静电纺丝聚乳酸-乙醇酸聚合物膜与大鼠嗅鞘细胞的生物相容性研究

目的 探索静电纺丝技术制作的聚乳酸-乙醇酸聚合物（PLGA）膜与大鼠嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells,OECs）的生物相容性。方法 体外培养纯化成年大鼠OECs,将细胞接种于静电纺丝PLGA膜上,使用相差显微镜观察静电纺丝PLGA膜上OECs的细胞形态与分布;用CFDA SE荧光染色检测接种后1～5 d内静电纺丝PLGA膜上OECs的增殖情况;以多聚赖氨酸（PLL）包被细胞做对照。将静电纺丝PLGA膜植入大鼠体内观察其与大鼠的组织相容性。结果 体外培养纯化所得的OECs的细胞纯度大于90%。相差显微镜下示OECs在静电纺丝PLGA膜孔隙中的纳米纤维上黏附良好,细胞状态佳,且特异性地沿纳米纤维方向生长。接种后1～5 d内OECs在静电纺丝PLGA膜上均正常增殖,细胞数目与对照组相比差异无统计学意义。静电纺丝PLGA膜局部移植后大鼠无死亡,PLGA膜与周围组织融合并部分降解。结论 静电纺丝PLGA膜具有良好的生物相容性,OECs在其膜上的黏附和增殖状况良好,是有潜力的神经修复组织工程化神经移植物。     

人胚胎平滑肌细胞的三维培养观察

目的：体外培养人胚胎动脉平滑肌细胞（vasular smooth muscle cells,VSMCs），并观察人胚VSMCs在经过改性的乳酸与羟基乙酸共聚（polylatic acid-polyglycolic acid,PLGA)上的三维培养情况，观察细胞在PLGA上的生长情况。方法：成功培养人胚VSMCs后，将其与PLGA（膜材和三维材料）进行三维培养，通过倒置显微镜，扫描电镜和MTT法观察细胞的生长情况。结果：体外培养的人胚VSMCs生长旺盛，且其与改性后的PLGA具有良好的相容性，细胞在PLGA上生长良好，结论：改性后的PLGA与体外培养的人胚VSMCs有良好的相容性，为构建结构和功能与在体胆管上段胆管相似的胆管组织，最终为形成组织工程化胆管提供实验依据。     

大鼠嗅球嗅鞘细胞的改良培养及耳蜗内植入的初步研究

目的 建立并改良大鼠嗅球嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)的取材、纯化、培养、鉴定及示踪方法,并初步探讨OECs耳蜗内植入的可行性.方法 采用改良法分离新生3 d的SD大鼠嗅球OECs,用差速贴壁加抗有丝分裂法行纯化培养,观察培养细胞的形态特点及生长情况,利用低亲和力神经生长因子受体NGFRp75行免疫组化鉴定并评估细胞纯度.将纯化培养7 d后的OECs与5-溴-2′-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2′-deoxyuridine,BrdU)共同孵育48 h,以免疫荧光法观察OECs的增殖活性;同法标记供移植用的OECs.在成年大鼠耳蜗底周钻微孔,注入OECs悬液,24 h后作耳蜗冰冻切片行免疫荧光染色,观察移植的OECs在蜗内存活与分布情况.结果 用改良技术体外培养的OECs增殖速度快,于第9天细胞数量最多,且逐渐表现出典型的形态学特征;绝大部分培养的OECs NGFRp75免疫组化呈阳性反应,细胞纯度最高达85%.OECs与BrdU共同孵育48 h后,约90%的培养细胞免疫荧光呈阳性反应.初步建立了内耳OECs移植方法;经耳蜗底周注入OECs后24 h,BrdU阳性细胞主要分布于耳蜗的外淋巴腔,部分细胞附着于鼓阶外侧壁.结论 采用改良的嗅球OECs分离培养法可以获得高纯度、增殖活性良好的OECs;OECs耳蜗内植入后短期内可存活,初步提示耳蜗内OECs移植基本可行,值得进一步研究.     

聚乙交酯-聚丙交酯降解支架复合胎儿脐动脉细胞构建组织工程血管

目的：探讨改良聚乙交酯-聚丙交酯（PLGA）降解支架复合胎儿脐动脉细胞方法构建组织工程血管（TEBV）的可行性。方法：将胎儿脐动脉的平滑肌细胞,内皮细胞种植于国产PLGA血管上并进行培育,观察两种细胞生长情况、检测内皮细胞、平滑肌细胞并测定其功能。结果：培育2mo后,平滑肌细胞,内皮细胞在PLGA血管片上黏附良好,材料组织相容性好。结论：应用PLGA降解支架复合胎儿脐动脉细胞构建组织工程血管的体外培养方法是可行的,PLGA支架有利于细胞生长、分化及功能发挥,动态培养方法培养出的TEBV色泽光亮,厚度均匀,具有良好的弹性。     

自制编织型三维支架对体外神经膜细胞生长的影响及体内降解观察

目的:自制聚乙交酯-丙交酯(poly lactide-co-glycolide acid,PLGA)神经组织工程三维支架,观察该支架对体外神经膜细胞生长的影响及其体内降解情况及炎症反应,为后续研究奠定基础.方法:通过熔融、纺丝、拉伸、编织等步骤制作编织型三维PLGA支架,扫描电镜观察内部微管道的排列规律,测量微管道孔径大小.将原代培养的神经膜细胞接种到编织型三维支架上,采用倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞在支架上生长、黏附、增殖和凋亡情况,并与细胞培养皿和胶原海绵培养细胞进行对照.将携带神经膜细胞的三维支架植入大鼠脊柱两侧肌肉中,H-E染色观察支架在体内的降解情况及炎症反应.结果:支架外径为3 mm,微管道直径为100 μm,均匀平行排列.三维支架与细胞培养皿中的神经膜细胞细胞黏附率、增殖率无统计学差异,与胶原海绵培养细胞差异有统计学意义(P<0.05);三维支架与胶原海绵上的细胞凋亡率无统计学差异,二者均低于细胞培养皿培养细胞,差异有统计学意义(P<0.05).三维支架植入体内12周后完全降解,周围无明显炎性细胞浸润.结论:自制编织型三维支架对体外神经膜细胞生长无不良影响,体内能有效降解,具有良好的生物相容性.     

PLGA/Ⅰ型胶原/壳聚糖复合人工硬脊膜生物相容性及力学性能的实验

目的:研究经Ⅰ型胶原、壳聚糖改性的PLGA膜的生物相容性及力学特性,研制出新型人工硬脊膜替代材料.方法:制作PLGA膜(膜Ⅰ)、PLGA/Ⅰ型胶原/复合膜(膜Ⅱ)、PLGA/Ⅰ型胶原/壳聚糖(9:1)复合膜(膜Ⅲ)、PLGA/Ⅰ型胶原/壳聚糖(5:5)复合膜(膜Ⅳ),并行接触角、吸水率、细胞毒性实验及材料力学实验的研究.结果:接触角:膜Ⅱ<膜Ⅲ<膜Ⅳ<膜Ⅰ,P<0.01;吸水率:膜Ⅰ<膜Ⅳ<膜Ⅲ<膜Ⅱ,P<0.01;细胞毒性实验示:第1天,各膜组间OD值差异无统计学意义,P>0.05.第3、7天,膜Ⅰ与Ⅱ、Ⅲ各组间,膜Ⅲ与膜Ⅳ组间差异有统计学意义,P<0.05.PLGA膜经Ⅰ型胶原和壳聚糖改性后,可以促进细胞在膜上的黏附、贴壁能力.各膜的力学性能比较,膜Ⅰ与膜Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ之间差异有统计学意义,P<0.05,膜Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组间的差异无统计学意义.结论:PLGA膜的表面复合Ⅰ型胶原/壳聚糖(9:1)可以提高复合膜的生物相容性和力学特性.     

PLGA新型纳米支架的制备及其生物相容性

目的探讨和比较应用不同参数静电纺丝技术制备复合型聚乳酸-羟基乙酸[poly(lactic-co-glycolicacid),PLGA]纳米纤维缓释膜片的可行性,检测其表面特性以及生物相容性。方法使用不同参数制备纳米纤维膜,扫描电镜观察膜片表面形态;人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPLDCs)培养及鉴定后接种于空白膜上,扫描电镜观察细胞与膜的附着情况,以MTT[3-(4,5-dimethylthiaozol-2-yl)-2,5-dip henyltetrazolium bromide]实验检测不同浓度材料浸提液对细胞增殖变化情况的影响。结果随着PLGA流量增加,纳米纤维直径增加;细胞与PLGA膜复合后粘附良好且增殖状态无明显变化;不同浓度材料浸提液对牙周膜细胞增殖的影响无明显差异。结论通过不同参数静电纺丝制备的新型纳米纤维膜具有良好的生物相容性,可进一步作为多种药物及细胞因子载体构建缓释型支架,从而用于引导性牙周组织再生(guided tissue regeneration,GTR)或者牙周组织工程。     

骨髓基质细胞和胶原膜BME-10X生物相容性的实验研究

目的 观察胶原膜BME-10X与Beagle犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)的生物相容性,为将其运用于组织工程技术修复牙周缺损提供理论依据.方法 体外培养Beagle犬BMSCs,并与胶原膜BME-10X复合培养.HE染色检测细胞与材料的黏附,MTT法检测细胞的增殖,并行碱性磷酸酶(ALP)活性检测.结果 BMSCs复合胶原膜后生长良好,MTT及ALP结果均显示,在各时间点,对照组和实验组间增殖及ALP活性均无显著性差异(P>0.05).结论 胶原膜BME-10X有良好的生物相容性,有望成为BMSCs的载体材料应用于牙周组织工程研究.     

新型生物活性复合材料RGD-PLGA/HA体外细胞相容性的实验研究

目的研究新型多孔多肽聚乳酸乙醇酸/羟基磷灰石(RGD-PLGA/HA)支架材料的体外细胞相容性。方法采用贴壁法对兔骨髓基质细胞(BMSCs)进行体外矿化诱导培养,扩增后与实验A组(RGD-PLGA/HA)、实验B组(PLGA/HA)分别进行体外复合培养,并通过定性及定量法检测BMSCs在材料表面的黏附能力、增殖活力,验证细胞材料复合体的成骨活性。结果兔BMSCs在每组材料的表面均能生长,经体外诱导后在支架材料的表面形成钙结节,实验A组细胞的黏附及增殖能力均强于实验B组。结论兔BMSCs与新型多孔RGD-PLGA/HA支架材料有良好的相容性。     

不同纯化方法体外培养人胚嗅球嗅鞘细胞

目的 采用不同纯化方法原代培养人胚嗅球嗅鞘细胞(OECs),探讨简单实用可获得高纯度人胚嗅球OECs的体外培养方法.方法 以差速贴壁法为基础结合阿糖胞苷法、无血清饥饿法和问断神经营养因子3(NT3)法纯化培养人胚嗅球OECs.观察不同纯化方法下OECs生长变化,采用免疫细胞化学染色进行纯度鉴定.结果 体外培养的人胚嗅球OECs为双极、三极细胞.细胞突起细长,并可形成细胞突起网络.差速贴壁法培养3～6 d时纯度约为88%,以后成纤维细胞增殖,OECs纯度迅速下降.无血清饥饿法培养3～6 d时OECs纯度约为90%,但细胞状态差.间断NT3法培养3～9 d时OECs纯度约为95%,且细胞状态良好.经统计学处理,第6 d后差速贴壁 间断应用NT2法优于其他方法,细胞纯度的差异有统计学意义(P<0.05).结论 差速贴壁结合同断NT3法可获得高纯度状态良好的OECs,是一种简单实用的OECs纯化培养方法 .     

嗅球成鞘细胞的培养纯化及与功能相关的形态学研究

目的 培养纯化嗅球成鞘细胞(Olfactory ensheathing cells，OECs)并对其进行免疫细胞化学研究，探讨其相关功能。方法 分离嗅球嗅神经纤维层获得嗅球成鞘细胞，采用免疫溶解法对培养的嗅球成鞘细胞进行纯化，并利用免疫细胞化学方法和电镜技术进行形态学观察。结果 通过纯化可以使培养的OECs纯度达95％以上，免疫细胞化学显示OECs表达P75NGFr、GAP43、N—CAM和GFAP；电镜结果显示OECs呈分叶状核，胞浆电子致密，胞膜有伪足样皱褶。结论 免疫溶解法可以较好的纯化OECs并保持其良好的生长状态，培养的OECs表达P75NGFr、GAP43、N-CAM可能与其促进轴突再生的功能相关。     

体外评估硫酸肝素-胶原蛋白生物支架与嗅鞘细胞生物相容性的研究

背景：中风和神经系统的外伤和卒中可导致神经功能缺损,同时伴随轴突受损,形成胶质瘢痕、空腔和裂隙。嗅鞘细胞作为自体移植最佳的候选细胞,可以分泌神经营养因子促进轴突的生长。并且生物支架具有多孔的三维立体结构,能够运载细胞填充和桥连这些空隙。因此移植支架联合种子细胞是一种修复神经组织重要的策略。 方法：硫酸肝素-胶原蛋白生物支架经过一系列的程序而制作成功。将硫酸肝素-胶原蛋白生物支架与嗅鞘细胞在体外共培养,在第1、3、5和7天时用MTT法检测细胞活性。数据分析采用重复测量设计的方差分析,当P < 0.05时被认为具有显著性差异。之后将嗅鞘细胞用CFSE标记,通过流式细胞仪检测标记率为99.8%。用CFSE标记后的嗅鞘细胞以适宜的浓度种植于支架上。细胞在支架上的粘附和生长可以通过荧光显微镜和扫描电镜直接追踪和观察。 结果：硫酸肝素-胶原蛋白生物支架具有稳定的三维立体结构,对于嗅鞘细胞无毒性（F= 0.14,P= 0.9330）。除此之外,细胞及其轴突也能够在该支架中很好的黏附和生长。 结论：本实验表明硫酸肝素-胶原蛋白生物支架与嗅鞘细胞在体外具有很好的生物相容性。因此,硫酸肝素-胶原蛋白生物支架可能可以作为一种载体,种植嗅鞘细胞后应用于神经组织工程。     

嗅鞘细胞移植后通过分泌MMP-3在RCS-P~+大鼠视网膜中迁移

目的初步研究将嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)及嗅球成纤维细胞(olfactory nerve fibroblasts,ONF)混合细胞移植到皇家外科学院大鼠(Royal College of Surgeon rat,RCS-P+rat)的视网膜下腔后,OECs/ONF迁移进入视网膜的机制。方法离体实验中,取成年RCS-rdy+-P+大鼠的嗅球培养OECs/ONF至14 d行OECs/ONF的基质金属蛋白酶-3(matrix-metalloproteinase-3,MMP-3)细胞免疫荧光染色。收集5、8、11、14 d OECs/ONF培养液上清,与普通培养液超滤后进行酶联免疫吸附实验(ELISA),检测MMP-3的含量变化。在体实验中,制作40只RCS-P+大鼠单眼视网膜下腔细胞移植,并以对侧眼作为伪手术组以及相同天龄未处理大鼠作为对照组。术后7、14、21、28 d用ELISA法检测细胞移植组、伪手术组及未处理组大鼠视网膜中MMP-3含量的变化。将携带绿色荧光的慢病毒感染后的OECs/ONF移植到4只RCS-P+大鼠视网膜下腔,激光共聚焦显微镜观察移植后7、14、21 d及28 d OECs/ONF在视网膜中迁移情况。结果离体实验中,培养14 d时OECs/ONF的MMP-3免疫细胞化学染色阳性。OECs/ONF培养液上清MMP-3含量分别为5 d(2.83±0.80)、8 d(6.34±1.12)、11 d(11.65±1.35)、14 d(19.11±2.11),明显高于普通D/F12+10%FBS培养液(1.65±0.44)(P<0.01);在体实验中,移植后21 d及28 d,OECs/ONF移植组视网膜MMP-3的含量[(1.80±0.29)、(3.96±0.51)]明显高于伪手术组[(1.17±0.20)、(1.83±0.26)]和未处理组[(1.19±0.17)、(1.92±0.25)](P<0.01),伪手术组与未处理组之间无明显统计学差异(P>0.05)。激光共聚焦显微镜观察可见移植后7～28 d,OECs/ONF在视网膜中迁移,最远能够达到神经节细胞层。结论 OECs/ONF移植到RCS视网膜下腔后,可能通过分泌MMP-3在RCS-P+大鼠视网膜中迁移。     

In vitro evaluation of the compatibility of a novel collagen-heparan sulfate biological scaffold with olfactory ensheathing cells

Background Stroke and traumatic injury to the nerve system may trigger axonal destruction and the formation of scar tissue, cystic cavitations and physical gaps. Olfactory ensheathing cells （OECs） can secrete neurotrophic factors to promote neurite growth and thus act as a prime candidate for autologous transplantation. Biological scaffolds can provide a robust delivery vehicle to injured nerve tissue for neural cell transplantation strategies, owing to the porous three-dimensional structures （3D）. So transplantation of the purposeful cells seeded scaffolds may be a promising method for nerve tissue repair. This study aimed to evaluate the compatibility of a novel collagen-heparan sulfate biological scaffold with olfactory ensheathing cells in vitro. Methods Collagen-heparan sulfate （CHS） biological scaffolds were made, and then the scaffolds and OECs were co-cultured in vitro. The viability of OECs was tested by 3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyl tetrazolium （MTT） assay at days 1, 3, 5 and 7. Statistical analysis was evaluated by student＇s ttest. Significance was accepted at P 〈0.05. OECs were labeled with carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester （CFSE）, and the CFSE-labeled OECs were seeded into CHS scaffolds. The attachment and growth of OECs in CHS scaffolds were observed and traced directly by fluorescent microscopy and environmental scanning electron microscope （ESEM）. Results CHS biological scaffolds had steady porous 3D structures and no cytotoxicity to OECs （F=-0.14, P=-0.9330）. CHS biological scaffolds were good bridging materials for OECs attachment and proliferation, and they promoted the axonal growth. Conclusion The compatibility of CHS biological scaffolds with OECs is pretty good and CHS biological scaffold is a promising cell carrier for the implantation of OECs in nerve tissue bioengineering.     

搭载紫杉醇脂质体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物静电纺丝膜对神经干细胞增殖分化的影响

目的：探讨搭载不同浓度紫杉醇脂质体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）静电纺丝膜对神经干细胞（NSCs）增殖和分化的影响，评价载有紫杉醇脂质体的PLGA静电纺丝膜在脊髓损伤组织工程修复中应用的可行性。方法：将紫杉醇脂质体和PLGA以不同比例混合，利用静电纺丝技术分别构建1、5和10 μg·L^-1紫杉醇脂质体PLGA静电纺丝膜。从胎鼠大脑组织中分离纯化NSCs。扫描电镜（SEM）检测各组紫杉醇脂质体PLGA静电纺丝膜纤维直径，免疫荧光染色鉴定分离纯化所得的NSCs。将NSCs分别培养在含有不同浓度（0、1、5和10 μg·L^-1）紫杉醇脂质体PLGA静电纺丝膜的培养基中（作为纯PLGA静电纺丝膜组和1、5及10 μg·L^-1紫杉醇脂质体PLGA静电纺丝膜组），MTT法检测各组NSCs增殖活性，RT-PCR法检测各组NSCs中Tuj-1和GFAP mRNA表达水平。结果：紫杉醇脂质体PLGA静电纺丝膜呈白色薄膜状。SEM检测，各组紫杉醇脂质体PLGA静电纺丝膜纤维直径比较差异无统计学意义（P>0.05）。免疫荧光染色，从胎鼠脑组织中分离出的细胞呈球状，所有细胞均有Nestin蛋白阳性表达。MTT法检测，5 μg·L^-1紫杉醇脂质体PLGA静电纺丝膜组NSCs增殖活性高于其他3组（P<0.05）。RT-PCR检测，与纯PLGA静电纺丝膜组比较，5 μg·L^-1紫杉醇脂质体PLGA静电纺丝膜组NSCs中Tuj-1 mRNA表达水平升高（P<0.05），GFAP mRNA表达水平降低（P<0.05）。结论：中等浓度紫杉醇能够促进NSCs增殖，诱导NSCs向神经元分化。载有中等浓度紫杉醇脂质体的PLGA静电纺丝膜在脊髓损伤修复中有一定的应用价值。     

嗅鞘细胞和骨髓基质细胞的联合培养研究

目的探讨体外联合培养嗅鞘细胞(OECs)和骨髓基质细胞(BMSCs)的可行性及形态学观察。方法将原代培养的OECs和BMSCs消化制成细胞悬液,以相同比例接种,接种密度为104/ml。10 d后将联合培养的细胞置于倒置相差显微镜下进行形态学观察,并于鉴定前2 d加入细胞掺入剂BrdU,应用P75抗体和BrdU抗体对联合培养的细胞进行免疫荧光鉴定。结果联合培养的细胞在24 h内均完全贴壁,培养5 d后镜下可见细胞形态主要有3种:①双极、三极或多极形;②短梭形,突起较短;③扁圆形或不规则形。到第10天时部分细胞相互编织成网,部分细胞生长呈条索状,相互平行。荧光鉴定显示:荧光双标阳性者(既发红色荧光又发绿色荧光)为OECs,只发红色荧光而不发绿色荧光者为BMSCs。结论OECs与BMSCs在体外可以很好的联合培养,生物学特性均保持不变,为体内联合移植奠定了基础。     

Tissue reaction to poly (lactic-co-glycolic acid) copolymer membrane in rhBMP used rabbit experimental mandibular reconstruction

A rabbit experimental mandibular defect was reconstructed with 1% atelocollagen gel including rhBMP-2 10microg and a covering a poly (lactic-co-glycolic acid) copolymer (PLGA) membrane. For this experiment, eight male rabbits were used and a histological study was conducted. Our study purpose was to examine the effects and fate of PLGA membrane during bone reconstruction. PLGA membrane was phagocytized by foreign body giant cells and macrophages in the healing course of reconstruction osteogenesis. These histological data suggest that the PLGA membrane was gradually absorbed and replaced by fibrous connective tissue or bone tissue. In the osteogenesis course, the outer periphery of the new bone was maintained by PLGA membrane without expansion.     

嗅神经鞘细胞移植治疗实验性脊髓损伤的研究

目的:观察移植体外培养的嗅神经鞘细胞(OEC)对大鼠脊髓左半侧横断伤的治疗作用。方法:将应用改良Nash法培养的OECs移植到成年大鼠T10脊髓左半侧横断处,8周后分别采用改良Tarlov法运动学功能评分、辣根过氧化物酶(HRP)顺行示踪、透射电镜观察、P75免疫组织化学染色及HE染色等方法,观察动物的运动功能、脊髓再生的轴突和髓鞘、OEC的存活和脊髓损伤程度。结果:8周时治疗组运动学功能评分高于对照组(P<0.05);治疗组再生轴突穿越损伤区,对照组则无再生轴突穿越;超微结构显示治疗组轴突数量多于对照组,且髓鞘的完整性强于对照组,OEC表现为星形胶质细胞样和雪旺氏细胞样两种,包绕轴突髓鞘;免疫组化染色显示移植后8周OECs仍然存活,在损伤区均匀、散在分布;损伤后8周脊髓损伤区有胶质瘢痕及空洞形成。结论:移植的嗅神经鞘细胞可促进大鼠运动功能的恢复、脊髓轴突的再生和髓鞘的重塑。