BMSCs复合几丁质体外联合培养的实验研究

目的:探讨可注射性水凝胶几丁质作为组织工程软骨支架的可能性,为组织工程软骨的体外构建提供实验依据。方法:用密度梯度离心的方法,体外分离培养大鼠BM SC s,并进行鉴定。取第4代的BM SC s,复合可注射性水凝胶几丁质,加入成软骨诱导培养体系。分别于联合培养后的7、14、21d,取材,利用光镜、组织学,以及免疫组化和电镜的方法进行观察。结果:可注射性水凝胶几丁质为骨髓基质干细胞提供三维生长环境,并使之保持正常形态,经过成软骨诱导后形成正常透明软骨结构。实验组在培养7、14、21d BM SC s诱导分化的软骨细胞分泌的Ⅱ型胶原免疫组化均为阳性,实验组Ⅱ型胶原含量明显优于对照组。结论:可注射性水凝胶几丁质可作为软骨组织工程的良好的载体材料。     

可注射性同种异体工程化软骨的构建

目的　研究在有免疫力的动物体内形成同种异体工程化软骨的可行性 ;并验证本实验使用的生物材料聚氧化乙烯丙烯凝胶 (Copolymer gel of ethylene and propylene oxide)在组织工程研究中应用的可行性 .方法　无菌条件下取新生兔关节软骨 ,经 型胶原酶消化 ,将软骨细胞和生物材料复合成细胞浓度为 5× 10 7m l- 1的复合物并移植于兔皮下 ,同时设立单独注射细胞和材料两个对照组 .分别于 4,6 ,8,12 wk取材行大体观察 ,石蜡切片 HE染色 ,Safranin O染色 ,Masson's三色染色 ,了解软骨形成情况 .结果　 2 wk后即可于皮下触及新生结节 ,4wk后取材即有基质分泌及胶原形成 .于 6 wk左右软骨接近成熟 ,生物材料基本吸收 .8,12 wk软骨基本接近正常软骨 .实验中未见明显的免疫排斥反应 .而对照组未见软骨形成 .结论　该实验使用的生物材料具有良好的生物相容性 ,可降解性 ,无细胞毒 ,是较理想的组织工程生物材料 ;应用该实验的方法可在有免疫力的动物体内形成同种异体工程化软骨 ,这为临床某些美容和重建手术提供了一种微创而可塑型的可能的手段 .     

骨髓间充质干细胞复合壳聚糖凝胶体外构建可注射组织工程软骨

目的：探讨壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶用作骨髓间充质干细胞的载体体外构建可注射型组织工程软骨的有效性和可行性。方法：骨髓间充质干细胞与壳聚糖/β-甘油磷酸钠制成注射型细胞/凝胶复合物并行体外成软骨诱导培养,通过倒置显微镜、扫描电镜和组织学检查等观察细胞在凝胶内黏附、生长、增殖、向软骨细胞分化及形成软骨样组织等情况。结果：在体外成软骨培养条件下,壳聚糖凝胶支持骨髓间充质干细胞生长、增殖、向软骨细胞分化并形成软骨样组织。结论：骨髓间充质干细胞/壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶复合物,有望用作可注射型组织工程软骨修复软骨缺损。     

可注射型骺板软骨水凝胶的制作及特性研究

目的 构建具有良好可塑性和生物特性的组织工程化骺软骨。 方法 制备胎牛骺软骨细胞外基质（cattlearticular cartilage extracellular matrix,CACECM）,复合藻酸钙（ 加10% 葡萄糖酸钙） 制备成可注射性水凝胶材料,行DNA 及糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG） 定量检测。再与体外扩增的2 周龄新西兰白兔第二代骺软骨细胞复合培养,并植于实验兔背部脊柱两旁皮下,8 周后取材进行形态学观察及组织学检测。 结果 制备的可注射型水凝胶材料有较好的生物性能,培养出的组织工程化骺软骨组织细胞生长良好,具有分泌软骨基质功能。 结论 将异体脱细胞骺软骨细胞外基质与藻酸钙及葡萄糖酸钙结合,可以作为良好的可注射型水凝胶材料应用于组织工程化骺软骨的构建。     

体外构建可注射性组织工程软骨的初步研究

目的利用关节软骨细胞复合壳聚糖-磷酸甘油(chitosan/glycerophosphate, C/GP)凝胶,体外构建可注射性组织工程软骨,为微创方式治疗关节软骨缺损提供依据.方法以体外培养扩增的兔关节软骨细胞为种子细胞,以自制温固化可注射C/GP凝胶为支架,按5×107/ml细胞浓度复合体外培养.于倒置显微镜下观察细胞形态与分布,四甲基偶氮唑盐(MTT)法计算培养1周时种子细胞存活率,培养4周时样本进行组织学及扫描电镜观察.结果软骨细胞在7:1(体积分数)C/GP凝胶中保持球形,细胞存活率95%以上;HE染色可见软骨较为典型的陷窝样结构、软骨囊及同源细胞群等现象;甲苯胺蓝异染及免疫组化Ⅱ型胶原染色呈强阳性.结论软骨细胞在C/GP凝胶中可存活并保持分泌软骨基质的功能,形成类软骨组织.温固化可注射性C/GP凝胶能作为软骨组织工程的载体材料.     

柱形藻酸钙载体复合细胞修复异体兔膝关节软骨缺损

目的：应用柱形藻酸钙载体复合骨细胞俱复兔膝关节软骨缺损,为骨关节病的组织工程学修复提供一定的实验依据,方法,应用自行制作的柱形藻酸钙载体复合消化分离的兔关节软骨细胞,共同植入异体兔膝关节软骨缺损处,分别于术后4,8和12wk观察大体标本及组织学修复结果：结果：术后8wk时缺损处可见一定程度的修复,到12wk时大体标本修复较好,修复组织和周围关节面界限不清,组织学见缺损处表现为软骨组织修复,结论：通过短期观察说明藻酸钙可以作为软骨的细胞的革体材料,用于关节软骨缺损修复的组织工程学研究。     

可注射温固化支架复合异体软骨细胞修复关节软骨缺损的初步研究

目的探讨可注射性温固化凝胶壳聚糖-甘油磷酸钠（C-GP）复合同种异体软骨细胞在体内形成透明软骨和注入关节腔后修复关节软骨缺损的可行性和有效性。方法将预制的壳聚糖和甘油磷酸钠按一定体积比制成混合液，实验组为支架复合同种异体软骨细胞，设单纯支架和生理盐水为两组对照。注入成年兔的背部皮下和预制关节软骨缺损的关节腔内，复合物在体内37℃形成凝胶，术后4、8、12周分别行大体、组织学（HE、TB）、Ⅱ型胶原免疫组织化学观察，并进行Wakitani评分。观察其体内成软骨和填充并修复关节缺损效果。结果液态C-GP复合物注入体内可形成凝胶，实验组皮下生长4周，组织学观察示典型的透明软骨样结构且分泌基质；C-GP复合细胞注入关节腔可很好地填充关节缺损，并于4周后开始形成透明软骨样结构且表面平整与宿主整合良好，组织学切片上可见类软骨形成并分泌甲苯胺蓝异染的软骨基质和软骨特异性Ⅱ型胶原。结论可注射性C-GP复合软骨细胞体内可形成具有一定形态功能的类软骨组织，能够应用于微创技术再生修复软骨的缺损。     

兔骨髓基质干细胞在琼脂糖和藻酸钙凝胶中体外培养的观察

目的 观察兔骨髓基质干细胞(BMSCs)在琼脂糖(Agarose)和藻酸钙(Calcium alginate)二种凝胶中体外培养的生长分化状况，以探索一种理想的骨软骨组织工程载体。方法 将传代培养至21d经诱导的兔BMSCs分别接种至1．5％琼脂糖和1．2％藻酸钙凝胶中立体培养，通过细胞计数、HE染色和钙结节检测来观察BMSCs的生长分化。结果在培养第16d琼脂糖凝胶表面有钙结节形成，藻酸钙凝胶中无钙结节形成；在琼脂糖凝胶立体培养中，细胞数量变化不明显，但向成软骨样细胞转化，在藻酸钙凝胶中，部分向成软骨样细胞转化，部分细胞坏死。结论细胞外基质(ECM)可明显影响BMSCs分化，琼脂糖作为BMSCs的载体可尝试用于动物体内的骨软骨修复，而藻酸钙凝胶作为细胞载体尚待进一步研究。     

聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯支架复合同种异体软骨细胞修复关节软骨缺损的实验研究

目的:探讨聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯(PHBV)三维多孔材料作为软骨组织工程支架的可行性及有效性.方法:采用"压片-热处理-粒子析出技术"制备PHBV多孔支架.体外分离培养软骨细胞后接种到PHBV支架体外培养4周,期间扫描电镜观察细胞在支架上的生长情况,然后与单纯PHBV支架同时植入兔膝关节软骨缺损区继续培养4、8、12周后取材,分别行大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组化观察.进行Wakitani评分,观察其体内修复关节缺损效果.结果:电镜观察示软骨细胞在支架上黏附、增殖良好并能分泌细胞外基质,组织学观察示PHBV支架浅层有新生软骨组织形成,于4周后开始形成透明软骨样结构且表面基本平整与宿主整合良好,组织学切片上可见类软骨形成并分泌甲苯胺蓝异染的软骨基质和软骨特异性Ⅱ型胶原. 结论:PHBV可以作为软骨组织工程支架材料,能够用于再生修复软骨的缺损.     

胶原凝胶包埋软骨细胞接种骨胶原基质支架体外构建组织工程软骨

目的探讨复合应用胶原凝胶和骨胶原基质（BCM）支架作为软骨细胞载体体外构建组织工程软骨的有效性和可行性.方法将胶原凝胶包埋的软骨细胞接种BCM支架并在体外培养,应用倒置相差显微镜和扫描电镜观察软骨细胞的粘附、生长和增殖情况,培养14d,行HE、TB（甲苯胺蓝）染色观察软骨组织形成情况.结果软骨细胞在支架上粘附、生长和增殖良好,体外培养14d能形成较成熟的软骨组织.结论胶原凝胶复合BCM支架可作为软骨细胞的载体体外构建组织工程软骨.     

缓释TGF-β3的去细胞软骨微丝/温敏型水凝胶复合支架的制备

目的：探讨一种可注射且能缓释TGF-β3的去细胞软骨微丝/温敏型水凝胶复合支架的制备方法。方法：使用去污剂-酶化学消化法和层层自组装技术制备缓释TGF-β3 的去细胞软骨微丝,混入温敏型水凝胶后制成缓释TGF-β3的去细胞软骨微丝/温敏型水凝胶复合支架,用ELISA试剂盒检测TGF-β3缓释情况;然后再将骨髓间充质干细胞（BMSCs）与复合支架共培养,显微镜下观察细胞生长情况,Western blot法检测Collagen II（Col II）、Aggrecan（AGG）和SOX9表达水平。结果：复合支架在低温状态下为溶胶状态,当温度升高至37 ℃时变为凝胶状态;复合支架中的TGF-β3 可有效缓释25 d左右;BMSCs在复合支架上生长情况良好,细胞呈现类似软骨细胞的形态,Col II、AGG和SOX9 的表达较对照组显著增加（P ＜0.05）。结论：成功制备了一种可注射且能缓释TGF-β3的去细胞软骨微丝/温敏型水凝胶复合支架,该支架能较好地诱导BMSCs成软骨分化。     

神经支架复合体修复周围神经缺损

目的探讨壳聚糖与琼脂糖水凝胶载体及外源性神经生长因子联合制成组织工程神经支架复合体修复大鼠周围神经缺损的可行性.方法壳聚糖与琼脂糖水凝胶载体及外源性的神经生长因子结合,制备成新型的组织工程神经支架复合体,修复大鼠坐骨神经10 mm缺损,术后16周进行免疫组织化学等再生神经形态学观察.用单纯壳聚糖导管和自体神经分别作为阴性、阳性对照.结果复合支架组的神经再生数目和直径均优于单纯壳聚糖导管组(P＜0.01),与自体神经移植组相当.结论壳聚糖与琼脂糖水凝胶载体及外源性的神经生长因子结合,制备成的组织工程神经支架复合体对大鼠神经再生提供良好的再生微环境,可明显促进神经再生,效果接近自体神经移植水平.     

壳聚糖-明胶多孔复合支架构建自体组织工程化软骨组织的实验研究

目的探讨壳聚糖一明胶多孔复合支架作为软骨组织工程支架的可行性。方法消化分离猪耳廓软骨细胞,接种于自制壳聚糖一明胶多孔复合支架上培养1周,将细胞一生物支架复合物种植于猪自体腹外侧壁皮下,第10、16周取材,分别从大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组化和生物化学对再生软骨组织进行评价。结果HE染色见10周时有软骨组织形成,所形成的软骨组织见软骨细胞均匀分布,包埋在软骨陷窝内,还可见未降解的支架材料。16周时软骨组织完成成熟,软骨细胞包埋在软骨陷窝内,支架材料完全降解,结构与正常软骨组织相似。Masson’s trichrome染色见所形成的软骨组织间质中都有被染成绿色的胶原分布。Vehoeff染色见16周时形成的软骨间质内含大量被染成蓝黑色弹性纤维。免疫组化证实形成的软骨组织有Ⅱ型胶原分布,生物化学证实所形成的软骨组织的蛋白聚糖含量与正常猪耳软骨的含量接近。结论利用自制壳聚糖一明胶多孔复合支架上可在具有免疫功能的自体动物内形成软骨组织,但形成的软骨不充分,壳聚糖一明胶多孔复合支架有以作为软骨组织工程支架的应用前景。     

髂骨来源的“双相”BMG结合软骨细胞修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的:探讨应用髂骨来源的"双相"骨基质明胶(bone matrix gelatin,BMG)结合软骨细胞移植修复兔关节软骨缺损的有效性和可行性。方法:使用酶消化法体外分离培养并扩增兔肋软骨细胞;使用自体来源髂骨构建"双相"BMG支架材料;将软骨细胞种植与BMG支架材料上构建成为细胞-BMG复合物;将制作好的27只软骨缺损动物模型随机分为3组。将细胞-BMG复合物移植于软骨缺损模型进行修复治疗作为实验组。将BMG支架移植入软骨缺损模型作为材料组;空白对照组不做处理。分别在术后4周、8周和12周通过大体形态学(依据国际软骨修复协会评分量表)、病理组织学染色及免疫组织化学染色方法对各组修复效果进行评价。结果:番红O染色,甲苯胺蓝染色和Collagen II免疫组化染色分别提示术后12周时实验组的修复组织非常类似于正常关节软骨,组织表面与正常软骨组织平面几乎持平,材料组软骨缺损处得到了部分修复,而缺损组的修复效果较差。按照ICRS量表,大体形态学和病理组织学评分结果提示:术后12周实验组的修复效果与其他两组相比有明显统计学差异(P<0.05)。结论:自体髂骨来源的"双相"BMG结合软骨细胞在体内可形成具有一定结构功能的软骨组织,能够应用于再生修复软骨的缺损。     

应用明胶甲基丙烯酰胺低温3D打印组织工程软骨

目的：探讨应用低温3D打印制作的明胶甲基丙烯酰胺（gelatin methacrylamide,GelMA）支架能否构建高质量组织工程软骨。方法：经预冷处理后,利用低温沉积3D打印技术制备低浓度GelMA支架。大体观察、扫描电镜观察支架宏观、微观结构,并对水凝胶进行流变学和生物力学检测,以DMEM培养液培养大鼠骨髓间充质干细胞作为对照,细胞增殖（CCK?8法）和细胞活性（Live/Dead染色法）检测支架生物相容性,组织学染色定性分析支架成分。裸鼠皮下包埋支架,苏木素?伊红（HE）染色、阿利新蓝染色、番红染色评估软骨细胞外基质结构。结果：大体观察和扫描电镜观察示5％GelMA支架孔径均一,结构规整。与纯GelMA相比,添加细胞的支架力学强度稍强。骨髓间充质干细胞能在支架上黏附并增殖。体内体外组织学染色均表明构建的组织工程软骨在大小、色泽、氨基葡糖聚糖分泌等方面均满足组织工程软骨要求。结论：5％GelMA生物墨水可以在低温条件进行3D打印并成功构建组织工程软骨。     

软骨形态发生蛋白1诱导SD仔鼠脂肪干细胞修复兔膝关节软骨缺损的研究

目的:应用软骨形态发生蛋白1(CDMP1),以诱导SD仔鼠脂肪干细胞(ADSCs)以修复兔膝关节软骨缺损,探讨异种细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性。方法:自SD仔鼠腹股沟脂肪组织分离、培养ADSCs,复合于自制牛松质骨支架上,经CDMP1诱导,体外继续培养2周,免疫组化鉴定后备用。建立兔双侧髌骨关节缺损模型。左侧缺损处植入ADSCs-支架复合物,为实验侧;右侧缺损处植入空支架,为对照侧。术后8、16、24和48周各处死9只兔子,缺损处行H-E染色和番红O染色。结果:实验侧8周时可见缺损周围表面充填有薄层白色半透明组织,与周围软骨的界线清楚;16周时缺损表面界限连接较8周时模糊,但仍可辨,24周时,修复良好,修复区新生软骨细胞与周围正常软骨细胞形态相近,呈球形,可见软骨陷窝,H-E染色和番红O染色阳性;48周时,能较容易分清缺损处与修复区的界限,修复效果不及24周时。对照侧8、16、24和48周4个时期标本基本相同,软骨缺损处与周围正常组织边界清楚,缺损处凹陷空洞,被肉芽组织填充,新生细胞呈长梭形,H-E染色和番红O染色阴性。结论:利用CDMP1诱导SD仔鼠ADSCs复合自制牛松质骨支架可较好修复兔膝关节软...     

软骨细胞与复合水凝胶的生物相容性研究

目的构建光固化壳聚糖与自固化海藻酸钠复合水凝胶体系,研究其与软骨细胞的体外生物相容性,探索其作为软骨组织工程支架的可行性。方法以三维多孔光固化壳聚糖水凝胶作为细胞的空间载体,利用自固化海藻酸钠水凝胶将软骨细胞胶封入光固化壳聚糖水凝胶支架,构成复合水凝胶-细胞复合体。采用扫描电子显微镜观察光固化壳聚糖的结构形貌以及细胞在支架内部的分布与形态;CCK8法绘制细胞增殖曲线;DAPI细胞核染色荧光显微镜观察细胞核形态变化,判断细胞活性。结果纯光固化壳聚糖水凝胶材料呈孔隙较为均匀一致的多孔结构,平均孔径为300μm左右。复合水凝胶能够模拟天然软骨细胞外基质环境,使细胞保持圆形生长状态;促进成软骨细胞的增殖,具有良好的生物相容性。结论复合水凝胶能够为软骨细胞提供一个类似天然的生活环境,并能够促进其增殖、生长,有望作为软骨组织工程支架应用于软骨缺损修复的实验研究。     

基于聚乙二醇-聚乳酸-聚乙二醇水凝胶的兔骨髓基质干细胞三维培养

目的研究新型可注射温度敏感型聚乙二醇-聚乳酸-聚乙二醇水凝胶[poly（ethylene glycol）-poly（epsilon-caprolactone）-poly（ethylene glycol）,（PEG-PCL-PEG,PECE）]的生物相容性,探讨其做为细胞三维培养材料和组织工程支架的可行性。方法将兔骨髓基质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）接种于水凝胶,体外共同培养后进行形态结构观察,用MTT法检测BMSCs增殖活性,DAPI和EI试剂盒观察细胞存活和凋亡情况。结果 BMSCs在PECE水凝胶中生长及功能均比较理想。DAPI/EI染色见少量红色荧光,显示仅有少量细胞凋亡。结论可注射温度敏感性PEG-PCL-PEG水凝胶生物相容性好,是一种良好的三维培养材料,可作为种子细胞的载体应用于组织工程中。     

应用几丁质胶原网架构建组织工程软骨

目的：探索利用几丁质胶原网架构建组织工程人工软骨的方法。 方法：取2周龄的新生兔关节软骨,经消化、传代培养后,将获得的软骨细胞与牛Ⅰ型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合,将几丁质纤维网架浸入上述混合物中制成人工软骨培养物并在体外培养。将培养1周的组织工程培养物,植入同种异体动物皮下组织培养4周,观察组织工程软骨的形成情况。 结果：细胞在几丁质网架培养物中分布均匀,细胞多呈三角形或梭形,培养物体积收缩不明显,经体内培养存活的软骨细胞分泌Ⅱ型胶原,有血管和炎性细胞的侵入。结论：用胶原蛋白和人血纤维蛋白混合凝胶与几丁质纤维网架载体为支架植入软骨细胞以后,在体外和体内都可以培养构建出较大的组织工程软骨。     

毛细管气相色谱法测定鲑鱼中多氯联苯残留量

目的：建立气相色谱法测定水产品鲑鱼中多氯联苯残留量的测定方法。方法：采用HP-5弹性石英毛细管（30m×0．32mm，0．25μm）色谱柱，进样口温度为250℃；检测器温度为300℃。不分流进样，程序升温，检测器为63Ni电子捕获检测器，高纯氮气为载气。结果：6种多氯联苯在0．002mg／L-0．1mg／L范围内线性关系良好（r〉0．998），其检出限范围为0．01μg／L，该方法的回收率为86．1％-92.3％、相对标准偏差≤6．5％。结论：该方法的准确度、灵敏度、回收率及重现性均符合要求：