自身免疫性感音神经性聋豚鼠子代的内耳功能与形态学研究

目的:观察自身免疫性感音神经性聋(ASNHL)雌性豚鼠子代内耳听觉生理功能及组织结构病理变化,探讨内耳自身免疫因素与子代内耳听觉损伤的相关性。方法:采用同种粗制内耳抗原(CIEAgs)免疫,造成雌性豚鼠ASNHL,妊娠后持续抗原强化免疫,对其所产子鼠进行相关指标测试和观察,包括听神经复合动作电位阈值、幅值和耳蜗微音器电位伪阈,血清抗CIEAgs抗体水平以及内耳病理形态学观察。结果:ASNHL雌鼠的子代36只中有18只(22耳)出现听力损伤,血清抗CIEAgs抗体增高,螺旋神经节细胞变性,数目减少,蜗螺旋管内炎性细胞浸润。结论:ASNHL所产子鼠可出现先天性感音神经性聋和内耳病理损伤,其发生可能与特异性体液免疫有关。     

特异性体液转移免疫致豚鼠先天性感音神经性聋实验研究

目的：探讨并证实孕豚鼠针对内耳组织抗原特异性抗体是否可以通过胎盘进而造成其子鼠自身免疫性先天性感音神经性聋。方法：采用同种粗制内耳抗原免疫豚鼠，造成自身免疫性感音神经性聋（ASNHL）动物模型[ELISA法测定示血清抗体水平升高和耳蜗电图（EcochG）示听神经复合动作电位和（或）耳蜗微音器电位阈值或伪闽升高]，取其血清（含特异性抗内耳组织抗原的抗体）持续转移免疫妊娠豚鼠，采用EcochG测试被动免疫妊娠母鼠和子鼠的听觉功能，再采用颞骨火棉胶切片和HE染色，光镜观察内耳组织形态学改变。结果：各组出现听觉损伤的动物情况是：采用ASNHL模型动物血清被动免疫的8只妊娠母鼠中有5只（7耳）和其所产子鼠8只中有6只（10耳）、采用非ASNHL模型动物血清免疫的妊娠豚鼠所产子鼠5只中有1只（2耳）。出现听损的被动免疫母鼠和子鼠内耳病理形态学改变主要为螺旋神经节细胞变性和Rosenthal管中炎症细胞（以单个核细胞为主）浸润，部分动物出现膜迷路积水。结论：同种体液转移免疫可造成自身免疫性内耳病变：子鼠产生听觉功能障碍主要是由于母鼠所产生的特异性抗内耳组织抗原抗体经胎盘到达子鼠体内所致。     

同种内耳抗原免疫孕豚鼠所产子鼠听觉损伤程度与母鼠特异性免疫反应水平相关性研究

目的：探讨自身免疫性感音神经性聋孕豚鼠所产子鼠听觉损伤（听损）程度与母鼠特异性免疫反应水平的相关性，同时了解子鼠内耳病理损伤和听损的特点。方法：同种粗制内耳抗原免疫雌性豚鼠，后将其与雄鼠交配，妊娠并生产子鼠。测试母鼠特异性抗体、细胞免疫反应及听觉功能，光镜观察内耳组织形态变化；测试全部出生后2周和部分出生后6周子鼠听觉功能，并亦用光镜观察内耳组织形态变化。结果：母鼠抗体水平在妊娠中期达峰值，特异性细胞免疫反应水平在妊娠晚期尚在进一步升高。子鼠听神经复合动作电位（cAP）闽值与母鼠血清特异性抗体水平及cAP阈值升高程度呈线性正相关、与母鼠特异性细胞免疫反应水平呈非线性2次多项式关系。结论：母鼠血清特异性抗体水平和cAP闽值升高程度越显著．子鼠发生听损概率越高，听损亦越严重。随出生后时间延长，子鼠听损无明显变化，听损子鼠可发生膜迷路积水。     

自身免疫性感音神经性聋基因治疗的实验研究

目的:研究以重组复制缺陷型腺病毒为载体的Fas配体(Fas-Ligand,即FasL)基因和白细胞介素10(即IL-10)基因治疗实验性自身免疫性感音神经性聋.方法:采用同种内耳组织抗原加弗氏佐剂免疫豚鼠,造成自身免疫性感音神经性聋的动物模型28只,按配对设计将其分为4组,通过鼓阶微量注射的方式,A组注入携带FasL基因的腺病毒(Ad-FasL),B组注入携带IL-10基因的腺病毒(Ad-IL-10),C组单纯注入腺病毒(携带绿色荧光蛋白,即Ad-GFP),D组注入等量的磷酸盐缓冲液.基因导入7 d后行听觉脑干诱发电位(ABR)测试,后取颞骨制作石蜡切片并行HE染色和光镜观察,每组各取两耳行螺旋韧带和基底膜透射电镜观察.每组各取3只(6耳)行免疫荧光和酶免疫组织化学试验,以检测基因产物表达和腺病毒转染情况.结果:免疫组织化学显示携带目的基因的腺病毒可以转染血管纹、螺旋韧带、Corti器、螺旋神经节、蜗轴小血管周围及其耳蜗的骨壁等部位的细胞,并产生相应的蛋白产物(IL-10和FasL).ABRⅢ波阈值的均值对比结果显示,A组和B组明显低于C组和D组.内耳组织的免疫炎性反应亦明显较C组减轻.结论:重组复制缺陷型腺病毒可以携带目的基因转导入内耳,并在内耳表达基因产物,其抑制炎症反应的作用可有效地减轻自身免疫性感音神经性聋的内耳组织免疫炎性损伤和听觉功能障碍,有望成为治疗自身免疫性感音神经性聋新的方法和途径.     

同种内耳抗原免疫豚鼠致感音神经性聋的实验研究

采用同种内耳抗原免疫豚鼠，６周后免疫组动物５０耳有３３耳（６６％）出现单侧或双侧感音神经性聋。内耳火棉胶切片，酶组织化学，免疫组织化学和透射电镜以及体液免疫反应等观察，确认为免疫反应引起的感音神经性聋。结合实验结果对本病病理特征和可能发病机理进行了讨论     

交感性迷路炎?——临床迟发性膜迷路积水的免疫因素研究

目的：探讨迟发性膜迷路积水（DEH）的临床特征及发病机制中内耳自身免疫性病理因素的作用。方法：对26例（同侧性19例,对侧性7例）DEH病人进行临床观察,听觉功能测试、非特异性和特异性免疫学试验及疗效分析。结果：导致先期耳聋的常见病因有突发性聋,脑膜炎,麻疹,乳突手术等;6例病人出现针对内耳抗原的特异性免疫反应,其中4例应用免疫抑制剂治疗有效。结论：DEH与原发性感音神经性聋的间隔期差异大,导致先期感音神经性聋的病因较多,内耳自身免疫性病理因素在DEH发病中可能起着重要作用,对侧性DEH病人特异性免疫反应阳性以及免疫抑制剂治疗有效的结果提示其可能为交感性迷路炎。     

慢病毒载体介导IL-4基因修饰BMSCs内耳局部应用治疗免疫性感音神经性聋的实验研究

目的:探讨白细胞介素4(IL-4)基因修饰骨髓间充质干细胞(BMSCs)内耳局部植入对免疫性感音神经性聋动物内耳病理损伤和生理功能障碍的调节与治疗作用.方法:采用钥孔嘁血蓝蛋白(KLH)抗原在已致敏的豚鼠圆窗龛局部免疫,造成免疫性感音神经性聋动物模型33只.分为IL-4基因修饰BMSCs组(A组)、空载慢病毒感染的BMSCs对照组(B组,即BMSCs空载对照组)和模拟手术对照组(C组),均将BMSCs细胞悬液经鼓阶开窗植入内耳. 提取豚鼠BMSCs,重组IL-4基因的慢病毒载体体外转染BMSCs,成功后鼓阶开窗植入内耳.采用免疫荧光组织化学法和免疫酶组织化学法 分别观察导入内耳的BMSCs 及IL-4基因产物在内耳组织结构中的分布和表达情况.应用酶联免疫吸附试验(ELISA)和听性脑干诱发电位(ABR)测试观察血清抗KLH特异性抗体水平和听觉功能变化,并行内耳石蜡切片光镜观察.结果:局部KLH免疫后与内耳局部BMSCs植入后2周,特异性抗KLH抗体水平差异无统计学意义;A组和B组ABR Ⅲ波阈值不同程度降低,但前者阈值降低更为明显,两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).免疫组织化学结果显示BMSCs(荧光反应阳性细胞)主要分布在鼓阶、前庭阶,酶反应阳性(IL-4基因产物)部位主要集中于螺旋神经节、骨螺旋板唇部、Corti器、血管纹、耳蜗骨壁以及蜗管中的BMSCs的细胞和其周围.内耳光镜观察结果显示:A组和B组仅在鼓阶内有絮状物,注射部位有少量红细胞和白细胞;C组可见螺旋神经节和蜗轴小血管周围有单个核细胞浸润,部分听损耳还可见螺旋神经节细胞数目减少、不同程度的膜迷路积水、蜗管内有絮状物和漂浮细胞. 结论:重组IL-4基因的慢病毒载体植入内耳后,可在内耳迁移并产生基因产物IL-4.经IL-4基因修饰的BMSCs和空载在体外成功地转染BMSCs.经鼓阶途径BMSCs内耳移植均可明显减轻免疫性感音 神经性聋动物的内耳免疫炎症反应和听觉功能损伤,前者作用更为显著.从而提示BMSCs(包括经IL-4基因修饰的BMSCs)局部应用可对免疫性内耳病的免疫炎症损伤产生一定的调节和治疗作用,并有向病变部位迁移、聚集的倾向.     

免疫介导的感音神经性聋的动物模型的建立及评价

感音神经性聋是指内耳、耳蜗神经、脑干听觉通路及听觉中枢病变所致听力损失的统称,其中耳蜗听觉感受器的病变导致感音障碍引起的聋为感音性聋.目前,占人类10%以上的成年人群都患有不同程度的感音神经性耳聋,随着世界人口的老龄化,耳聋占人类群体的比例会进一步升高,像中国这样一个发展中的大国,老龄化人群所占比例会进一步上升[1].感音神经性耳聋主要表现为双耳或单耳的听力下降,可伴有耳鸣、眩晕等症状.其病因主要有:感染、中毒、创伤、噪声、代谢异常、听神经病变、免疫因素等.随着内耳免疫学的深入开展,免疫因素在内耳疾病的发病机制中所发挥的作用亦越来越受到人们的重视.研究发现,内耳并非免疫"豁免"器官,它具有免疫防御系统的解剖学组成和细胞免疫与体液免疫的特性[2～4].     

内耳毛细胞再生的基因调控与基因治疗研究进展

感音神经性聋（sensorineural hearing loss,SNHL）的发病机制尚未完全明确,致病因素和临床表现形式多样,目前临床上尚缺乏有效的治疗方法。内耳毛细胞不可逆的损伤和丢失是导致永久性感音神经性聋的主要原因。如何使内耳毛细胞损伤和丢失后修复和再生,是近年来听觉领域研究的热点。随着分子生物学、分子遗传学、基因工程技术等的不断发展,尤其是近年来基因调控内耳毛细胞再生方面的研究逐步深入,为治疗感音神经性聋开辟了一条崭新的道路。现就内耳毛细胞再生的基因调控和基因治疗的研究综述如下。     

IL-10基因内耳局部治疗自身免疫性感音神经性聋的实验研究

目的:探索局部应用IL-10基因与慢病毒重组载体对实验性自身免疫性感音神经性聋(ASNHL)的治疗作用。方法:采用纯化同种内耳抗原免疫豚鼠,造成ASNHL动物模型,再将重组载体分别经鼓阶、内淋巴囊和圆窗龛局部注射或渗透,观察听觉功能和内耳病理形态学变化,同时行免疫组织化学试验了解慢病毒转染和基因产物在内耳的分布。结果:治疗前后ABRⅢ波阈值的均值对比分析结果显示,各实验组局部基因治疗后均降低;治疗后各实验组组间比较差异无统计学意义。慢病毒主要转染部位是血管纹、Corti器、蜗轴小血管周围及其内淋巴囊等处。基因产物表达部位与转染部位基本相同。结论:重组载体经不同途径均可转导入内耳,并在内耳表达基因产物,对ASNHL发挥有效的治疗作用。     

自身免疫性梅尼埃病的体液与细胞转移免疫示踪研究

目的：探究能否经体液和（或）细胞转移造成被动免疫性自身免疫性梅尼埃病（AIMD）,并了解针对内耳组织的特异性抗体和淋巴细胞到达内耳的途径,部位及其对内耳组织和生理功能的影响。方法：对AIMD模型动物的免疫球蛋白（IgG)行荧光标记,脾细胞（主要为T淋巴细胞）行同位素标记,继而进行被动免疫（同时在内淋巴囊周围局部注射内耳抗原）。观察内耳听觉和前庭功能变化,不同部位组织中荧光聚集反应和同位素含量改变。结果：特异性抗体（IgG)首先到达血管纹和纳淋巴囊部位,特异性淋巴细胞则首先出现在内淋巴囊局部,内耳听觉和前庭功能障碍发生与内耳组织中抗体（即荧光反应强度）及淋巴细胞含量（即CPM值）呈明显相关性。结论：体液和细胞转移免疫均可诱发出被动免疫性AIMD;内耳组织抗原的特异性抗体和淋巴细胞可经过体循环到达内耳局部,抗体主要经血管纹和内淋巴囊部位造成内耳病变（包括膜迷路积水）,而特异性淋巴细胞则主要通过内淋巴囊局部造成内耳免疫炎性病理变化。     

环磷酰胺预处理后再免疫豚鼠听功能的变化

目的建立高阳性率自身免疫性内耳病动物模型,以供圆窗给药治疗内耳病的研究.方法白色红目豚鼠97只,其中32只用于制备内耳抗原,其余分为试验组(n=47)和对照组(n=18).试验组环磷酰胺腹腔注射进行预处理,2 d后用粗制内耳抗原行皮下多点接种,接种后4、6、8、10、12、14、20 d,接受听性脑干诱发电位(ABR)检测.对照组I不行任何处理,组Ⅱ仅行环磷酰胺预处理,不行粗制内耳抗原接种.结果接种后4 d时,试验组ABR阈值提高10 dB以上的动物占67%;接种后8 d时为86%,14 d时仍为60%,至接种后20 d时,所有动物ABR阈值恢复正常.结论将豚鼠用环磷酰胺预处理后,粗制内耳抗原只需单次接种,即可建立听力损害高发生率的自身免疫性内耳病动物模型.     

先天性感音神经性聋与内耳免疫

先天性感音神经性聋占先天性聋的很大比例,对其探索和研究工作具有重要的临床意义。作者主要就母体自身免疫对子代影响的相关性研究及其与先天性感音神经性聋及内耳免疫的关系进行综述。     

内淋巴囊局部免疫致自身免疫性梅尼埃病及其治疗的实验研究

目的：制成自身免疫性梅尼埃病动物模型，并探讨免疫抑制剂环磷酰胺和强的松对其防治效果。方法：采用同种粗制内耳抗原（ｃｒｕｄｅｉｎｎｅｒｅａｒａｎｔｉｇｅｎ，ＣＩＥＡｇ）在已致敏的豚鼠内淋巴囊（ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃｓａｃ，ＥＳ）局部免疫，并在免疫同时或免疫后使用环磷酰胺或强的松作试验性预防和治疗，观察其疗效。结果：ＥＳ局部免疫后的动物出现了针对ＣＩＥＡｇ的特异性免疫反应，并造成了与梅尼埃病极其相似的膜迷路水肿等内耳病理改变，以及明显的听觉和前庭功能障碍；而使用免疫抑制剂的各试验组动物的特异性免疫反应受到不同程度的抑制，内耳组织损伤与功能障碍明显减轻。结论：ＥＳ局部免疫是一种有效的造成梅尼埃病的方法，部分梅尼埃病患者的发病机制可能与自身免疫因素有关，免疫抑制剂环磷酰胺和强的松对其有良好的防治效果。     

紫杉醇对豚鼠听阈的影响

目的:探讨紫杉醇对豚鼠听阈的影响。方法:将30只雌性豚鼠随机分为6组(1个对照组和5个实验组,每组5只),实验组分别予以不同剂量紫杉醇腹腔内注射,检测用药前、后各组动物ABR阈值。结果:实验组听力水平用药后均显著减低,相关分析显示,总药量与听力损失程度之间无显著相关性。结论:紫杉醇可导致轻到中度听力损失。