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相似文献
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1.
目的:探讨临床分离铜绿假单胞菌mucA基因突变情况及其与菌落形态、藻酸盐合成之间关系。方法:对58株临床分离铜绿假单胞菌(50株黏液型菌株和8株非黏液型菌株)mucA基因进行PCR-SSCP及DNA序列分析,与GenBank中野生型铜绿假单胞菌PAO1标准序列进行比对,并用比色法测定58株细菌藻酸盐浓度。结果:细菌mucA基因突变总发生率为100%,能够影响氨基酸编码的有意义突变在非黏液型菌株中未能检获,在黏液型菌株中为32%(16/50);共发现14个突变位点,其中导致氨基酸编码发生改变的位点有5个,其余为沉默突变;黏液型菌株藻酸盐含量较非黏液型细菌显著增加(P<0.01),发生了有意义的mucA基因突变的菌株,藻酸盐合成较发生无意义突变的菌株显著增加(P<0.01)。结论:mucA突变与临床分离铜绿假单胞菌菌落形态以及藻酸盐合成能力有关。  相似文献   

2.
Ni M  Tian DY  Yu B  Pi B  Zhu XH  Zhang DS 《中华医学杂志》2004,84(19):1649-1653
目的研究黏液型铜绿假单胞菌PA17中的mucA基因序列及其生物膜形成、生长速度和耐药性,并与铜绿假单胞菌标准菌株PAOI进行比较。方法采用聚合酶链反应(PCR)方法分别扩增PA17与非黏液型铜绿假单胞菌标准菌株PAOI的mucA基因,全自动荧光测序仪测序。同时用改良的平板培养法分别建立PA17和PAOI的生物膜模型,于8h、24h、3d,6d用扫描电镜检测生物膜形成情况。稀释平板计数法比较PA17和PAOI的生长曲线,国际标准琼脂平皿二倍稀释法检测常用抗生素对上述两菌株的体外抗菌活性。结果PA17mucA基因第166~333位核苷酸缺失;其生物膜形成速度及生长速度明显慢于PAOI;PA17与PAOI对常用抗生素的耐药性一致。结论发现一株含新的mucA突变基因的黏液型铜绿假单胞菌,其生物学特性不同于以往报道的黏液型铜绿假单胞菌,可能与mucA基因新的突变有关。  相似文献   

3.
目的 探讨阿奇霉素对铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵的影响,为指导临床合理选择抗生素提供依据.方法 排泵抑制剂(苯丙氨酸精氨酸β-萘酰胺PAβN)干预铜绿假单胞菌后,采用微量肉汤稀释法测定常见药物的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)值的变化,筛选主动外排表型阳性菌株.PCR扩增主动外排表型阳性菌株oprM、mexB和mexR;real-time PCR检测主动外排表型阳性菌株mexB的mRNA水平;对主动外排表型阳性菌株进行mexR基因测序分析.在阿奇霉素作用下,观察铜绿假单胞菌的mexB基因表达及对头孢他啶、左氧氟沙星、环丙沙星和美罗培南的MIC值变化.结果 从20个临床多重耐药的铜绿假单胞菌菌株中筛选出8株主动外排表型阳性菌.检测表明这8株菌oprM、mexB和mexR均呈阳性,mexB的mRNA水平均较PAO1显著增高.对8株MexABOprM高表达菌mexR基因进行测序,发现菌株PAO03的mexR基因存在突变.阿奇霉素可显著降低mexR基因未突变MexAB-OprM高表达菌株的mexB基因的表达和对头孢他啶、左氧氟沙星、环丙沙星和美罗培南的MIC值,而对菌株PAO03和nalB突变株(mexR基因突变MexAB- OprM高表达菌株)无显著影响.结论 阿奇霉素可抑制铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵的表达,提高铜绿假单胞菌对抗生素的敏感性.  相似文献   

4.
目的 研究mucA基因突变对铜绿假单胞菌黏液表型的影响.方法 收集临床分离的黏液型铜绿假单胞菌9株,对稳定黏液表型的铜绿假单胞菌采用聚合酶链反应方法对其mucA基因进行扩增,全自动荧光测序仪测序分析.结果 筛选出3株稳定的黏液表型的铜绿假单胞菌,编号分别为PA255、PA622和PA880.mucA基因序列分析中,3株均存在第342位(A→G)的无意义突变,PA255第426位G缺失导致第439位产生终止密码,还伴有393位(C→G)的无意义突变,PA880还存在第465位(T→G)的点突变,PA622未发现其它位置的突变.结论 mucA基因突变是造成铜绿假单胞菌产生黏液表型的原因之一,同时也存在其它的遗传因素使其产生黏液表型.  相似文献   

5.
目的 比较3株铜绿假单胞菌即含新的mucA基因突变的黏液型PA17、mucA基因经典突变的黏液型PD0300、含野生型mucA基因的非黏液型PA01生物被膜早期形成和成熟形态,探讨铜绿假单胞菌纤毛介导的蹭行运动和胞外基质藻酸盐在黏液型及非黏液型铜绿假单胞菌生物被膜形成中的作用.方法 用PAl7、PAO1、PD0300的单菌落穿刺接种1%琼脂糖平板,肉眼观察细菌纤毛介导的蹭行运动,测定细菌运动环评估3株细菌的蹭行运动能力;在生物被膜形成早期采用结晶紫对膜内黏附细菌染色,测定其吸光度(A)值,建立24 h内3株细菌的黏附曲线;建立未饱和铜绿假单胞菌生物被膜模型,检测早期和成熟期的胞外藻酸盐分泌;将含绿色荧光蛋白的pUCP/UV质粒转化3株铜绿假单胞菌,在激光共聚焦显微镜下观察静态生物被膜不同时期的形态和结构.结果 黏液型PA17、非黏液型PAO1菌株蹭行运动的直径小于黏液型PDO300(P<0.05),PA17、PAO1的运动能力弱于PDO300菌株;黏液型PDO300在早期生物被膜形成中黏附能力最强,非黏液型PAO1次之,黏液型PA17最弱;在未饱和生物被膜早期和成熟期黏液型菌株PA17、PDO300藻酸盐合成均明显高于非黏液型菌株PAO1(P<0.05),而PA17和PDO300在生物被膜相同时期的藻酸盐合成无明显差异(P>0.05);激光共聚焦显微镜下PA17菌株在生物被膜形成中,不可逆黏附形成明显迟于非黏液型PAO1和黏液型PDO300,PA17成熟生物被膜形态呈薄膜状,与非黏液型PAO1成熟生物被膜类似;而PDO300不可逆黏附形成早,成熟生物被膜形态呈蘑菇状.结论 纤毛介导的蹭行运动是早期生物被膜形成中黏附的重要方式,可能影响成熟生物被膜的形态;而藻酸盐不是早期黏附的主要决定因素,与成熟生物被膜形态无关.  相似文献   

6.
目的构建铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprH,研究其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法以铜绿假单胞菌PAO1标准株双链DNA为模板,通过PCR扩增OprH基因。经酶切后与载体pGEX-1λT进行连接,构建重组质粒pGEX-OprH,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果 PCR扩增出660 bp的OprH编码基因;重组质粒经双酶切和PCR证实OprH基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE电泳发现表达产物相对分子质量约为47 000 Mr,与前期预测结果一致,大肠埃希菌BL21(DE3)表达蛋白为菌体量的22%;免疫印渍表明Pa抗原免疫的小鼠血清能特异识别47 000 Mr重组蛋白。结论铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprH在E.coli BL21(DE3)中高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性。  相似文献   

7.
卢培林  刘利  熊霞 《重庆医学》2018,(13):1763-1766
目的 构建铜绿假单胞菌PA14细胞株的PA0745基因突变株,并验证其致病性.方法 采用同源重组原理构建铜绿假单胞菌PA0745基因缺失株和点突变株.利用质粒抗性和营养缺陷进行筛选,获得铜绿假单胞菌突变株E126A、E146A和△PA0745.分析突变PA0745基因后,PA14细胞株生长特性及致病性变化.结果 成功构建PA14细胞株的PA0745基因突变株E126A、E146A和APA0745.生长曲线测定结果表明,PA0745基因突变后,不影响PA14细胞株正常生长.细胞侵染实验结果显示,相较于PA14细胞株,E126A、E146A和△PA0745对RAW264.7侵染能力分别下降了29.51%、60.66%和79.34%.结论 本研究成功构建了PA14细胞株的PA0745基因突变株,并初步验证了PA0745基因的功能,这对开发抗菌药物有指导意义.  相似文献   

8.
目的 观察pvdQ(PA2385)基因对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响.方法 构建pvdQ基因表达质粒pME6032-pvdQ,鉴定后,采用电穿孔法将其转入PAO1野生株中,构建pvdQ高表达株.同时将空质粒pME6032采用电穿孔法转入PAO1野生株中,构建pME6032空质粒株,采用Real-time PCR检测各株...  相似文献   

9.
目的构建黏液型铜绿假单胞菌64(PA-64)株2815基因敲除株PA-64/ΔPA2815,建立有效的PA2815基因敲除平台。方法利用自杀质粒p CVD442及基因同源重组技术敲除PA-64株PA2815基因,并采用PCR及测序检测方法筛选获得PA2815基因被Gm抗性基因取代的克隆,命名为PA-64/ΔPA2815。比较敲除株与野生株之间的生长特性、抗生素的敏感性、藻酸盐以及绿脓菌素分泌的差异。结果 PA-64/ΔPA2815菌株与野生株的PA2815基因两侧同源臂片段PCR产物相比缺少1 480 bp,成功构建了黏液型铜绿假单胞菌PA2815基因敲除株。体外实验证实敲除株相比野生株生长速度略慢,藻酸盐分泌显著降低,差异有统计学意义(P0.05),而绿脓菌素分泌显著升高(P0.05),但在抗生素的敏感性方面差异无统计学意义(P0.05)。结论利用同源重组原理成功构建黏液型铜绿假单胞菌PA2815基因敲除平台;PA2815基因不影响黏液型铜绿假单胞菌对抗生素的敏感性,但可以正向调控其藻酸盐的分泌和菌落生长状态,负向调控绿脓菌素的分泌。  相似文献   

10.
铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因的扩增与克隆   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的PCR扩增及克隆铜绿假单胞菌的弹性蛋白酶基因.方法从铜绿假单胞菌培养物中提取染色体DNA,PCR扩增弹性蛋白酶基因成熟蛋白编码区,A-T克隆于pMD 18-T载体中,对重组质粒进行酶切与测序鉴定.结果从高GC含量的铜绿假单胞菌染色体DNA中扩增到弹性蛋白酶基因并进行了克隆与鉴定.结论本研究成功克隆到铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,为实现活性弹性蛋白酶的高效表达奠定了基础.  相似文献   

11.
肽核酸体外抑制铜绿假单胞菌PAO1生物膜形成的研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的研究肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用,探讨其潜在的抗铜绿假单胞菌生物膜形成的应用价值。方法采用计算机软件设计和斑点杂交联合筛选出能与铜绿假单胞菌PAO1早期生物膜形成关键基因motA mRNA结合紧密的反义寡核苷酸序列,根据其序列合成肽核酸(PNA)并连接穿膜肽(cell pene-trating peptide,CCPs)(KFF)3K形成CCPs-PNA,分别采用不同浓度的CCPs、PNA和CCPs-PNA处理铜绿假单胞菌PAO1,定量测定并用显微镜观察其对生物膜形成的抑制作用。结果 PNA和CCPs-PNA对铜绿假单胞菌PAO1生物膜的早期形成都有抑制作用,并且随着浓度的增加,其抑制作用也增加,但CCPs-PNA对生物膜形成的抑制明显优于PNA组。1、5、10μmol/L的(KFF)3K-PNA对PAO1生物膜形成的抑制率分别约为30%、50%、70%。而1μmol/L的PNA对PAO1生物膜形成基本没有影响,5、10μmol/L的PNA对PAO1生物膜形成的抑制率却分别为3%和10%左右。各个浓度的CCPs对细菌生物膜的形成都没有影响。与对照组相比,CCPs-PNA处理之后的PAO1,其运动能力明显下降,PAO1处理组与对照组在运动培养基上的扩散直径之比约为3∶5。结论针对motA基因的PNA通过抑制PAO1的运动能力、降低吸附,从而对铜绿假单胞菌PA01起始阶段的生物膜形成产生抑制作用,穿膜肽(KFF)3K大大增强了此作用。推测铜绿假单胞菌的motA基因或其编码产物可能是一个良好的抗铜绿假单胞菌生物膜形成的靶点。  相似文献   

12.
目的研究铜绿假单胞菌rhlR表达产物的分子生物学特性,以及对小鼠的免疫保护作用。方法以铜绿假单胞菌标准株PAO1的基因组DNA为模板,PCR方法扩增rhlR基因。利用pGEX4T-1载体构建rhlR-pGEX4T-1重组质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并用免疫印迹验证。同时用纯化的重组蛋白免疫小鼠,菌落计数法检测免疫组和对照组鼠肺对铜绿假单胞菌的清除率。结果rhlR的全基因序列为726bp,经序列分析和同源性比较,与GenBank中的rhlR基因(登录号:AE004768)完全一致。大肠杆菌BL21(DE3)转化重组质粒rhlR-pGEX4T-1后,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,表达的融合蛋白质相对分子质量为54×103,其中RhlR蛋白为27×103。体内实验中,免疫小鼠肺部对铜绿假单胞菌的清除率与未经免疫的正常组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论构建的rhlR-pGEX4T-1重组质粒能够在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达出具有生物学活性的RhlR蛋白。重组蛋白对小鼠表现出一定的保护作用。  相似文献   

13.
目的:研究低浓度乙醇对铜绿假单胞菌磷脂酶C基因(PLCH)表达的影响。方法:观察不同浓度乙醇对铜绿假单胞菌生长曲线影响,荧光定量实时PCR检测不同乙醇浓度培养的铜绿假单胞菌PA01的PLCH表达量变化。、结果:工程株PA01在0.1%、0.5%、1%乙醇浓度下,其生长曲线与对照基本一致,在孵育18h都达到最高生长密度;在2%~5%的乙醇浓度下,细菌生长极其缓慢,6%以上的乙醇浓度下几乎不生长..与对照相比,在0.1%、0.5%和1%乙醇诱导下.PLCH的表达量的分别比对照组上升了44倍、30倍和8倍.在2%乙醇浓度下,PLCH表达量略为下降。结论:低浓度乙醇有助于铜绿假单胞菌相关毒力因子表达上调,增加生存力.在感控消毒中,保持足够的酒精浓度对清除铜绿假单胞菌至关重要。  相似文献   

14.
目的 建立两种铜绿假单孢菌慢性大鼠肺部感染模型,并根据细菌学和病理学指标对其进行评价.方法 (1)随机将健康清洁级Sprague-Dawley大鼠300只分为3组:野生型铜绿假单孢菌感染组(PAO1组),变异型铜绿假单孢菌感染组(PAO-JP2组)和对照组.(2)应用锐孔喷射装置,将两株铜绿假单孢菌的藻酸盐混悬液制成两种铜绿假单孢菌藻酸盐包裹体凝胶小珠,通过气管插管法将其接种至大鼠肺部,以无菌生理盐水-藻酸盐包裹体接种组作为空白对照组.在接种后3、7、14、28 d,取每组大鼠肺分别进行肺组织匀浆菌落计数和病理学检查.结果 (1)细菌学指标:感染后3、7、14、28 d,对照组肺组织均未培养出细菌,PAO1组和PAO-JP2组肺组织均分别培养出野生型和变异型铜绿假单孢菌,感染后3、7 d,PAO1组和PAO-JP2组大鼠肺组织匀浆菌落计数均>105 CFU/g(对数值:3 d:PAO1组19±6,PAO-JP2组17±7;7 d:PAO1组13±4,PAO-JP2组:12±4),感染后14、28 d,上述两组大鼠肺组织菌落计数均>103 CFU/g,PAO1组明显高于PAO-JP2组(P<0.05)(对数值:14 d:PAO1组11.3±2.8,PAO-JP2组9.6±3.3;28 d:PAO1组9.1±1.5,PAO-JP2组4.2±3.0).(2)病理学指标:接种后3、7 d,感染动物肺组织均有不同程度的脓肿、实变、水肿、出血表现,镜下可见中性粒细胞聚集在藻酸盐包被体周围,形成脓肿.接种后14、28 d,实变逐渐减少,以局部肺不张、纤维增生、肉芽肿形成为主要表现,而以PAO1组表现得更为明显.结论 使用锐孔喷射装置,制成两种铜绿假单孢菌藻酸盐包裹体凝胶小珠并接种至大鼠肺部,可以成功地建立两种细菌的慢性大鼠肺部感染模型,方法较简便可行.  相似文献   

15.
目的拟研究长链高丝氨酸内酯降解基因pvdQ在铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌形态抑制作用中的功能。方法通过乙酸锂转化法构建CAI-4HWP1-LacZ菌株,使用X-gal平板显色法检测3-oxo-C12-HSL对白假丝酵母菌形态转换的影响;观察与铜绿假单胞菌pvdQ高表达株、野生株PAO1共同培养时,白假丝酵母菌的形态变化,了解pvdQ基因在铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌形态抑制作用中的功能。结果 400μg 3-oxo-C12-HSL即可完全抑制白假丝酵母菌的形态转换。铜绿假单胞菌pvdQ高表达株和野生株PAO1均可抑制白假丝酵母菌菌丝形成。pvdQ高表达株对白假丝酵母菌的形态抑制作用较野生株PAO1减弱。结论铜绿假单胞菌通过分泌信号分子3-oxo-C12-HSL,可抑制白假丝酵母菌形态转换。随着pvdQ表达增加,铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌的形态抑制作用减弱,即pvdQ基因在铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌形态抑制作用中起负性调节作用。其作用机制可能与pvdQ基因对3-oxo-C12-HSL的水解作用有关。  相似文献   

16.
目的研究lasI rhlI基因缺陷对铜绿假单胞菌体外生物膜形成的影响;观察铜绿假单胞菌PAO1野生型及其群体感应系统的lasI rhlI基因缺陷型菌株人工生物膜致病性的差异,了解群感应系统的lasI rhlI基因在铜绿假单胞菌生物膜感染致病过程中的作用。方法采用生理盐水-吸痰管系统进行铜绿假单胞菌体外生物膜的培养,3d后用扫描电子显微镜观察PAO1、PAO1 lasI rhlI形成生物膜的情况。从大鼠支气管内直接予以PA(菌种为铜绿假单胞菌PAO1野生型,PAO1 lasI rhlI基因缺陷型)海藻酸盐微菌粒悬液(1×109CFU/mL)攻击,建立PAO1野生型及QS系统的lasI rhlI基因缺陷型菌株人工生物膜肺部感染动物模型。于感染2周后评估各组大鼠的肺部病理学、细菌学的变化。结果3d后PAO1野生型的生物膜较厚,lasI rhlI基因缺陷型菌株所形成的生物膜结构呈薄膜状,明显薄于PAO1野生型。感染2周后,PAO1野生型组的病理学改变和细菌学改变均显著重于lasI rhlI基因缺陷组(P<0.001)。结论QS系统的lasI和rhlI基因影响铜绿假单胞菌体外形成生物膜的能力,并且在PA肺部感染过程中发挥着重要作用。  相似文献   

17.
目的 利用pgenesil-1质粒载体,以bcl-2为靶基因,设计构建重组体,以用于后继的RNA干扰研究.方法 设计3对有小发夹结构的两条DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体pgenesil-1上构建重组体,转化DH5a菌株,提取质粒行酶切电泳鉴定后,进行测序分析.结果 将合成的DNA片段退火后克隆至载体上,经酶切及序列鉴定为目的 序列.结论 靶向bcl-2基因转录shRNA的重组质粒可以在体外成功构建,为下一步利用该重组体干扰肿瘤细胞中bcl-2的mRNA转录,探索肿瘤基因治疗的新途径打下基础.  相似文献   

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