Effect of shRNA interference targeting myeloid leukemia-1 gene on proliferation in lymphoma cell line

目的 研究慢病毒介导的髓细胞白血病基因(Mcl-1)短发夹状RNA(shRNA)干扰对淋巴瘤细胞系SNK-6增殖和凋亡的影响.方法 设计以Mcl-1为靶点的shRNA并构建携带此shRNA的慢病毒载体,转染淋巴瘤细胞系SNK-6,荧光定量PCR(qPCR)及Western blot方法检测病毒感染前后Mcl-1 mRNA及蛋白表达变化,四甲基偶氮唑盐法(MTT法)和流式细胞仪分析细胞增殖和凋亡变化的情况.结果 成功构建Mcl-1-shRNA慢病毒表达载体,并可有效感染淋巴瘤细胞株SNK-6,感染后SNK-6细胞Mel-1基因的mRNA水平及蛋白水平表达明显下调,MTT法检测显示慢病毒介导的Mcl-1基因shRNA干扰与对照病毒组相比可明显抑制SNK-6细胞增殖[(31.6±3.3)％vs(5.8±2.7)％,P＜0.01],流式细胞仪测定感染后细胞凋亡明显高于对照病毒组[(28.9±2.1)％vs(5.3±1.5)％,P＜0.01].结论 慢病毒介导的Mcl-1基因shRNA干扰技术可特异性阻断SNK-6细胞Mel-1基因的表达,抑制细胞的增殖并促进细胞的凋亡.     

SPAG6基因RNAi慢病毒载体的构建及其对SKM-1细胞凋亡的影响

目的 构建SPAG6-shRNA慢病毒载体靶向沉默SPAG6基因,探讨SPAG6基因沉默对人骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)细胞株SKM-1细胞增殖及凋亡的影响.方法 设计并构建3条针对SPAG6基因的shRNA质粒表达载体,共转染293T细胞后得到可表达SPAG6基因RNAi的慢病毒载体.转染SKM-1细胞,利用流式细胞术检测转染效率,qRT-PCR及Western blot验证SPAG6基因干扰效果,筛选最佳靶点.CCK-8法检测SPAG6基因沉默对SKM-1细胞生长的影响,流式细胞术检测细胞凋亡.结果 成功构建SPAG6-shRNA慢病毒载体,流式细胞术检测转染效率均在60％以上.qRT-PCR及Western blot检测结果显示SPAG6-shRNA3慢病毒载体敲除效率最高,为最佳靶点.SPAG6基因干扰后,干扰组SKM-1细胞的增殖明显受抑,抑制率为(60.18 ±0.37)％,与阴性对照组相比差别有统计学意义(P＜0.05).干扰组SKM-1细胞凋亡率为(16.32±5.80)％,显著高于阴性对照组[(4.28±0.88)％,P =0.024]及空白对照组[(3.08±1.50)％,P=0.019].结论 SPAG6-shRNA慢病毒载体能有效降低SPAG6基因表达水平,抑制SKM-1细胞增殖并促进其凋亡.     

MRPS23 shRNA对乳腺癌细胞Walker256增殖凋亡的作用及机制

目的:探讨线粒体核糖体蛋白MRPS23 shRNA对大鼠乳腺癌细胞Walker256增殖和凋亡的作用及机制。方法:构建含有MRPS23基因沉默片段(sh MRPS23)和对照shRNA的慢病毒载体(sh Ctrl),感染Walker256细胞48 h,以确定转染效率和基因沉默效率。MTS、TUNEL法检测其对Walker256细胞的增殖凋亡率的影响;RTPCR、western blot法检测细胞增殖和凋亡相关基因与蛋白表达水平。结果:与control组以及对照病毒组相比,sh MRPS23能显著抑制MRPS23基因及蛋白的表达,MRPS23基因沉默后能抑制Walker256细胞增殖,并促进细胞凋亡;p21WAF1、p53表达增高(P<0.05)。结论:慢病毒介导的MRPS23 shRNA可以通过上调p21WAF1抑制Walker256细胞增殖,MRPS23 RNAi可诱导细胞p53依赖性的凋亡。     

Survivin基因沉默对脑胶质瘤C6细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨Survivin基因沉默对脑胶质瘤细胞株C6体外细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法设计并合成针对Survivin基因的siRNA,构建Survivin-shRNA和阴性对照shcontrol慢病毒表达载体并感染脑胶质瘤C6细胞,用Western Blot法检测感染后C6细胞Survivin蛋白表达的抑制率,MTT法观察感染后24、48和72 h细胞增殖的变化,流式细胞术检测感染后48 h细胞凋亡和细胞周期的改变。结果 Survivin shRNA慢病毒载体感染C6细胞后Survivin蛋白的抑制率约为80%,阻滞C6细胞由G1期进入S期,抑制细胞的生长,增加了细胞的凋亡。结论 Survivin shRNA慢病毒表达质粒特异高效地抑胶质瘤C6细胞Survivin基因的表达,阻断C6细胞的细胞周期,抑制其增殖并促进凋亡。     

靶向Mcl-1的shRNA重组质粒的构建及其对HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的 设计以髓细胞白血病基因-1(Mcl-1)为靶点的短发夹状RNA(shRNA).构建携带此shRNA的重组质粒,探讨脂质体转染该重组质粒对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响.方法 设计3对针对Mcl-1基因不同位点的shRNA片段的真核表达载体psiRNA-hHlneo-Mcl,用阳离子脂质体法将重组质粒转染至人肝癌细胞株HepG2中,通过RT-PeR及Western blot方法检测转染前后Mcl-1 mRNA及蛋白表达情况,筛选能高效抑制Mcl-1基因表达的shRNA重组质粒并应用MTT和流式细胞仪分析转染后细胞增殖和凋亡变化的情况.结果 成功构建含shRNA片段的重组质粒,依次命名为pMclsi-1、pMclsi-2、pMclsi-3.经测序证实.插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致.重组质粒转染HepG2细胞后,Mcl-1基因的mRNA水平及蛋白水平明显下调,其中以pMclsi-1重组质粒下调效应最强.MTT检测显示pMclsi-1可明显抑制HepG2细胞增殖,流式细胞仪测定转染后24 h细胞凋亡率为6.5%,48 h细胞凋亡率为15.6%,显著高于对照组(3.9%,P<0.05).结论 采用RNAi技术可特异阻断Mcl-1基因的表达,Mcl-1基因有促进细胞增生及抑制凋亡的作用.     

RNA干扰沉默EZH2基因对人膀胱癌EJ细胞增殖的影响

目的:研究RNA干扰沉默EZH2基因对人膀胱癌EJ细胞周期和增殖的影响.方法:体外构建EZH2基因的shRNA的表达载体,Lipofectamin 2000介导转染膀胱癌EJ细胞,采用RT-PCR和Western Blot方法检测特异性shRNA对EZH2基因沉默效果,转染后采用MTT法检测shRNA对细胞增殖的作用;应用PI单染流式细胞术分析对细胞周期的改变.结果:EZH2基因的shRNA表达载体有效下调EZH2基因的表达(P<0.05).与对照组比较,细胞增殖明显抑制(P<0.05);同时引起细胞G1期阻滞,RNA干扰后,G1期细胞增加[(84.0±8.7)% vs (52.0±6.8)%, P<0.05],S期细胞减少[(11.0±1.1)% vs (43.0±4.9)%, P<0.05].结论:EZH2基因有望成为应用RNAi技术探索膀胱癌基因治疗的潜在靶基因.     

慢病毒介导shRNA沉默YAP基因对人前列腺癌LNCaP细胞增殖、凋亡及其雄激素受体的影响

目的:探讨慢病毒介导sh RNA沉默Yes-相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)基因对人激素依赖性前列腺癌细胞株LNCa P细胞增殖、凋亡及其雄激素受体(androgen receptor,AR)的影响。方法:3条针对YAP基因的sh RNA慢病毒干扰载体感染LNCa P细胞,经嘌呤霉素筛选后建立稳定感染细胞系,real-time PCR、Western blot分别检测感染后各组细胞YAP、AR m RNA和蛋白水平;选取沉默效果最佳sh RNA慢病毒干扰载体组,以细胞增殖/毒性检测(cell counting kit-8,CCK-8)、平板克隆形成实验(colony formation)检测LNCa P细胞增殖能力;流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测LNCa P细胞凋亡改变。结果:重组慢病毒成功感染前列腺癌LNCa P细胞,经嘌呤霉素筛选后感染效率达95%以上,获得稳定沉默YAP基因LNCa P细胞系。与空白对照组和阴性对照组比较,感染sh RNA慢病毒干扰载体各组中YAP、AR m RNA及蛋白表达水平明显下调(P=0.000),细胞增殖受到明显抑制(P=0.000),细胞凋亡明显增加(P=0.000)。结论:慢病毒介导sh RNA沉默YAP基因能有效下调YAP在LNCa P细胞中表达,并抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡;YAP可能作为AR配体参与AR信号通路的调节。     

集落刺激因子1在子宫内膜癌细胞中的表达及其意义

目的 探讨集落刺激因子1(CSF1)在子宫内膜癌细胞系中的表达,为靶向治疗子宫内膜癌提供新的治疗思路。方法 采用实时荧光定量聚合酶链式反应法、免疫印迹方法检测CSF1在子宫内膜癌Ishikawa细胞系中的表达情况以高表达CSF1的Ishikawa细胞作为研究对象,利用特异性靶向CSF1基因的shRNA慢病毒敲除系统包装病毒,并感染Ishikawa细胞,使用流式细胞分选技术获得CSF1稳定敲除细胞株,并分别在mRNA、蛋白水平检测shRNA敲除效率,同时监测CSF1敲除后不同时间点细胞增殖及凋亡水平。结果 CSF1在子宫内膜癌Ishikawa细胞中高表达利用shRNA慢病毒敲除系统,抑制CSF1在Ishikawa细胞中的表达可通过上调凋亡促进因子BAX,导致细胞增殖明显减缓,并诱导细胞凋亡(均P <0.05)。结论 CSF1在子宫内膜癌细胞系中高表达,抑制CSF1的表达可引起细胞大量凋亡,揭示CSF1可能对子宫内膜癌发生及发展具有正向调控作用。     

慢病毒介导HIF-1α沉默对缺氧肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响

目的:构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的HIF-1α基因沉默对体外模拟缺氧条件下的肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。方法:设计合成1条针对HIF-1α基因的shRNA干扰序列,构建于慢病毒载体质粒GV248中,转染293T细胞包装产生慢病毒,转染人肝癌细胞株HepG2细胞,嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。将HepG2细胞分为正常对照组、干扰对照组(转染NC-shRNA)、干扰组(转染HIF-1α-shRNA),应用化学缺氧法(150μmol/L CoCl2)模拟肿瘤细胞缺氧微环境,应用Western Blot检测HepG2细胞中HIF-1α蛋白表达证实基因沉默效果,CCK-8检测沉默HIF-1α基因对HepG2细胞增殖的影响,Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测沉默HIF-1α基因对细胞凋亡的影响。Western Blot检测HepG2细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和细胞质细胞色素C(Cyt-C)表达的变化。结果:①成功构建HIF1α-shRNA慢病毒载体并转染HepG2细胞,缺氧培养细胞24h后,与正常对照组及干扰对照组相比,干扰组细胞内HIF-1α蛋白表达明显降低(P<0.01),证实慢病毒载体能够有效沉默HIF-1α基因。②沉默HIF-1α基因后缺氧培养的HepG2细胞增殖率下降(P<0.05),而细胞凋亡比例升高(P<0.01)。③Western Blot结果显示,与正常对照组及干扰对照组相比,沉默HIF-1α基因后细胞内凋亡相关蛋白Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和细胞质Cyt-C表达上调(P<0.05或P<0.01),而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.01),Bax/Bcl-2蛋白表达比例升高。结论:通过shRNA慢病毒载体途径可有效沉默缺氧HepG2肝癌细胞HIF-1α基因,HIF-1α沉默能显著抑制缺氧HepG2细胞增殖活性,促进细胞凋亡,其凋亡途径可能与激活内源性线粒体凋亡通路有关。     

Id2 shRNA慢病毒载体的构建及其转染后对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的构建能高效敲减分化抑制因子2(Id2)基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)慢病毒载体,并观察敲减Id2对胶质瘤细胞株U251增殖和凋亡的影响。方法设计并合成特异性针对Id2基因的shRNA序列,将其构建到慢病毒载体pGCSIL-GFP中。以含有Id2基因的质粒为模板,扩增Id2基因cDNA序列的特异性片段,插入真核表达载体pEGFP-N1-3FLAG。构建含Id2基因质粒和不同靶点的RNAi慢病毒载体,共转染入工具细胞293T,筛选出适合浓度慢病毒感染U251细胞株。MTT法检测敲减Id2后胶质瘤细胞增殖的改变,RT-PCR检测Id2敲减后U251细胞caspase 3的表达。结果构建后载体的PCR鉴定及DNA测序结果与预期一致。与对照组相比,转染Id2 shRNA的U251细胞增殖降低,凋亡率升高,caspase3表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建的针对Id2基因的RNA干扰慢病毒载体体外转染可抑制胶质瘤细胞增殖并促进其凋亡。     

短发夹状干扰RNA沉默信号传导和转录激活子3基因表达对大肠癌细胞的影响

目的构建携带信号传导和转录激活子3（STAT3）基因短发夹状干扰RNA（shRNA）的真核表达载体,观察干扰STAT3表达对大肠癌细胞HT-29细胞增殖的影响。方法从GenBank STAT3mRNA上寻找到3条符合特征的靶序列,合成靶序列的DNA寡核苷酸链,合成双链DNA,并和BamHⅠ和HindⅢ酶切后的pRNAT-U6.1/Neo载体质粒连接产生重组质粒,行PCR和测序鉴定。重组质粒瞬时转染大肠癌HT-29细胞,实时定量PCR、Western blot检测STAT3的表达。筛选出最佳重组质粒,转染大肠癌细胞后,MTT检测细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果成功构建了携带有STAT3基因的shRNA的重组质粒,PCR和测序证实重组质粒构建正确。3种重组质粒对大肠癌HT-29细胞STAT3的表达有明显的抑制作用。筛选出的最佳重组质粒转染大肠癌细胞后,细胞增殖能力明显减弱;细胞周期分析显示,G0/G1期细胞占（74.80±1.85）%,S期细胞占（15.72±2.26）%,与对照组差异显著（P〈0.01）。结论干扰STAT3基因的表达可以有效抑制大肠癌HT-29细胞的生长。     

shRNA抑制survivin基因表达对脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡的影响

目的：研究靶向存活素（survivin）的短发夹 RNA真核表达质粒（shRNA）对脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡的影响。方法合成靶向survivin的shRNA真核表达质粒及阴性对照质粒,用脂质体法将质粒转染至经 VEGF（50 ng／mL）处理的HUVEC细胞;转染48 h后,采用实时定量聚合酶链反应（PCR）和蛋白印迹法检测 HUVEC中survivin的mRNA表达及蛋白水平。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖;TUNEL 法检测细胞凋亡。结果（1）survivin‐shRNA 质粒试验组与阴性对照shRNA质粒组及空白对照组比较,转染48 h后人脐静脉血管内皮细胞survivin的mRNA及蛋白表达水平明显下降（P＜0．05）。（2）与阴性对照shRNA组及空白对照组比较,转染后的人脐静脉血管内皮细胞增殖能力明显下降。转染后24、48、72 h生长抑制率分别为（13．53±3．91）％、（38．97±1．82）％、（65．75±1．83）％,于转染后72 h最为显著。（3）试验组凋亡率为（28．07±1．71）％,较阴性对照组（11．45±1．52）％和空白对照组（10．04±1．46）％显著增高（P＜0．05）。结论靶向survivin的shRNA质粒能通过下调survivin表达,进而抑制人脐静脉血管内皮细胞增殖并促进其凋亡。     

慢病毒介导的 RNA 干扰沉默 MLF1IP 基在胆管癌 RBE 细胞中的表达

目的：应用慢病毒介导的 RNA 干扰技术沉默胆管癌 RBE 细胞中人髓细胞白血病因子1相互作用蛋白（MLF1IP）基因的表达，探讨其对胆管癌细胞体外增殖的影响。方法：设计合成针对 MLF1IP 靶基因序列的 siRNA序列，进行重组慢病毒包装。与不含有 MLF1IP 基因 siRNA 序列的慢病毒分别转染胆管癌 RBE 细胞株。Real-time PCR 检测 MLF1IP 基因的 mRNA 表达，MTT 法检测细胞的增殖能力。结果：成功构建了 MLF1IP-shRNA 慢病毒质粒并进行慢病毒包装，Real-time PCR 显示实验组 MLF1IP 基因的 mRNA 相对表达量为0.15±0.02明显高于对照组为1.01±0.12。MTT 法检测实验组细胞的 OD 值对比对照组显著降低。结论：慢病毒介导的 RNA 干扰技术能有效沉默 RBE 细胞中 MLF1IP 基因的表达，并能明显抑制胆管癌细胞 RBE 的体外增殖能力。     

PAX2特异性siRNA在诱导HEC-1A细胞增殖及凋亡中的作用

目的研究靶向全长配对盒基因-2(PAX2)siRNA在诱导子宫内膜癌细胞增殖、凋亡中的作用。方法慢病毒载体介导针对PAX2基因的siRNA转染HEC-1A细胞,Western blot、激光共聚焦显微镜、Annexin-V/PI双标法及四甲基偶氮唑蓝(MTT)分别检测PAX2蛋白表达、细胞凋亡形态学改变、凋亡率及细胞增殖变化。结果 PAX2-siRNA转染后,HEC-1A细胞的PAX2蛋白表达明显降低(P<0.05);细胞早期凋亡率显著增加(22.07±2.17)%,与空载体转染组(1.12±0.37)%及未转染组(0.89±0.52)%比较,差异均具有统计学意义(均P<0.01);细胞生长速率显著减慢,细胞经Hoechst 33258荧光染色,见转染后细胞的胞核呈浓集固缩改变,而空载体转染组和未转染组细胞的胞核无凋亡形态学改变。结论 PAX2特异性siRNA能明显抑制PAX2蛋白在子宫内膜癌HEC-1A细胞中的表达,抑制细胞增殖并诱导HEC-1A细胞凋亡。     

沉默乙酰肝素酶基因对人卵巢癌SKOV3细胞增殖、侵袭能力的影响

目的观察沉默乙酰肝素酶(heparanase,HPA)基因对人卵巢癌SKOV3细胞的增殖及侵袭能力的影响。方法构建针对HPA基因的shRNA慢病毒载体,感染人卵巢癌SKOV3细胞。实验设计分为未转染组、实验转染组(选择3个靶点设计HPA-shRNA-1、HPA-shRNA-2、HPA-shRNA-3序列)、空白转染组;转染后,采用荧光定量PCR、Western blot方法检测HPA在基因水平和转录后蛋白水平的沉默效率;使用流式细胞仪检测细胞周期变化,CCK-8法检测细胞增殖情况,基质凝胶侵袭实验检测细胞侵袭能力变化。结果①构建的shRNA慢病毒载体感染卵巢癌SKOV3细胞后,见HPA-shR-NA-1和HPA-shRNA-2序列的HPA基因和蛋白水平均显著下降(P<0.05),而HPA-shRNA-3序列在其表达上无降低,为无效转染序列;②实验转染组中有效转染序列HPA-shRNA-1、HPA-shRNA-2组中均见细胞G1期比例增加[分别为(69.69±3.87)%、(66.29±4.06)%],细胞增殖受到抑制[分别为(1.77±0.13)、(1.74±0.27)],穿膜细胞数显著减少[分别为(22.40±5.02)、(23.42±5.72)],与未转染组及空白转染组之间相比有明显差异(P<0.05)。结论干扰HPA基因后,对卵巢癌细胞的增殖及侵袭能力有明显的抑制作用,其作用机制与HPA的基因和蛋白表达下调有关。     

shRNA 介导GSTP1 基因沉默对激素非依赖性前列腺癌细胞株DU145 的影响

目的:探讨谷胱甘肽巯基转移酶P1 (glutathione S-transferase P1,GSTP1) 基因沉默对雄激素非依赖性前列腺癌细胞株DU145 增殖活性和对化学治疗药物敏感性的影响。方法:根据选取靶序列形成短发卡状RNA(short hairpinRNA, shRNA) 的DNA 模板设计3 条表达载体(shRNA255, shRNA554, shRNA593),并克隆到质粒pGPU6/GFP/Neo。经酶切和测序鉴定,筛选转染率最高基因沉默效果最好的shRNA 作RNA 干扰。DU145 细胞株分为空白质粒转染组和shRNA 转染组。转染前后按化学治疗药物分为氟尿嘧啶(fluorouracil,FU) 组及紫杉醇(paclitaxel,PA) 组,并按作用浓度(FU:30,60,120,240 μg/mL;PA:0.2,2,10,20 μg/mL) 分别分成4 个亚组,并分别设有一个空白对照组。四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT] 比色法检测转染后细胞增殖活性的变化,MTT 及末端脱氧核苷酸转移酶介导脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记法(terminal de-oxynucleotidyl transferasemediateddUTP nick end labeling,TUNEL) 检测转染前后不同浓度FU 和PA 对DU145 细胞抑制增殖及诱导凋亡的效果。结果:3 条表达载体(pGPU6/GFP/Neo-shRNA255, pGPU6/GFP/Neo-shRNA554, pGPU6/GFP/Neo-shRNA593) 的转染率分别为(63.3±1.04)%,(76.2±0.68)%,(72.7±0.33)%,shRNA554 转染率最高,三者之间比较差异有统计学意义(P<0.01)。转染后mRNA 含量分别为128.31±2.50,43.24±4.30 和85.62±6.30,GSTP1 蛋白含量分别为163.92±12.40,65.38±9.30和114.25±16.70,shRNA554 转染后GSTP1 基因mRNA 和蛋白含量均最低,三者比较差异有统计学意义(P<0.01)。MTT 检测转染前FU 不同浓度 (30, 60, 120, 240 μg/mL) 四个亚组作用后细胞存活率分别为(95.60±2.11)%,(90.20±0.86)%,(83.10±3.12)% 和(74.60±1.32)%;转染后存活率为(91.30±1.43)%,(84.6±2.13)%,(73.2±1.52)% 和(65.5±0.94)%。TUNEL 检测转染前FU 不同浓度(30, 60, 120, 240 μg/mL) 四个亚组作用后细胞凋亡率分别为(5.50±0.88)%,(10.20±1.64)%,(15.20±2.39)% 和(25.10±2.59)%;转染后凋亡率(10.80±0.62)%,(15.70±1.32)%,(20.40±1.89)% 和(34.90±2.54)%。转染后相同FU 浓度下细胞存活率降低,凋亡率增加,差异均具有统计学意义(P<0.01)。MTT 检测转染前PA 不同浓度(0.2, 2, 10, 20 μg/mL) 四个亚组作用后细胞存活率为(98.50±2.34)%,(95.20±1.32)%,(89.40±0.68)%和(82.70±1.73)%;转染后存活率为(94.2±0.78)%,(86.5±2.13)%,(78.7±1.34)% 和(70.1±0.76)%。TUNEL 检测转染前PA 不同浓度 (0.2, 2, 10, 20 μg/mL) 四个亚组作用后细胞凋亡率分别为(2.4±1.07)%,(5.2±1.33)%,(10.5±2.41)%和(20.7±1.92)%;转染后凋亡率(5.46±2.13)%,(13.8±1.24)%,(21.2±2.39)% 和(29.2±2.21)%。转染后相同PA浓度下细胞存活率降低,凋亡率增加,差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论:shRNA 介导的GSTP1 基因沉默可抑制雄激素非依赖型前列腺癌DUl45 细胞增殖活性,诱导凋亡,并且其作用呈现时间依赖性,可提高其对于化学治疗的药物敏感性。     

RNA干扰抑制p62基因表达对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

目的:研究shRNA降低p62基因表达对人宫颈腺癌HeLa细胞增殖的影响。方法:构建具有沉默p62表达的慢病毒载体短发夹RNA（shRNA）序列,采用Polybrene将其转染入宫颈腺癌HeLa细胞中（shRNA组）,设立shNC作为阴性对照组,另设未加慢病毒转染载体的空白对照组。采用实时荧光定量qRT-PCR技术检测各组相对空白对照组的p62基因相对表达量;采用CCK-8实验检测3组细胞的增殖情况,采用集落克隆形成实验检测3组细胞的克隆形成率。结果:沉默p62基因表达的宫颈癌HeLa细胞成功构建;shRNA组p62mRNA相对空白对照组的相对表达量为（0.18±0.08）,而shNC组的p62mRNA相对空白对照组的相对表达量为（1.01±0.12）（t=9.97,P<0.01）;shRNA的干扰效率为81.00%;shRNA组较阴性对照组和空白对照组细胞增殖速度变慢（P<0.05）,克隆形成率减少（P<0.01）。结论:p62基因沉默后,宫颈癌HeLa细胞的增殖速度变慢。p62基因在宫颈癌HeLa细胞的增殖中起着重要的作用。     

单个shRNA质粒同时抑制LNCaP细胞人端粒酶催化亚单位和雄激素受体的表达

目的 探讨单个shRNA质粒联合抑制LNCaP细胞人端粒酶催化亚单位(hTERT)和雄激素受体(AR)基因表达的可行性.方法 使用RNAi-DNA载体技术,将hTERT和AR siRNA的DNA模板同时插入到载体Pgenesil,构建成重组质粒Pgenesil-hTERT-AR-shRNA,转染至LNCaP细胞,与空白对照、Pgenesil-HK-shRNA(通用阴性质粒)、Pgenesil-hTERT-shRNA和Pgenesil-AR-shRNA比较,利用实时荧光定量PCR技术观察其对LNCaP细胞hTERT和AR基因mRNA表达的影响.采用Annexin V方法检测细胞凋亡,MTF比色分析法测定细胞增殖活性.结果 空白对照组、Pgenesil-HK-shRNA组、Pgenesil-hTERT-shRNA组、Pgenesil-AR-shRNA组和Pgenesil-hTERT-AR-shRNA组细胞的hTERT基因mRNA分别为(1.51±0.08)×108、(7.32±0.43)×107、(2.94±0.15)×106、(4.45±0.25)×107、(3.17±0.18)×106 (copies/ml),各组AR基因mRNA分别为(1.92±0.11)×105、(6.47±0.32)×105、(3.70±0.24)×104、(1.22±0.06)×104、(7.21±0.41)×103 (copies/ml),提示Pgenesil-hTERT-shRNA对hTERT基因mRNA有抑制作用,Pgenesil-AR-shRNA对AR基因mRNA有抑制作用,Pgenesil-hTERT-AR-shRNA对hTERT和AR基因mRNA都有抑制作用(P＜0.05).Pgenesil-hTERT-AR.shRNA与Pgenesil-hTERT-shRNA、Pgenesil-AR-shRNA比较,引起的细胞凋亡、细胞生长抑制更加明显(P＜0.05).结论 含有hTERT-shRNA和AR-shRNA DNA模板的重组表达质粒Pgenesil-hTERT-AR-shRNA能够明显抑制hTERT和AR基因的表达和前列腺癌细胞的生长.     

CTGF特异性siRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建CTGF特异性siRNA慢病毒表达载体并观察其介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对人肝癌细胞CTGF(connective tissue growth factor,CTGF)表达的影响?方法:针对已经筛选确定的人CTGF基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与Plk0.1-GFP-SP6载体连接产生shRNA 慢病毒载体,经PCR筛选阳性克隆进行DNA测序鉴定?用脂质体转染法将质粒共转染293T 细胞,将包装产生的慢病毒颗粒感染HepG2细胞,Real-time PCR?Western-blot检测CTGF mRNA和蛋白的表达?结果:PCR与DNA测序证实合成的含CTGF shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确?经RNA干扰后的靶细胞CTGF mRNA以及蛋白表达水平明显降低?结论:成功构建人CTGF基因RNA干扰慢病毒载体,体外感染HepG2细胞可有效降低CTGF mRNA和蛋白的表达,为以CTGF基因为靶点的肝癌基因治疗研究奠定了基础?