Survivin反义寡核苷酸对人结肠癌细胞HT29增殖和凋亡的影响

[目的]观察survivin反义寡核苷酸(ASODN)对HT29细胞增殖和凋亡的影响。[方法]针对sur- vivin基因序列设计合成survivin反义寡核苷酸并通过脂质体将其转染至HT29细胞中。噻唑蓝(MTT)法观察survivin ASODN对HT29细胞的细胞毒作用,测定IC_(50);Hoechst33342/PI双荧光染色后,观察转染survivin A- SODN后HT29细胞核变化;流式细胞仪检测细胞周期。[结果]200、400、600、800、1 000及1 200 nmol/L survivin ASODN分别处理HT29细胞44 h后,Ic_(50)值为1 000 nmol/L。200、400、600、800和1 200 nmol/L组抑制率分别为(12.38±7.96)%、(22.30±4.49)%、(26.51 4±3.08)%、(38.90±3.66)%和(63.97±4.50)%。1 000 nmol/L survivin ASODN处理HT29细胞36 h后,经Hoechest33342/PI双荧光染色可观察到染色质高度浓缩、边缘化,凝集成明亮的团块。流式细胞仪检测1 000 nmol/L survivin ASODN处理HT29细胞36 h后,G_2期细胞显著增多。[结论]Survivin ASODN可显著抑制HT29细胞增殖,诱导其凋亡。Survivin靶向治疗可能成为结肠癌综合治疗的一种重要方法。     

VEGF-C反义寡核苷酸对卵巢癌细胞SKOV3的黏附、侵袭能力的影响

目的:探讨VEGF-C反义寡核苷酸(VEGF-C,ASODN)对人卵巢癌细胞SKOV3黏附、侵袭能力的影响.方法:以VEGF-C基因编码区为靶点合成反义寡核苷酸,脂质体介导转染.MTT法检测卵巢癌细胞与细胞外基质黏附能力;利用transwell小室,检测卵巢癌细胞侵袭人工基底膜的能力;免疫组化法检测细胞中VEGF-C蛋白表达,western blot检测细胞中MMP-2蛋白表达.结果:与空白对照组及正义序列转染组相比,ASODN组对细胞外基质黏附率明显降低(P＜0.01),穿透重组基质膜数目明显下降(P＜0.01),细胞中VEGF-C、MMP-2蛋白表达明显下降(P＜0.01).结论:VEGF-C ASODN可明显抑制卵巢癌细胞体外实验中的黏附和侵袭能力,下调MMP-2的表达可能是其作用途径.     

β1整合素表达下调对人结肠癌细胞增殖和化疗敏感性影响

目的 观察β1整合素表达下调对人结肠癌HT-29细胞增殖和化疗敏感性的影响.方法 采用反义寡核苷酸(ASODN)技术转染HT-29细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测β1整合素表达下调情况.MTT法检测HT-29细胞相对存活率.给予梯度浓度氟尿嘧啶(5-FU),计算IC50.结果 实验组β1整合素条带吸光度积分(IAD)值/β-actin条带IAD值的比值及HT-29细胞的存活率与对照组相比显著降低(F=1 630.08,q=72.40,P<0.01;t=4.37,P<0.05).5-FU+ASODN组HT-29细胞对5-FU的IC50与5-FU组比较显著下降(t′=37.71,P<0.05).结论 β1整合素表达下调可抑制结肠癌细胞增殖,增强结肠癌细胞对化疗药物敏感性.     

ANGPTL3反义寡核苷酸对EC9706细胞侵袭黏附能力的影响

目的:观察ANGPTL3反义寡核苷酸(ASODN)对食管癌细胞EC9706侵袭黏附能力的影响.方法:根据GenBank收录的ANGPTL3 mRNA序列,设计ASODN,并制成脂质体-ASODN混合液转染EC9706细胞,观察转染后EC9706细胞黏附率、细胞侵袭穿膜细胞数及侵袭抑制率.结果:ANGPTL3 ASODN...     

生存素反义寡核苷酸对人胃癌细胞增殖的抑制作用

目的 探讨生存素（survivin）反义寡核苷酸（ASODN）对人胃癌细胞SGC7901增殖的抑制作用。方法 设计合成特异性靶向生存素的反义寡核苷酸。胃癌细胞株SGC7901分为4组：空白对照组、单纯脂质体对照组、正义链转染对照组、ASODN转染组。作用48h后收获各组细胞。Westernblot法检测各组细胞生存素表达情况，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，MTT法检测各组细胞的生长抑制率。结果 脂质体介导生存素反义寡核苷酸转染后的胃癌细胞出现生存素蛋白表达明显下降；ASODN转染组细胞凋亡率明显高于各对照组（P〈0．05），而各对照组问差异无显著性（P〉0．05）；ASODN转染组细胞的抑制率明显高于各对照组（P〈0．05），而各对照组问差异无显著性（P〉0．05）。结论 生存素反义寡核苷酸转染胃癌细胞能下凋生存素蛋白表达，诱导胃癌细胞凋亡，抑制细胞增殖，具有明显的抗癌作用。     

c-raf-1反义寡核苷酸转染对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用

目的：探讨c-raf-1基因反义寡核苷酸转染对人卵巢癌SKOV，细胞增殖的抑制作用及其分子机制。方法：实验分3组：正常对照组、c-raf-1正义治疗组、c-raf-1反义治疗组。脂质体转染后不同时间分别进行MTT试验、集落形成试验、荧光显微镜检测、蛋白质荧光强度测定，以观察不同条件处理后各组细胞的增殖、凋亡、蛋白质表达有无差别。结果：反义治疗组与正义治疗组比较：转染72h OD值分别0．272与1．307（P〈0．05）；克隆形成率分别为30．6％与75．0％（P〈0．05）；凋亡率分别为19．7％与9．2％（P〈0．05），同时明显地下调P74蛋白质的表达水平（P〈0．05）。结论：c-raf-1反义寡核苷酸对人卵巢癌SKOV，细胞的增殖有明显的抑制作用。     

ODC反义寡核苷酸对HL60细胞的生长抑制作用

目的：确定鸟氨酸脱羧酶（ＯＤＣ）反义寡核苷酸对ＨＬ６０细胞的抗增殖作用；探索该核苷酸是否有可能作为一种治疗癌症的潜化制剂。方法：采用自行设计人工合成的ＯＤＣ反义寡核苷酸，用ＭＴＴ法观察了其对ＨＬ６０细胞生长的影响，并以３Ｈ参入试验检测其ＲＮＡ及蛋白生物合成。结果：ＯＤＣ反义寡核苷酸可抑制ＨＬ６０细胞的增殖及ＲＮＡ、蛋白质的生物合成，并增强该细胞对抗肿瘤药物阿糖胞苷的敏感性。结论：应用反义技术控制ＯＤＣ表达将是抑制恶性细胞生长及增强肿瘤对化疗敏感性的１种可能途径。     

反义IGF-Ⅰ寡核苷酸转染对人肝癌细胞增生及凋亡的影响

为研究胰岛素样生长因子 I(IGF I)反义寡核苷酸转染对人肝癌细胞增生、分化及凋亡的影响 ,探讨寡核苷酸转染治疗肝癌的可行性 ,利用反义核酸技术 ,合成针对IGF I的寡核苷酸片段 ,利用脂质体包裹反义IGF I寡核苷酸片段瞬时转染人肝癌细胞系BEL 74 0 2细胞 ,MTT法检测细胞增生 ;放免法检测培养细胞上清中AFP、CEA的分泌量 ;采用末端标记 (Tunel)法检测细胞凋亡的变化。结果发现转染反义IGF I寡核苷酸可使人肝癌细胞系BEL 74 0 2细胞增生下降 ,AFP、CEA表达降低 ,凋亡细胞数量增多。反义IGF I寡核苷酸转染人肝癌细胞系BEL 74 0 2细胞可以降低细胞增生、减少细胞去分化并诱导肝癌细胞凋亡     

TGFβ1反义寡核苷酸对大鼠肝脏星状细胞激活及其胶原生成的抑制作用

为探讨 TGFβ1 反义寡核苷酸 (antisense oligonucleotides,ASON)对大鼠肝脏星状细胞活化及其胶原生成的作用 ,作者合成了特异性的 TGFβ1 硫代磷酸 ASON及其对照 (正义 ,错义寡核苷酸 ) ,并将其加入至培养的肝脏星状细胞中。通过细胞免疫化学方法分析 α- SMA的表达来观察肝脏星状细胞的活化 ,肝脏星状细胞产生TGFβ的水平用生物学方法测定 ,以 3H-脯氨酸掺入抑制率的测定观察胶原生成的变化。结果 :针对 TGFβ1 m RNA转译起始区的 ASON在终浓度为 1 0 μm ol/ L 时 ,能明显地抑制体外培养的肝脏星状细胞的激活、TGFβ1 的产生及其胶原的生成能力 ,而对照组寡核苷酸在相同浓度下未见抑制效应。上述结果表明 ,ASON对肝脏星状细胞无损伤作用。 TGFβ1 ASON可能成为一种潜在的抗肝纤维化治疗的药物。     

KDR反义寡核苷酸对人胃癌细胞的作用

目的　用 KDR反义寡核苷酸作用于人胃腺癌细胞 ,观察对细胞增殖及超微结构的影响 ,检测作用后 KDR基因的表达 ,并测定细胞分泌 VEGF的能力 .方法　 MTT法测定细胞的增殖能力 ,电镜下观察细胞的超微结构 .原位杂交及免疫组化法检测 KDR m RNA及蛋白的表达 .ELISA法测细胞培养液中人 VEGF的含量 .结果　 KDR ASODN可明显的抑制人胃腺癌细胞增殖 .增殖抑制率最高可达 55.4% .当剂量为 2 0μmol· L-1 时还可诱发细胞凋亡 .KDR ASODN能明显抑制细胞内 KDR m RNA和蛋白的表达 .胃癌细胞还能分泌一定量的人 VEGF:(92± 1 .7) ng· L-1 .结论　胃癌细胞能分泌一定量的人 VEGF.KDR ASODN能抑制细胞内 KDR基因的表达 ,并显著抑制胃癌细胞的增殖 .在一定剂量下还可诱发其凋亡 .说明 VEGF及受体 KDR在人胃腺癌细胞的增殖、凋亡的调控中起重要作用     

5-杂氮-2′-脱氧胞苷联合苯丁酸钠对人结肠癌细胞HT29的抑制作用

目的:探讨DNA甲基化抑制剂5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-aza-2dC)联合组蛋白脱乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠(SPB)的抗肿瘤效应及其机制。方法:将HT29细胞分为:对照组、SPB(1mmol/L)处理组、5-aza-2dC(10μmol/L)处理组、5-aza-2dC(10μmol/L)+SPB(1mmol/L)处理组。MTT法测定各处理组细胞的生存曲线,流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率和细胞周期。结果:生长曲线结果提示:5-aza-2dC和SPB均能抑制HT29细胞的生长增殖,但差异不明显,联合应用后,细胞增殖得到明显抑制;流式细胞术检测细胞凋亡结果显示:SPB、5-aza-2dC、SPB+5-aza-2dC处理HT29后,细胞凋亡率分别为11.32%、20.25%和42.37%,三者比较有统计学差异(P<0.05);细胞周期分布检测显示:与对照组相比,单用SPB处理细胞,细胞周期分布变化不明显,5-aza-2dC处理细胞后,59.02%的细胞周期阻滞在G1期,而SPB联合5-aza-2dC后,S期细胞比例明显减少,G1期细胞比例可达73.7%,4组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:5-杂氮-2′-脱氧胞苷联合苯丁酸钠可通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞发挥抗肿瘤作用。     

人CD59 RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定

目的 利用siRNA表达载体法构建并筛选携带针对CD59基因pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体及稳定产毒的细胞克隆.方法 用DNA重组技术,将3条60 bp能转录产生靶向CD59小发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸序列定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro,脂质体法转染包装细胞系Phoenix A,建立产生逆转录病毒的细胞克隆.结果 重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后测序序列正确;重组载体转染包装细胞,可表达绿色荧光蛋白,表明包装成功.结论 特异性沉默CD59基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞系构建成功,为后续进行肿瘤细胞的研究奠定了基础,可望为肿瘤治疗开辟新途径.     

生殖器疱疹患者外周血淋巴细胞B7-CD28/CTLA-4的检测分析

目的研究外周血B7-CD28/CTLA-4（CD152）T淋巴细胞活化协同刺激分子在生殖器疱疹（Genital herpes,GH）患者发病机制中的作用。方法用流式细胞仪检测51例GH患者和15例健康体检者外周血淋巴细胞CD80/86及CD4＋/CD8＋T淋巴细胞中B7-CD28/CTLA-4的表达。结果GH患者恢复组与对照组比较,CD80、CD86的阳性表达较对照组明显升高,差异有统计学意义（P〈0.05）。其余各组间CD80、CD86比较差异无统计学意义。恢复组CD8＋/CD28阳性表达显著高于非复发组（P〈0.05）;非复发组显著高于对照组（P〈0.05）;复发组的CD4＋/CD152、CD8＋/CD152的阳性表达显著高于非复发组（P〈0.05）。其余各组间CD4＋/CD152、CD8＋/CD152及CD4＋/CD28、CD8＋/CD28表达差异无统计学意义。结论单纯疱疹病毒感染可诱导CD80、CD86、CD28和CD152活化增殖,高表达负性共刺激分子和分泌抑制性细胞因子,通过多种机制抑制机体的抗病毒免疫应答。     

脱氧紫色杆菌素抑制结肠癌TH29细胞增殖及诱导凋亡作用与机制

目的探讨脱氧紫色杆菌素(Deoxyviolacein)对人结肠癌HT29细胞增殖抑制和诱导凋亡及其可能机制。方法用不同浓度的脱氧紫色杆菌素处理HT29细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法,检测脱氧紫色杆菌素对HT29细胞的抑制率;流式细胞术检测细胞周期和凋亡;Western Blot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Caspase9表达的变化。结果脱氧紫色杆菌素对HT29细胞有明显的增殖抑制作用;可提高G0/G1期细胞比例,降低S期细胞比例;细胞凋亡率升高,Bax和Caspase9蛋白表达升高,Bcl-2蛋白的表达降低。结论脱氧紫色杆菌素抑制结肠癌HT29细胞增殖并诱导凋亡,其凋亡机制可能作用于线粒体介导的内源性通路。     

原代大鼠肾小球系膜细胞最佳电转染条件的探索和验证

目的探索并验证原代大鼠肾小球系膜细胞最佳电转染条件。方法设立不同的电压与电容组合、电击前孵育温度、质粒DNA浓度等电转染条件,将绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1导入原代大鼠肾小球系膜细胞。24h后比较各组细胞存活率和绿色荧光蛋白表达情况,确立最佳电转染条件。再以此条件电转染质粒pcDNA3.1和pcDNA3.1-FHL2,48h后收取两组细胞RNA和蛋白。应用RT-PCR和Western印迹检测目的基因FHL2的核酸和蛋白表达,验证电转染效果。结果在电击前室温孵育,40μg质粒,340V电压、550μF电容的最佳电转染条件下,原代大鼠肾小球系膜细胞的电转染效率可达40%以上,细胞存活率在50%左右。转染FHL2质粒组较对照组检测FHL2的核酸和蛋白表达水平明显升高（P〈0.05）。结论适当的电转染条件可以有效转染原代大鼠肾小球系膜细胞。     

共刺激分子CD80和CD86在蠕虫保护性免疫及其Th2免疫应答中作用机制的研究

目的:探讨共刺激分子CD80和CD86在蠕虫保护性免疫及其Th2免疫应答中的作用机制。方法:采用巴西日圆线虫第3期幼虫感染BALB/c小鼠,在感染当天、感染后第3、7d分别腹腔注射大鼠抗CD80和/或抗CD86单克隆抗体,以阻断协同刺激信号。在感染当天,感染后第7、14d,计数小鼠外周血液的嗜酸性粒细胞,于感染后第14d计数小肠绒毛嗜酸性粒细胞;采用WatanabeN法测定IgE。结果:联合应用抗CD80和抗CD86两种单克隆抗体可导致成虫产卵量明显增加,成虫数量显著增多及排虫时间延迟。同时两种单克隆抗体也完全抑制了外周血液及小肠组织的嗜酸性粒细胞的增多并部分抑制了IgE水平的升高。而单独应用抗CD80或抗CD86McAb对保护性免疫及Th2型免疫应答反应均无明显影响。结论:在蠕虫保护性免疫和Th2型免疫应答反应中,T细胞的活化需要CD80和CD86两种共刺激分子的参与;而CD80或CD86单一刺激分子即可提供足够的共刺激信号。研究提示,人为调控CD80和CD86共刺激分子可能有助于对蠕虫病及Th2型免疫应答所介导的其它疾病的治疗。     

小鼠pLCK-CD69-IRES-EGFP表达载体构建及CD69转基因小鼠的建立

目的构建携小鼠细胞表面活化蛋白CD69和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)在细胞内核糖体切入位点(IRES)的表达载体pLCK-CD69-IRES-EGFP, 并基于此创建CD69转基因小鼠。方法首先通过小鼠肺组织提取RNA, 逆转录成为cDNA, 经过PubMed搜索设计PCR引物, PCR法扩增mCD69片断, 接着将该DNA片段经测序验证后接入pInsulater-LCK-IRES-EGFP质粒, 构建pLCK-CD69-IRES-EGFP转基因载体; 再将其转染到293T细胞中, 通过荧光显微镜技术确定其在293T细胞中的表达状况; 最后将载体显微注射入受精卵并移植入假孕母小鼠, 出生小鼠取尾经PCR鉴定获得阳性首建鼠, 并通过荧光显微镜和流式细胞术确定淋巴细胞上CD69的表达。结果经酶切、DNA测序鉴定证实pLCK-CD69-IRES-EGFP表达载体构建成功; 荧光倒置显微镜检查证实其在转染的293T细胞内的蛋白表达; 小鼠取尾PCR鉴定明确CD69转基因小鼠创建成功; CD69转基因小鼠有外周血淋巴细胞的减少及静息状态下CD69的表达。结论成功构建pLCK-CD69-IRES-EGFP表达载体及制备CD69转基因小鼠, 为CD69在炎症性疾病中作用的整体模型研究奠定了基础。     

子宫内膜异位症并盆腔积液患者 CD8＋CD28-T细胞的表达及临床意义

目的：探讨CD8＋CD28-T细胞在子宫内膜异位症（ EMT）发病机制中的作用。方法收集EMT患者合并盆腔积液80例（Ⅰ期15例、Ⅱ期12例、Ⅲ期22例、Ⅳ期31例）,采用流式细胞术检测其外周血及盆腔积液内CD8＋CD28-T细胞及其胞内细胞因子转化生长因子β1（TGF-β1）及白介素10（IL-10）比率,并选取同期年龄相似的20例健康体检女性志愿者为对照组。结果与健康对照组比较,Ⅰ-Ⅳ期EMT患者外周血CD8＋CD28-T细胞、TGF-β1及IL-10比率均明显升高,表现为Ⅳ＞Ⅲ＞Ⅱ＞Ⅰ,且两两比较差异均有统计学意义（ P ＜0.05）;EMT患者盆腔积液CD8＋CD28-T细胞、TGF-β1及IL-10的频率同样表现为Ⅳ＞Ⅲ＞Ⅱ＞Ⅰ,且以TGF-β1的组间差异最为明显（ P ＜0.05）。 CD8＋CD28-T细胞、TGF-β1及IL-10与分期呈正相关（ rs ＝0.791,0.753,0.726, P ＜0.05）。结论 CD8＋CD28-T细胞、TGF-β1及IL-10在EMT发病机制当中具有重要作用,三者可能是EMT的一个不利因素,并且与EMT的分期密切相关;细胞因子TGF-β1在EMT盆腔积液形成过程中起到重要作用。     

HIV感染对记忆型和处女型CD4+T细胞上CD95的影响

目的：了解CD95在HIV感染者记忆型和处女型CD4^-T细胞表面的表达情况，探讨Fas／CD95在HIV感染中的作用。方法：采用流式细胞检测仅(FACS)对HIV感染者外周血CD4^ T细胞表面CD95、CD45RA、CD45RO的表达进行分析，用ENSA检测血清中Fas水平。结果：HIV感染后，血清Fas水平随疾病的进展而逐渐升高，同时伴有处女型T细胞表面CD95表达增高以及记忆型T细胞CD95表达逐渐下降。结论：Fas参与了HIV的感染过程。研究Fas和CD95、CD45RA、CD45RO之间的关系，可以加深对HIV致病机制的认识，并可了解疾病的进展情况和指导治疗。