表达绿色荧光蛋白的小鼠胚胎干细胞系的生物学特性

目的：研究绿色荧光蛋白（GFP）在小鼠胚胎干细胞系R1中整合并高效稳定表达后对宿主细胞生物学特性的影响。方法：从生长曲线、碱性磷酸酶表达水平、正常核型率及体内多向分化能力等4个方面,对整合有GFP高效表达载体的RES细胞亚克隆,进行生物学特性的比较分析。结果：R1ES细胞与4个高效稳定表达GFP的ES细胞克隆在细胞增殖速率分化状态及正常核型率上均无显差异;将GFP（ ）ES细胞接种裸鼠后,均可有效形成含有3个胚层细胞的畸胎瘤。结论：外源基因GFP在R1ES细胞中的整合及稳定高效表达对于ES细胞的基本生物学特性无明显影响。为有效利用GFP进行ES细胞体内的示踪研究提供了保障。     

不同转染方法及GFP表达载体对小鼠胚胎干细胞转染效率的比较

目的对比不同的转染方法及绿色荧光蛋白(GFP)表达载体对小鼠胚胎干细胞(ESC)的转染效率,为进一步研究ESC及衍生细胞移植示踪提供工具。方法用阳离子脂质体转染小鼠胚胎干细胞系ES-D3,对比贴壁细胞转染法、悬浮细胞转染法及不同载体pCX-EGFP、p-EGFP-C1和pIRES-hrGFP的转染效率。结果悬浮法和贴壁法转染效率分别为(90.0±4.1)%,(70.0±2.3)%,两组比较差异有显著性意义(P<0.05)。3种载体转染效率分别为pCX-EG-FP(90.0±4.1)%,pIRES-hrGFP(32.0±6.0)%,p-EGFP-C1(4.0±0.4)%。3组间两两比较差异均有显著性意义(P<0.05)。结论悬浮转染法转染pCX-EGFP可获得较高的转染效率。     

人胚胎心脏干细胞系已建立

1998年美国Thomson和Gearhart研究小组分别用不同方法分离获得并建立了人胚胎干细胞(embryonic stemcell，ES)和人胚胎生殖细胞(embryonic germ cell，EG)系，成为干细胞研究史上里程碑性的进展，之后，国内外先后分离培养了神经干细胞、胚胎腭突间充质干细胞及胰腺干细胞等。为寻找心血管组织工程(cardiovascular tissue engineering，CvTE)适宜的种子细胞，第二军医大学生物医学工程研究所的研究人员进行了相关的探索工作，并初步建立了胚胎心脏干细胞(embryonic cardiac stem cells，ECSCs)系。     

胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎干细胞生长

目的探讨小鼠胚胎干细胞(mESCs)来源的饲养细胞是否具备支持自体mESCs未分化生长的能力.方法先诱导mESCs形成类胚体(EB),进一步诱导其分化为成纤维细胞(mEB-dFE),以用作饲养细胞.采用形态学、集落形成率、细胞分化率、免疫细胞化学、碱性磷酸酶染色和RT-PCR对生长在mEB-dF上的mESCs的未分化特性进行鉴定.采用RT-PCR和诱导mESCs体内外分化方法鉴定mESCs多分化潜能特性.结果从EB三个发育阶段(EB贴壁10、15、20 d)分离出48个mEB-dF系,其中5个(来自15 d的EB)能维持mESCs未分化生长和多潜能性达10代以上.生长在这种饲养层上的mESCs与生长在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上一样,其特性无明显差异,均表达碱性磷酸酶和特殊的mESCs标记,包括SSEA-1、OCT-4、NANOG,在体外形成EB和体内形成畸胎瘤;其他43个mEB-dF系则不具有这种能力.结论研究不仅为mESCs体外培养提供了一种新的饲养细胞,避免了MEF作饲养细胞的许多不足;而且还提示mESCs可诱导出不同功能的成纤维样细胞,其差异的分子机制值得进一步研究.     

胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎干细胞生长

目的探讨小鼠胚胎干细胞(mESCs)来源的饲养细胞是否具备支持自体mESCs未分化生长的能力。方法先诱导mESCs形成类胚体(EB),进一步诱导其分化为成纤维细胞(mEB-dFE),以用作饲养细胞。采用形态学、集落形成率、细胞分化率、免疫细胞化学、碱性磷酸酶染色和RT-PCR对生长在mEB-dF上的mESCs的未分化特性进行鉴定。采用RT-PCR和诱导mESCs体内外分化方法鉴定mESCs多分化潜能特性。结果从EB三个发育阶段(EB贴壁10、15、20 d)分离出48个mEB-dF系,其中5个(来自15 d的EB)能维持mESCs未分化生长和多潜能性达10代以上。生长在这种饲养层上的mESCs与生长在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上一样,其特性无明显差异,均表达碱性磷酸酶和特殊的mESCs标记,包括SSEA-1、OCT-4、NANOG,在体外形成EB和体内形成畸胎瘤;其他43个mEB-dF系则不具有这种能力。结论研究不仅为mESCs体外培养提供了一种新的饲养细胞,避免了MEF作饲养细胞的许多不足;而且还提示mESCs可诱导出不同功能的成纤维样细胞,其差异的分子机制值得进一步研究。     

绿色荧光蛋白基因在小鼠胚胎干细胞中表达效率的影响因素分析

目的：研究绿色荧光蛋白（GFP）基因在小鼠胚胎干细胞系R1中表达的影响因素。方法：构建3个不同的GFP真核表达载体。并从转录,蛋白表达水平比较了它们整合于宿主细胞染色体中的表达效率。结果：在GFP蛋白表达水平上,含肽链延长因子（EF）启动子的表达载体和所转染的克隆明显高于含CMV启动子及含双拷贝CMV-GFP表达单元的表达载体;而录水平与蛋白质水平的测定结果相一致。结论：（1）在NIH3T3和R1胚胎干细胞系中,EF启动子引导下的GFP基因表达效率明显高于CMV启动子;（2）外源基因表达单元的拷贝数在染色体中的少量增加,不能明显提高表达效率;（3）获得了在R1胚胎干细胞系中稳定、高效表达GFP的载体,为后续工作奠定了基础。     

小鼠胚胎干细胞建系及GFP标记

目的：为组织工程提供新型种子细胞,建立胚胎干（ES）细胞系。方法：取129／svj白色小鼠4.5d的囊胚,分离囊胚的内细胞团（ICM）细胞;在条件培养液及小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）作铺层下,细胞扩增传代,碱性磷酸酶（AKP）染色及oct4、ssea-1等特异性抗体鉴定细胞,并将细胞注射至裸鼠皮下观察细胞在动物体内的生长变化。结果：细胞体外培养呈“巢状”生长,可以持续传代;AKP染色及oct4、ssea-1等特异性抗体免疫反应均阳性;裸鼠皮下注射的细胞发育生长为包含各胚层细胞成分的畸胎瘤。在此基础上以基因转染方法将细胞标记绿色荧光蛋白（GFP）。结论：从小鼠ICM所分离的细胞为小鼠胚胎干细胞,且标记GFP的ES细胞在传代及形成胚体的过程中均能显示GFP,对将来组织构建的种子细胞起到示踪作用。     

猪naive-like诱导性多能干细胞系的建立及红色荧光蛋白标记

目的：建立猪naive-like诱导性多能干(induced pluripotent stem,iPS)细胞系,并对其进行红色荧光标记,为通过示踪猪naive iPS细胞发育和分化的相关研究奠定基础。方法：首先利用核转染技术向巴马小型猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblast,PEF)中转入鼠源OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC转录因子表达载体TetO-FUW-OSKM,并同时转入激活表达载体FUW-M2rtTA,采用白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)结合碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的培养体系进行培养,通过在培养液中添加盐酸多西环素(doxycycline hyclate,DOX) 进行诱导,建立起猪iPS细胞系,并对细胞系的多能性进行鉴定。在此基础上,向iPS细胞系转入红色荧光蛋白表达载体,对其进行标记,并鉴定被红色荧光标记后的细胞是否仍然具有多能性。结果：所建立的iPS细胞系克隆呈三维立体生长,可以进行单细胞传代培养至30代以上,核型正常,碱性磷酸酶染色呈阳性,表达多种干细胞多能因子,利用LIF/STAT3信号通路维持其增殖,体外可分化形成表达三胚层相关基因的类胚体,为猪naive-like iPS细胞系。成功对所建立的iPS细胞系进行红色荧光标记,碱性磷酸酶染色和免疫荧光染色结果显示被红色荧光标记的iPS细胞的多能性依然存在。结论：成功建立了稳定表达红色荧光蛋白的猪naive-like iPS细胞系。     

人胚胎干细胞系的初步建立

目的：探讨人受精卵建立人胚胎干细胞系。方法：将体外受精获得的人受精卵发育至胚胎泡期,用机械法去除胚泡透明带后,取出内细胞团,分散后接种在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,进行传代培养。通过碱性磷酸酶染色、胚胎干细胞特异性表面标志物检测、染色体核型分析和严重联合免疫缺陷（SCD）小鼠体内畸胎瘤形成实验,对连续传代的细胞进行鉴定。结果：9枚受精卵在体外培养5-7d后,5个存活并发育为胚泡,取出的内细胞团经接种培养,3个内细胞团存活,呈克隆性生长,发育为胚胎干细胞,并连续体外传代7个月保持未分化状态,建系成功。3个细胞系分别命名为CHE1、CHE3和CHE3。取3个细胞系第5、15和30代的细胞进行碱性磷酸酶染色,均为阳性。对CHE3第25、30、40代、CHE1和CHE2第21、22、30代的细胞检测人胚胎干细胞表面标志SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60和GCTM-2,结果均为阳性;检测小鼠胚胎干细胞表面标志SSEA-1,结果为阴性。染色体核型分析为二倍体核型。将连续传代5个月后（30代左右）的3个细胞系接种到SCID小鼠体内,6周后均形成畸胎瘤,组织病理学检查显示含有3个胚层的组织结构。结论：使用5个人受精卵来源的胚泡,成功地在体外建立了3个胚胎干细胞系,长期传代后仍保持胚胎干性和多向分化的能力。     

人HBV、HBx定向敲入p53位点大鼠胚胎干细胞株的建立

目的 建立人HBV、HBx定向敲入p53位点的大鼠胚胎干细胞株,为建立相关动物模型奠定基础.方法 通过PCR方法扩增出人p53基因上下游同源臂、HBV全基因组序列、HBV的X蛋白编码基因(HBx),将其插入本实验室自主构建的基因打靶通用载体pKO中,分别构建pKO-gHBV及pKO-X打靶载体.载体经SalⅠ酶切线性化后,电转入状态良好的大鼠胚胎干细胞株中,经3轮药物筛选,获得单细胞克隆.通过PCR技术筛选获得阳性细胞克隆,并进行支原体污染鉴定和核型分析.结果 成功构建pKO-gHBV及pKO-X打靶载体;电转大鼠胚胎干细胞株,经3轮药物筛选,分别挑取若干细胞克隆,其中2个pKO-X细胞克隆和1个pKO-gHBV细胞克隆经PCR鉴定、支原体检测和核型分析确定结果正确.结论 成功建立了人HBV、HBx定向敲入p53位点的大鼠胚胎干细胞株,为后续建立动物模型奠定了基础.     

绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白共转染骨髓间充质干细胞、乳鼠心肌细胞、Eahy926细胞表达特征的共聚焦分析

目的利用携带绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)报告基因的慢病毒载体共转染,观察2种报告基因在人骨髓间充质干细胞(hMSC)、乳鼠心肌细胞(Myo)和内皮细胞株(Eahy926)中的整合表达特征。方法应用人类1型免疫缺陷病毒改造而构建慢病毒载体,将GFP、RFP以同时或先后方式共转染hMSC、乳鼠Myo和Eahy926细胞,激光共聚焦显微镜观察2种报告基因在不同细胞中的共表达特点。结果 3种细胞均能被GFP、RFP共转染,其中hMSC和乳鼠Myo均有竞争加随机转染方式,Eahy926只有随机转染方式;3种细胞转染GFP、RFP的效率有所不同,共表达2种报告基因的细胞表现为以核为中心的表达区域重叠。结论 hMSC、乳鼠Myo和Eahy926细胞均可共转染2种报告基因,但整合方式有所不同,这将对利用多个报告基因同时示踪细胞多种生命特征提供有力帮助。     

利用CRISPR/Cas9系统建立叉头框G1基因敲除的人胚胎干细胞系

目的 采用成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9（CRISPR/Cas9）基因编辑技术构建叉头框G1（FOXG1）基因敲除的人胚胎干细胞系,研究FOXG1基因在人胚胎干细胞早期神经诱导过程中的作用。方法 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过转染2个向导RNA（gRNA）诱导人胚胎干细胞FOXG1基因的大片段敲除,经单克隆筛选、测序分析和蛋白质印迹分析验证获得FOXG1基因敲除的人胚胎干细胞;通过细胞免疫荧光染色、qRT-PCR检测FOXG1基因敲除前后细胞在早期神经诱导过程中关键标志物配对框基因6（PAX6）、性别决定区Y框蛋白2（SOX2）和正小齿同源物2（OTX2）的表达。结果 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得FOXG1基因大片段缺失的人胚胎干细胞,细胞免疫荧光染色、qRT-PCR结果均显示人胚胎干细胞早期神经诱导过程中的关键标志物PAX6、SOX2和OTX2的表达并未受FOXG1缺失的影响。结论 通过2个gRNA共转染可以快捷地诱导人胚胎干细胞FOXG1基因的大片段敲除。FOXG1基因缺失并不影响人胚胎干细胞的早期神经诱导。     

p α-MHC/EGFP小鼠胚胎干细胞株的构建及其向心肌细胞分化的观察

目的构建含有心肌特异性基因肌球蛋白重链α(α-MHC)调控的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的载体并转染到小鼠胚胎干细胞(ESC),建立p α-MHC/EGFP小鼠ESC株,利用该细胞株可识别和纯化分化形成的心肌细胞。方法应用电穿孔技术将pα-MHC/EGFP载体转染到ESC,G418筛选10~12d后收集G418抗性细胞克隆并采用悬滴法体外诱导向心肌分化。通过PCR扩增细胞克隆基因组EGFP片段,并在心肌分化过程中通过荧光显微镜观察EGFP的表达,鉴定pα-MHC/EGFP胚胎干细胞株的建立。细胞免疫组化法检测自发性搏动拟胚体(EB)中EGFP阳性区域心肌肌钙蛋白T的表达。结果G418抗性细胞克隆基因组中能够扩增EGFP片段;在心肌细胞分化过程中,荧光显微镜下能观察到EB局部出现自发性搏动的亮绿色细胞团;细胞免疫组化检测显示,EGFP阳性区域肌钙蛋白T表达阳性。结论成功构建了pα-MHC/EGFP胚胎干细胞株,该细胞株在分化为心肌细胞的同时表达EGFP,便于对心肌细胞进行识别和纯化。     

Establishment of Stable High Expression Cell Line with Green Fluorescent Protein and Resistance Genes

Mammalian expression systems have an undis-puted long-standing and very successful history forthe generation of recombinant proteins.While re-combinant proteins expressed in the cytoplasm ofbacteria are ofteninsoluble,inactive,soluble,andbioactive proteins can frequently be obtained fromeukaryotic cells.Furthermore,eukaryotic cellshave the capacity to carry out posttranslationalmodification,such as glycosylation,phosphoryla-tion ontyrosine,serine,andthreonine residues,orthe addition of fatty a…     

Establishment of human embryonic stem cell line from gamete donors

Background Human embryonic stem (HES) cell derived from human blastocyst can be propagated indefinitely in the primitive undifferentiated state while remaining pluripotent. It has exciting potential in human developmental biology, drug discovery, and transplantation medicine. But there are insufficient HES cell lines for further study. Methods Three oocyte donors were studied, and 3 in vitro fertilization (IVF) cycles were carried out to get blastocysts for the establishment of HES cell line. Isolated from blastocysts immunosurgically, inner cell mass (ICM) was cultured and propagated on mouse embryonic fibroblasts (MEFs). Once established, morphology, cell surface markers, karyotype and differentiating ability of the cell line were thoroughly analyzed. Results Four ICMs from 7 blastocysts were cultured on MEFs. After culture, one cell line ( criES-1 ) was established and met the criteria for defining human pluripotent stem cells including a series of markers used to identify pluripotent stem cells, morphological similarity to primate embryonic stem cells and HES reported else where. Normal and stable karyotype maintained over 60 passages, and demonstrated ability to differentiate into a wide variety of cell types. Conclusions HES cell lines can be established from gamete donors at a relatively highly efficient rate. The establishment will exert a widesoread impact on biomedical research.     

Derivation and characterization of Chinese human embryonic stem cell line with high potential to differentiate into pancreatic and hepatic cells

Background  Human embryonic stem cells have prospective uses in regenerative medicine and drug screening. Every human embryonic stem cell line has its own genetic background, which determines its specific ability for differentiation as well as susceptibility to drugs. It is necessary to compile many human embryonic stem cell lines with various backgrounds for future clinical use, especially in China due to its large population. This study contributes to isolating new Chinese human embryonic stem cell lines with clarified directly differentiation ability.

Methods  Donated embryos that exceeded clinical use in our in vitro fertilization-embryo transfer (IVF-ET) center were collected to establish human embryonic stem cells lines with informed consent. The classic growth factors of basic fibroblast growth factor (bFGF) and recombinant human leukaemia inhibitory factor (hLIF) for culturing embryonic stem cells were used to capture the stem cells from the plated embryos. Mechanical and enzymetic methods were used to propogate the newly established human embryonic stem cells line. The new cell line was checked for pluripotent characteristics with detecting the expression of stemness genes and observing spontaneous differentiation both in vitro and in vivo. Finally similar step-wise protocols from definitive endoderm to target specific cells were used to check the cell line’s ability to directly differentiate into pancreatic and hepatic cells.

Results  We generated a new Chinese human embryonic stem cells line, CH1. This cell line showed the same characteristics as other reported Chinese human embryonic stem cells lines: normal morphology, karyotype and pluripotency in vitro and in vivo. The CH1 cells could be directly differentiated towards pancreatic and hepatic cells with equal efficiency compared to the H1 cell line.

Conclusions  This newly established Chinese cell line, CH1, which is pluripotent and has high potential to differentiate into pancreatic and hepatic cells, will provide a useful tool for embryo development research, along with clinical treatments for diabetes and some hepatic diseases.

     

体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.