照组(12.33±1.53比0.33±0.31、1.67±0.58,均P＜0.05).结论 在结肠癌组织中存在mTOR高表达,mTOR siRNA对HT-29细胞mTOR基因的表达有抑制作用,能抑制HT-29细胞的增殖并促进其凋亡.     

对人结肠癌细胞株HT-29转染shRNA重组质粒后Survivin基因变化的研究

目的通过对人结肠癌细胞株HT-29转染shRNA重组质粒后观察Survivin基因的变化。方法设计两条针对Survivin基因CDS区不同位点的siRNA片段并构建shRNA表达载体,重组质粒使用阳离子脂质体法转染结肠癌细胞株HT-29。RT-PCR,Western-blot检测转染后mRNA及蛋白表达。结果转染shRNA重组质粒可有效抑制HT-29细胞Survivin的表达,Survivin mRNA和蛋白表达下调,表明Survivin基因沉默效果较高;两个转染组之间相比pshRNA1组Survivin基因的表达量低于pshRNA2组。结论人结肠癌细胞株中的Survivin基因表达率可通过shRNA重组质粒转染而发生变化;siRNA1和siRNA2序列中Survivin基因表达量存在统计学意义,提示我们在今后有关Survivin基因靶向治疗研究中是否需要考虑到序列的选择以提高作用效果。     

VEGF-C反义寡核苷酸对卵巢癌细胞SKOV3的黏附、侵袭能力的影响

目的:探讨VEGF-C反义寡核苷酸(VEGF-C,ASODN)对人卵巢癌细胞SKOV3黏附、侵袭能力的影响.方法:以VEGF-C基因编码区为靶点合成反义寡核苷酸,脂质体介导转染.MTT法检测卵巢癌细胞与细胞外基质黏附能力;利用transwell小室,检测卵巢癌细胞侵袭人工基底膜的能力;免疫组化法检测细胞中VEGF-C蛋白表达,western blot检测细胞中MMP-2蛋白表达.结果:与空白对照组及正义序列转染组相比,ASODN组对细胞外基质黏附率明显降低(P＜0.01),穿透重组基质膜数目明显下降(P＜0.01),细胞中VEGF-C、MMP-2蛋白表达明显下降(P＜0.01).结论:VEGF-C ASODN可明显抑制卵巢癌细胞体外实验中的黏附和侵袭能力,下调MMP-2的表达可能是其作用途径.     

β-AR信号通路介导去甲肾上腺素提高 HT-29细胞侵袭能力的研究

目的 探讨去甲肾上腺素通过β-AR信号通路对结肠癌侵袭能力的影响及可能的作用机制。方法 以人结肠癌细胞株HT-29为研究对象,采用Transwell观察去甲肾上腺素对HT-29细胞侵袭能力的影响,同时观察加入非选择性β-AR阻断剂普萘洛尔后,HT-29细胞侵袭能力的变化。实时荧光定量PCR和Western blot法检测去甲肾上腺素通过β-AR信号通路对HT-29细胞MMP-2、MMP-9和VEGF的表达及ERK1/2活性的影响。结果 0.1、1、10μmol/L去甲肾上腺素组处理后,HT-29细胞的侵袭能力显著高于空白对照组,并且随着去甲肾上腺素浓度的提高,细胞的侵袭能力逐渐增强。而普萘洛尔可逆转去甲肾上腺素对HT-29细胞的促侵袭作用。与空白对照组比较,10μmol/L去甲肾上腺素可显著上调HT-29细胞MMP-2、MMP-9、VEGF mRNA和MMP-2、MMP-9、VEGF、pERK1/2蛋白表达水平。普萘洛尔可拮抗去甲肾上腺素的作用,下调MMP-9和VEGF表达,并减弱去甲肾上腺素对HT-29细胞ERK1/2活性的影响。结论 去甲肾上腺素可通过β-AR信号通路提高HT-29细胞的体外侵袭能力。     

半枝莲提取物诱导结肠癌HT-29细胞凋亡的机制研究

目的探讨半枝莲提取物在体外诱导结肠癌HT-29细胞株凋亡的作用机制。方法采用人结肠癌细胞HT-29常规体外培养,随机设定对照组和不同浓度半枝莲提取物组,干预24 h。倒置显微镜观察细胞形态变化,MTT法测定不同浓度半枝莲提取物对HT-29细胞增殖的影响,DNA Ladder试剂盒检测药物作用后细胞凋亡情况,AnnexinV-FITC/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡率,JC-1试剂盒检测线粒体膜电位变化,应用比色法分析Caspase-9和Caspase-3的活化情况。结果半枝莲提取物干预HT-29细胞24 h后,HT-29细胞密度明显减少、细胞变小,可明显抑制HT-29细胞增殖,细胞凋亡增加,线粒体膜电位丧失,具有显著地剂量依赖,并出现明显的DNA Lad-der条带;Caspase-9和Caspase-3的活化随着药物浓度的升高而增加。结论半枝莲提取物能通过线粒体通路诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡而发挥其抗肿瘤作用。     

5-杂氮-2′-脱氧胞苷联合苯丁酸钠对人结肠癌细胞HT29的抑制作用

目的:探讨DNA甲基化抑制剂5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-aza-2dC)联合组蛋白脱乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠(SPB)的抗肿瘤效应及其机制。方法:将HT29细胞分为:对照组、SPB(1mmol/L)处理组、5-aza-2dC(10μmol/L)处理组、5-aza-2dC(10μmol/L)+SPB(1mmol/L)处理组。MTT法测定各处理组细胞的生存曲线,流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率和细胞周期。结果:生长曲线结果提示:5-aza-2dC和SPB均能抑制HT29细胞的生长增殖,但差异不明显,联合应用后,细胞增殖得到明显抑制;流式细胞术检测细胞凋亡结果显示:SPB、5-aza-2dC、SPB+5-aza-2dC处理HT29后,细胞凋亡率分别为11.32%、20.25%和42.37%,三者比较有统计学差异(P<0.05);细胞周期分布检测显示:与对照组相比,单用SPB处理细胞,细胞周期分布变化不明显,5-aza-2dC处理细胞后,59.02%的细胞周期阻滞在G1期,而SPB联合5-aza-2dC后,S期细胞比例明显减少,G1期细胞比例可达73.7%,4组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:5-杂氮-2′-脱氧胞苷联合苯丁酸钠可通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞发挥抗肿瘤作用。     

ERp29——一种新的内质网蛋白

蛋白二硫键异构酶是内质网非常重要的氧化还原酶和分子伴侣,硫氧还结构域的两个活性半胱氨酸是蛋白功能的物质基础。ERp29是近十年来发现的特殊内质网蛋白,硫氧还结构域与蛋白二硫键异构酶相似但缺失活性半胱氨酸。它在动物细胞广泛存在,不具备已知分子伴侣的特征(N端糖基化、与ATP结合、与Ca2+结合)。虽然人们对其进行深入研究,包括空间结构、组织分布、病理模型的表达变化,但是ERp29的生物学功能还不清楚,暂时将之归类为蛋白分泌因子和外运蛋白。     

miR29c在鼻咽癌患者血清中的表达及临床意义

目的 探讨微小R29c(miR29c)在鼻咽癌患者和正常人血清中的表达及临床意义.方法 采用基于polyA加尾的荧光定量RT-PCR技术检测24例鼻咽癌患者和24例正常人血清中miR29c的表达.结果 鼻咽癌患者血清中miR29c的表达量明显低于正常人(P<0.05);有淋巴结转移的鼻咽癌患者血清中miR29c的表达量...     

ERp29基因的克隆及其在IEC-6细胞中的表达

目的克隆小鼠ERp29基因并在IEC-6细胞中表达.方法采用RT-PCR方法从小肠上皮细胞克隆该基因的编码区,经T-载体克隆并测序证实后构建真核表达载体,并转染IEC-6细胞,RT-PCR分析外源基因的表达.结果从小肠上皮细胞总RNA中成功地克隆了ERp29基因,序列测定结果表明克隆的序列与数据库中序列完全一致.构建的真核表达载体与预期一致,表达质粒转染细胞后的RT-PCR分析结果表明:外源的质粒得到了有效的表达.结论成功地克隆了ERp29基因,并获得真核表达.     

Expression of microRNA-29b2-c Cluster is Positively Regulated by MyoD in L6 Cells

Objectives To evaluate the expression profile of myoD microRNA-29 （miR-29） family in L6 myoblast differentiated to myotube or L6 myotube treated by glucose and insulin, and to further probe the molecular mechanism of myoD regulating the expression of miR-29 clusters.     

雷公藤多甙治疗多发性硬化病(MS)的临床观察

[目的]观察雷公藤多甙治疗多发性硬化病(MS)的临床疗效。[方法]复发-缓解型多发性硬化40例随机分为治疗组和对照组,对照组接受常规治疗;治疗组还加服雷公藤多甙片,评估主要指标、延伸残疾状况评估表和次要指标,多发性硬化影响评分和功能独立性评定评分,以及安全性指标。治疗终止3个月后,再次评分。[结果]病人全部完成试验,无脱落。与对照组相比,治疗组MSIS-29评分明显减低(P0.05)。治疗组患者的EDSS和FIM评分好于对照组。[结论]雷公藤多甙能够改善MS对患者的影响,需要更大规模的临床试验验证有效性和安全性。     

microRNA-29在心血管疾病中的研究进展

miRNA是一类内源性非编码的小RNA,它可以通过降解或抑制靶mRNA参与基因表达的调控。 miRNA在心血管的生理病理改变中起着重要的作用。 miRNA-29家族是其中之一,它既参与维持主动脉血管的完整性,又参与了动脉粥样硬化的调节,它还在心肌纤维化过程中发挥作用等。这些研究可以为临床诊治提供基因水平的诊断依据和新的治疗方向。     

RNAi抑制IEC-6细胞中ERp29表达

目的构建抑制大鼠ERp29基因表达的重组质粒,并在IEC-6细胞中发挥作用.方法根据大鼠ERp29的基因序列,设计合成含有发夹结构的寡核苷酸片段,经退火形成双链后克隆至pAVU6 27载体质粒中,对阳性重组子进行酶切和测序鉴定后转染正常IEC-6细胞,通过PCR方法对siERp29干扰片段进行鉴定,并采用Western blot检测ERp29蛋白水平的表达变化.结果重组质粒经双酶切后,有目的条带出现,提示ERp29干扰片段已克隆至pAVU6 27载体质粒中,DNA测序结果显示插入序列与预先设计完全一致.重组质粒转染IEC-6细胞后经G418筛选,成功获得阳性克隆,Western blot结果显示ERp29的蛋白水平表达显著下降.结论成功构建ERp29基因RNA干扰表达质粒,并在IEC-6细胞中发挥抑制作用,这为深入研究该基因在电离辐射中的作用奠定了基础.     

细粒棘球绦虫(中国大陆株)特异性抗原P-29重组蛋白的生物信息学分析

目的应用生物信息学分析软件预测细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29氨基酸序列,了解该蛋白的特性,预测其抗原表位,为P-29进一步应用研究提供理论依据。方法应用DNAStar、BIOSUN、EXPASY/SignalP、protparam、psite/softberry生物分析软件对P-29的二级结构、抗原表位、信号肽、极性进行预测分析,用EXPASY/SWISSMODEL对蛋白的三维结构进行模拟。结果 P-29基因开放阅读框编码一个由238个氨基酸残基组成的多肽,分子式为C1180H1906N324O386S9,其蛋白分子量为27095.58 Da,等电点为5.649,有37个碱性氨基酸,41个酸性氨基酸,68个极性氨基酸和76个疏水性氨基酸,半衰期是30 h,结构稳定,呈亲水性且为带负电荷的酸性蛋白,α-螺旋水平较高,有15个抗原决定簇,无信号肽,有2个N-糖基化位点,6个蛋白激酶C磷酸化位点,11个酪蛋白激酶II磷酸化位点及7个微体羧基端目标信号位点。结论根据生物信息学预测的结果表明,P-29可能是免疫诊断、药物作用及疫苗潜在的靶分子。