小鼠精原干细胞体外培养的研究

目的建立精原干细胞与Sertoli共培养细胞模型,探讨Sertoli支持精原干细胞扩增的可能机制。方法以7—8 d龄小鼠为材料,Percoll密度梯度离心,并将分离后的生精细胞接种至Sertoli饲养层上,37℃下共培养,在倒置相差显微镜下观察细胞的生长特点,并对培养15 d的细胞进行苏木精-伊红染色、C-Kit受体检测。结果①增殖细胞的生长特点及形态学特征与文献报道精原干细胞的特征相符合。②苏木精-伊红染色显示培养的生殖细胞大小均匀,核大而圆着色深。C-Kit受体显示细胞膜呈强阳性,背景基质细胞为阴性。这些均符合精原干细胞的生物学特征。结论精原干细胞在未加入细胞因子的Sertoli饲养层中能较长时间生长并分裂增殖。     

精原干细胞移植

精原干细胞 (SSCs)是哺乳动物成体睾丸生精上皮内唯一可复制的多潜能二倍体细胞 ,它能在体外分离纯化、培养、冻存及同体或异体移植。 1994年 ,RalphBrinster实验室[1] 首次报道了SSCs移植 ,并证明它在运用于干细胞以及支持细胞 生殖细胞相互关系的研究中是一项技术性的突破。     

Oct-4在精原干细胞定向诱导分化中的表达

目的：检测Oct-4在小鼠精原干细胞（mouse spermatogonial stem cells,mSSCs）体外诱导分化中的表达。方法：①体外培养mSSCs;②用干细胞因子（SCF,stem cell factor）对mSSCs进行精母细胞方向诱导分化;③通过形态学观察和c-kit,GCNF间接免疫荧光染色鉴定mSSCs是否发生分化;④通过间接免疫荧光染色和RT-PCR分别从蛋白水平和mRNA水平检测Oct-4在mSSCs诱导分化前后的表达情况。结果：①形态学观察mSSCs细胞核较大,细胞质少,SCF诱导培养后,随着培养时间的延长,细胞克隆逐渐增长缓慢,并出现衰退、凋亡的细胞;②c-kit,GCNF间接免疫荧光染色结果显示,mSSCs经SCF诱导后发生分化;③Oct-4间接免疫荧光染色和RT-PCR结果显示,Oct-4在mSSCs诱导前表达水平最高,诱导2天后下降,5天后几乎不表达。结论：Oct-4是mSSCs未发生分化的标志。     

GDNF干预对化疗致精原干细胞耗竭小鼠生精细胞恢复效果的研究

目的：研究外源胶质细胞源性神经营养因子（ glialcell line - derived neurotrphic factor, GDNF）对化疗致不育小鼠生精细胞的恢复效果,明确GDNF促进在体精原干细胞再生的效果。方法：4周龄雄性C57小鼠腹腔注射白消安（30mg／kg）,注射后4周按601．Lg／kg体重剂量腹腔注射GDNF进行干预,每天一次连续注射7d。在干预后第4周收集睾丸,检测睾丸重量、通过HE染色检测生精小管中生殖细胞恢复情况;通过RT—PCR检测GDNF和SCF基因表达评价GDNF注射对小鼠精原干细胞微环境的影响。结果：在GDNF干预后第4周,睾丸重量明显得到恢复,生精小管中上皮细胞数量明显得到恢复,精原干细胞微环境中再生因子GDNF和分化因子SCF表达水平稳定。结论：GDNF干预可以促进化疗致精原干细胞耗竭小鼠睾丸中生精细胞数量明显恢复,且维持了精原干细胞微环境中再生分化调控的平衡关系。     

小鼠精原干细胞生物学特征的研究

目的:探讨培养状态下精原干细胞的生物学特征,为体外鉴定精原干细胞及认识精原干细胞在体内的生物学行为打下实验基础.方法:在预先制备的骨髓基质饲养单层上接种生后6～10天雄性小鼠生精细胞,于IMDM培养基及37℃下培养,倒置显微镜观察细胞增殖行为并对增殖后的细胞进行组织学、细胞化学、免疫组化及遗传学检测.结果:培养状态下的精原干细胞增殖经历了短暂增殖期、静止期和分离增生期三个阶段,且增殖细胞呈簇、团状生长,细胞问可见明显的胞质间桥,细胞核大,核/质比高,碱性磷酸酶及C-KIT受体阳性,染色体核型为20对(40条).结论:精原干细胞具有典型的生物学行为和特征,结合行为及生物学特征可对增殖的精原干细胞进行鉴定.     

精原干细胞的研究进展

精原干细胞(sperm atogon ial stem cells)是一群具有高度自我更新能力和多向分化潜能的细胞,它能向子代传递遗传信息,是男性成体内唯一可复制的双倍体细胞。精原干细胞在医学、生物工程学、遗传、转基因研究等方面有着广阔的应用前景。现将近年来精原干细胞的研究成果综述如下     

非人灵长类动物精原干细胞研究进展

精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）是维持精子发生的一类干细胞,由于与人亲缘关系的相近性,使得开展非人灵长类动物SSCs研究具有重要的理论意义和比较医学价值。本文综述了非人灵长类动物SSCs的生物学特性、鉴定方法、冷冻保存、移植及生精细胞缺失模型建立等方面的研究进展。     

单细胞测序技术在精原干细胞研究中的应用进展

男性不育症正受到越来越多的关注,但其发生、发展的分子机制尚不明确,诊断、检测和治疗手段仍不完善。精原干细胞作为维持男性生育能力的基础,在男性不育症的发生和发展中起到决定性的作用。传统的测序技术是对大量的混合细胞进行分析,无法观察到各种类型细胞之间的区别,还会掩盖SSC这类重要且稀少细胞的独有特征。单细胞测序技术能够对单个细胞进行无偏倚、高通量和高分辨率的分析,为探究SSC在单细胞水平的变化提供了新的手段,同时也为发现新的生物学标志物和潜在靶点,促进男性不育症的个性化诊疗提供了新途径。     

精原干细胞标志物的研究进展

精原干细胞是精子生成的源泉,因此它在非梗阻性无精症患者的治疗、生物工程学、遗传及转基因研究等方面有广阔的应用前景。目前,众多学者采用多种方法进行筛选,得到一些用于鉴定它的相对特异的标志物,如α6和β1整合素、c-kit、胶质细胞源神经营养因子的受体、Piwi基因等,但仍没有获得一个单一的特异性高的筛选指标。现对精原干细胞的细胞生物学特性、细胞表面分子、细胞内特异分子三方面标志物的研究成果予以总结。     

新生小鼠精原干细胞诱导分化精子样细胞

目的 探讨小鼠精原干细胞体外诱导分化精子样细胞的可行性.方法 以7～8日龄小鼠睾丸为材料,采用小鼠睾丸支持细胞作为饲养层,应用维甲酸诱导、成年小鼠睾丸组织液诱导以及低温诱导精原干细胞分化,应用流式细胞仪分析诱导精子样细胞的染色体倍性.采用显微注射法将精子样细胞注射到卵母细胞和去核卵母细胞,观察受精卵的发育状况.结果 三种方法诱导精子样细胞比例分别为5.9%、1.6%、0.35%;流式细胞仪分析维甲酸诱导单倍体比率为19.3%;诱导精子样细胞能激活卵母细胞,囊胚发育率20.36%.结论 新生小鼠精原干细胞体外可以诱导分化为精子样细胞,并具有激活卵母细胞的能力.     

人精原干细胞分离、培养及鉴定

目的 采用两种酶两步法分离培养人睾丸精原干细胞.方法 先后应用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶消化法,Percoll密度梯度离心,差异贴壁法,进行人精原干细胞的分离及培养;采用细胞免疫荧光法进行人精原干细胞的鉴定;流式细胞法对Oct-4标记阳性的细胞进行筛选,并同时检测所获精原干细胞的纯度,建立精原干细胞和支持细胞共培养体系.结果...     

小鼠精原干细胞系自我更新和分化能力的体外观察

目的:体外观察小鼠精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)的自我更新和分化能力?方法:体外构建稳定的小鼠SSCs系,利用EdU细胞增殖分析试剂盒检测小鼠SSCs体外自我更新的能力;利用活细胞工作站进一步观察小鼠精原干细胞体外增殖现象;运用TUNEL法检测SSCs凋亡现象;通过维甲酸(retinoic acid,RA)诱导小鼠SSCs,观察其体外分化的能力?结果:EdU孵育小鼠SSCs 2 h后,流式检测细胞增殖率平均为40.75%;活细胞工作站下可见正在分裂的干细胞;TUNEL检测显示干细胞中凋亡信号很少;RA诱导后,标记SSCs分化的基因(C-kit?Scp3和 Stra8)表达量明显升高(P < 0.05)?结论:稳定构建的小鼠 SSCs系与体内的SSCs类似,具有较强的自我更新以及细胞分化能力,为下一步开展精原细胞相关基因和蛋白功能研究提供了良好的技术平台?     

GDNF在精原干细胞中对H19和A-myb表达的调控研究

目的通过研究胶质细胞神经源性营养因子（GDNF）对H19和A-myb表达的调控,探讨GDNF调节精原干细胞自我更新的分子机制。方法采用混合酶消化和差速贴壁法从出生后6 d的小鼠睾丸中分离、鉴定并培养精原干细胞。用GDNF分别刺激精原干细胞和经磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）通路抑制剂LY294002预处理的精原干细胞后,采用RT-PCR技术检测细胞H19和A-myb的表达。结果相关鉴定分析证实分离培养的细胞为精原干细胞。RT-PCR检测结果显示：GDNF刺激下的精原干细胞的H19和A-myb表达均显著上调,而经LY294002预处理的精原干细胞在GDNF刺激下其H19和A-myb的表达无明显变化。结论在体外培养的小鼠精原干细胞中,GDNF通过PI3K/Akt信号通路上调H19和A-myb的表达。     

骨髓基质饲养层对精原干细胞体外培养的影响

目的以原代培养小鼠骨髓基质细胞为饲养层，探讨精原干细胞能否在该饲养层上生长及生长的影响因素。方法采用原代培养的小鼠骨髓基质细胞，待细胞长成单层后用丝裂霉素C处理并接种生精细胞共培养。结果原代的小鼠培养骨髓基质细胞能很好的维持精原干细胞的非分化性扩增。结论小鼠原代培养的骨髓基质细胞能作为饲养层支持精原干细胞体外非分化性扩增，该细胞有望成为干细胞培养的新的饲养层。     

大鼠A型精原干细胞的分离和纯化

目的摸索完善A型精原干细胞分离、纯化的方法与技术。方法选用9d的SD大鼠,不连续Percoll梯度液分离纯化精原干细胞,应用选择性贴壁法进一步纯化精原干细胞;台盼蓝排斥实验确定精原干细胞的活力;HE染色法观察细胞形态;c-kit细胞免疫组化鉴定细胞类型并进行细胞纯度分析。结果台盼蓝实验显示细胞活力维持于88.73%±0.85%;c-kit细胞免疫组化结果显示分离得到细胞为精原干细胞;细胞纯度为90.48%±1.78%。结论应用梯度离心及选择性贴壁法获得了纯度较高的A型精原干细胞。     

星形胶质细胞诱导神经干细胞定向分化试验研究

目的 研究新生SD大鼠星形胶质细胞培养上清液对神经干细胞(neural stem cells，NSCS)体外定向分化的影响，探讨神经干细胞分化条件。方法 收集新生和成年SD大鼠星形胶质细胞培养的上清液，以1：3比例同DMEM／F12培基混合，分别对胎鼠来源的神经干细胞进行诱导分化，倒置相差显微境下观察细胞的生长情况。并采用免疫荧光检测方法对分化细胞鉴定和计数。结果 新生鼠星形胶质细胞培养上清液与DMEM／F12的混合培基诱导神经干细胞分化为神经元的比例明显提高。结论 新生鼠星形神经胶质细胞能促使神经干细胞向神经元方向分化。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及表型分析

目的体外分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学特性,为进一步实验研究打下基础.方法通过密度梯度离心法及贴壁培养分离纯化人骨髓中的单个核细胞、体外培养传代、倒置相差显微镜观察细胞生长情况、瑞氏染色及透射电镜观察细胞形态及结构、绘制生长曲线、流式细胞仪检测细胞表面标记及增殖周期、免疫细胞化学及细胞化学染色对分离培养细胞进行鉴定.结果原代和传代培养的细胞以成纤维样为主,有较强的生长增殖能力;流式细胞仪检测细胞表面标记:CD29、CD105阳性,CD34阴性;细胞周期分析:90%以上的细胞处于G0/G1期;细胞CD106、纤维连接蛋白表达阳性,CD45、CD14及层连蛋白、胶原蛋白Ⅱ表达阴性,细胞糖原(PAS)染色强阳性,细胞碱性磷酸酶(ALP)染色阴性.表明细胞不是造血细胞且未向成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞分化,而是处于未分化阶段的间充质干细胞.结论通过密度梯度离心法及贴壁传代培养可以分离纯化MSCs以满足下一步实验研究,该细胞具有特殊的生物学特性.     

人造血干细胞在山羊体内的移植和扩增及分化研究

目的　建立人 /山羊异种造血干细胞 (hematopoieticstemcell,HSC)移植模型 ,在活体水平研究人HSC移植后的扩增和分化。方法　分离人脐血HSC ,然后将其 (1× 10 5)经母羊子宫注射入胎龄为 5 5～ 6 5d的胎山羊体内 ,出生后在不同阶段应用FACS、PCR和PCR southern杂交技术 ,分析人HSC在山羊体内的扩增和分化情况。结果　在 5 0头受试胎羊中 ,39头足月分娩 ,其中 35头山羊呈现人血细胞嵌合 ,人造血细胞在山羊血液中的比率平均达到 1%～ 3% ,并稳定地保持到 10个月以上 ,山羊体内的人造血细胞表达CD34、CD14、CD2 0和血型糖蛋白A(GPA) ,但CD3、CD4、CD7、CD8和CD5 6未见表达或表达很低。结论　人HSC在山羊体内能有效地扩增至 10 0 0～ 10 0 0 0倍 ,并呈现出有限的分化。人 /山羊HSC异种模型为在活体探讨HSC移植、扩增和分化提供了科学资料     

骨髓间充质干细胞移植在急性肝损伤大鼠肝脏内定植能力的实验研究

目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在急性肝损伤大鼠肝脏内移植情况.方法:首先行大鼠骨髓间充质干细胞提取、分离和培养,传代扩增后用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记,用D-氨基半乳糖(1.5g/Kg)腹腔注射制备大鼠急性肝损伤模型,试验分三组(A、B、C组),经阴囊上静脉向肝损伤组(A组)及肝脏正常(C组)的大鼠移植标记BrdU的BMSCs 1～1.5x106,同时向肝损伤组(B组)的大鼠移植等量的生理盐水.2周后观察大鼠的存活率及肝功能恢复情况,并通过免疫组织化学方法检测大鼠肝脏中BrdU 细胞数量及分布.结果:移植2周A组、B组动物存活率、肝功能恢复情况无明显差异,肝损伤组(A组)及肝脏正常组(C组)大鼠肝脏均可检测到BrdU 细胞分布,A组与C组相比,A组BrdU 细胞数较多,分布更广,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:骨髓间充质干细胞可以在受损的肝脏及正常肝脏定植,定植的数量可能和肝脏是否受损伤相关.